PCR的引物分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)，它能夠在體外環(huán)境中，短時(shí)間內(nèi)復(fù)制大量的目的基因。該技術(shù)是基因工程常用的技術(shù)之一，也是實(shí)驗(yàn)室中獲取目的基因的主要方法。PCR在近幾年高考中多有考察，主要以非選擇題形式出現(xiàn)，難度較大，學(xué)生不易得分。上圖為PCR反應(yīng)示意圖。PCR中，引物必不可少。本文將從引物的作用、設(shè)計(jì)和修飾三個(gè)方面為切入點(diǎn)，結(jié)合相關(guān)例題讓學(xué)生更加深刻地理解PCR。1、引物的作用。PCR必須加入引物，這是由DNA聚合酶的特點(diǎn)決定的。與體內(nèi)DNA復(fù)制一樣，DNA聚合酶不能直接催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，只能把脫氧核苷酸添加到一段脫氧核苷酸鏈的3'端。在PCR中，直接加入一對單鏈DNA作為引物，這樣可以避免像體內(nèi)DNA復(fù)制那樣，復(fù)制完畢后因切除RNA引物而造成子鏈DNA長度變短的情況。所以引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸；體外是DNA，體內(nèi)是RNA。引物的作用是把脫氧核苷酸添加到一段脫氧核苷酸鏈的3'端。PCR的引物必須是成對（兩種）的，如果只加一種引物，經(jīng)過n輪循環(huán)，只能產(chǎn)生n條新的單鏈DNA，無法實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA的指數(shù)形式擴(kuò)增。由于一對引物分別特異性結(jié)合在模板鏈上的目的基因兩側(cè)，引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)決定了特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的起點(diǎn)和終點(diǎn)。DNA聚合酶能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的的DNA序列。經(jīng)過多輪擴(kuò)增后，非目標(biāo)片段可以忽略不計(jì)。因此PCR的產(chǎn)物主要是目的基因，即實(shí)現(xiàn)了特異性擴(kuò)增。有些題目比較直白，直接考察引物的作用。例1、請回答基因工程方面的有關(guān)問題;PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________答案：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。解析：直接考察引物的由來，是由于DNA聚合酶的特點(diǎn)才有引物。例2、PCR需要兩種引物，但是引物序列不同是由于______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________答案：DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。解析：理解引物成對存在的原因。例3、如圖為X蛋白的部分基因序列，所示序列為引物結(jié)合的部分，據(jù)圖分析：擴(kuò)增X蛋白基因所需的引物序列是________________________________________；________________________________。答案：5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′解析：注意方向。引物的方向即延伸的方向5'→3'，基因序列中，磷酸基團(tuán)為5'，OH為3'。兩條互補(bǔ)鏈反向平行。例4、(2020·山東，25節(jié)選)通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案：引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)解析：理解只有設(shè)計(jì)出特定的引物才能擴(kuò)增出特定的DNA序列。例5、對人干擾素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)需要一對引物，應(yīng)從下圖中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取__________（填字母）作為引物。答案：BC解析：根據(jù)模板鏈方向確定引物方向，模板鏈與引物反向平行。例6、(2020·北京·高考真題)為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）①+③ B．①+② C．③+② D．③+④答案：B解析：若選③④，則會有內(nèi)源基因干擾。再考慮方向，只能選擇①②，實(shí)際①④也可。引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)PCR所用引物時(shí)，需注意引物不能與模板的其他區(qū)域結(jié)合，從而保證擴(kuò)增的特異性，還要避免引物內(nèi)部或者兩條引物之間互補(bǔ)配對。復(fù)性時(shí)，為何兩條模板鏈能與引物結(jié)合而不是模板鏈之間結(jié)合呢？這是因?yàn)?，引物一般只?0~30個(gè)核苷酸，復(fù)性溫度就是根據(jù)引物序列專門設(shè)定的，而且引物的濃度遠(yuǎn)大于模板的濃度，所以當(dāng)溫度下降到復(fù)性溫度時(shí)，引物會更快地特異性結(jié)合在模板上。PCR的復(fù)性溫度受引物中G、C堿基含量的影響。溫度過高，不利于引物與模板結(jié)合；溫度過低，引物可能會與模板發(fā)生非特異性結(jié)合。例1、請回答基因工程方面的有關(guān)問題∶設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的2組引物如圖，都不合理，請分別說明理由。①第1組：____________________________________________________________________;②第2組：____________________________________________________________________。答案：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對而失效引物Ⅰ自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效解析：要熟悉引物的設(shè)計(jì)原則。例2、(2021.湖北)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除了目的基因條帶(引物與模板完全配對)外,還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（）A.增加模板DNA的量 B.延長熱變性的時(shí)間C.延長延伸的時(shí)間 D.提高復(fù)性的溫度答案：D解析：提高復(fù)性溫度，使非特異性結(jié)合的片段從模板鏈脫離，從而減少非特異性條帶的產(chǎn)生。例3、若對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或多個(gè)條帶，從引物角度分析，原因可能是__________________________________________答案：引物過短導(dǎo)致引物的特異性下降解析：引物一般是20~30個(gè)核苷酸。引物太短造成特異性差，會出現(xiàn)雜鏈；引物太長會增加合成成本，另外過長的引物會使復(fù)性溫度提高，甚至?xí)^Taq酶的最適溫度，從而影響擴(kuò)增效率。引物的修飾引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。特別是在基因工程中，為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體的連接，在片段的5’端添加限制酶的識別序列的方式經(jīng)?？疾?。通常，兩種引物上設(shè)計(jì)不同的酶切位點(diǎn)，以確保目的基因與載體的正向連接。例1、引物用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的()答案：D解析：DNA聚合酶能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的的DNA序列。引物中的X經(jīng)過擴(kuò)增最終成為目標(biāo)序列的一部分。例2、木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的可再生資源，中國科學(xué)家利用基因工程的方法構(gòu)建了一株嗜熱厭氧桿菌H，以花生殼、玉米芯等為原料發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料乙醇，以期提高農(nóng)業(yè)廢棄物的整體利用價(jià)值。請回答下列問題：(2)基于嗜熱厭氧桿菌的特殊代謝能力（圖a），研究人員構(gòu)建了雙功能醇醛脫氫酶基因（Adh）的過量表達(dá)載體，圖b為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。①為保證雙功能醇醛脫氫酶基因（Adh）能通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒，需設(shè)計(jì)引物1和引物2，其中引物1的序列