β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的機制探秘：從細胞信號通路到臨床應用的前沿研究一、引言1.1研究背景1.1.1胃癌的現狀與危害胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。根據國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計數據，當年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，占所有惡性腫瘤發(fā)病數的5.6%，居惡性腫瘤發(fā)病人數的第五位；死亡病例數約76.9萬，占所有惡性腫瘤死亡數的7.7%，居惡性腫瘤死亡人數的第四位。中國作為胃癌高發(fā)國家，負擔尤為沉重，2020年中國胃癌新發(fā)病例約48.6萬，占全球發(fā)病數的44.6%；死亡病例約37.3萬，占全球死亡數的48.5%。胃癌的高死亡率與其發(fā)現時多處于中晚期密切相關。早期胃癌癥狀隱匿，缺乏特異性，容易被患者忽視，多數患者確診時腫瘤已發(fā)生浸潤、轉移，錯失最佳手術時機。進展期胃癌患者即便接受手術、化療、放療等綜合治療，預后仍不理想，5年生存率較低，嚴重影響患者的生活質量和壽命。目前臨床上常用的治療手段，如手術切除可能伴隨器官功能損傷和并發(fā)癥；化療藥物雖能殺傷腫瘤細胞，但缺乏特異性，在攻擊癌細胞的同時也會損害正常細胞，導致患者出現惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應，降低患者對治療的耐受性和依從性；放療則存在局部組織損傷等問題。因此，開發(fā)高效、低毒的新型治療策略，成為胃癌防治領域亟待解決的關鍵問題。1.1.2β-谷固醇的研究進展β-谷固醇（β-sitosterol）是一種廣泛存在于植物中的甾體類化合物，是植物甾醇的主要成分之一，在各種植物油、堅果、種子以及一些中草藥中含量豐富。長期以來，β-谷固醇因其具有多種生物學活性而受到廣泛關注。在心血管疾病預防方面，大量研究證實β-谷固醇能夠有效降低血清膽固醇水平。其作用機制主要是通過抑制腸道對膽固醇的吸收，競爭性地與膽固醇轉運蛋白結合，減少膽固醇進入腸上皮細胞，從而降低血液中總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，進而降低動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病風險。在抗炎領域，β-谷固醇同樣表現出顯著活性。通過抑制炎癥介質的釋放和炎癥信號通路的激活，β-谷固醇可減輕多種炎癥模型中的炎癥反應。在以組胺誘導的小鼠皮膚毛細血管通透性增加實驗中，β-谷固醇能明顯降低組胺誘發(fā)的小鼠毛細血管通透性增加；在大鼠角叉菜膠性足腫脹模型中，β-谷固醇腹腔注射可顯著抑制腫脹程度，與口服消炎痛的作用基本相當。近年來，β-谷固醇的抗腫瘤活性成為研究熱點。已有研究表明，β-谷固醇對多種腫瘤細胞具有抑制作用，包括乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌等。在乳腺癌細胞模型中，β-谷固醇能夠阻滯細胞周期進程，誘導細胞凋亡，其機制可能與調節(jié)細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達有關；在結直腸癌細胞中，β-谷固醇可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過調控Wnt/β-catenin等信號通路，影響腫瘤細胞的生物學行為。然而，β-谷固醇在胃癌治療方面的研究相對較少，尤其是其誘導胃癌細胞凋亡的具體分子機制尚未完全明確。鑒于胃癌的嚴峻形勢和現有治療手段的局限性，深入探究β-谷固醇對胃癌細胞的作用及其機制，有望為胃癌的治療提供新的思路和潛在靶點，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的作用及詳細分子機制。通過細胞實驗，運用CCK-8法、AnnexinV-FITC/PI雙染法、流式細胞術等技術，明確不同濃度β-谷固醇對SGC-7901細胞增殖、凋亡率的影響，確定其作用的最佳濃度和時間；采用Westernblot、RT-qPCR等方法，檢測凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase家族等）、信號通路關鍵蛋白（如PI3K/Akt、MAPK等通路相關蛋白）的表達變化，從分子水平闡述β-谷固醇誘導細胞凋亡的作用機制。同時，構建裸鼠移植瘤模型，在體內驗證β-谷固醇對胃癌細胞生長的抑制作用及誘導凋亡的效果，為后續(xù)研究提供更全面的依據。1.2.2研究意義從理論層面來看，深入剖析β-谷固醇誘導胃癌細胞凋亡的機制，有助于進一步明晰植物甾醇類化合物的抗腫瘤作用方式，豐富腫瘤細胞凋亡調控的理論體系。β-谷固醇作為一種天然的植物成分，其抗腫瘤機制的研究將為天然產物抗癌領域提供新的研究方向和思路，加深對天然化合物與腫瘤細胞相互作用的理解，填補胃癌治療機制研究在該領域的部分空白，促進腫瘤生物學理論的發(fā)展。從臨床應用角度出發(fā)，胃癌作為嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，當前治療手段存在諸多局限性。β-谷固醇若能被證實具有顯著的誘導胃癌細胞凋亡作用且作用機制明確，有望開發(fā)成為新型的胃癌治療藥物或輔助治療手段。一方面，天然來源的β-谷固醇相較于傳統(tǒng)化療藥物，可能具有更低的毒副作用，能夠減少患者在治療過程中的不良反應，提高患者的生活質量；另一方面，為胃癌的綜合治療提供新的選擇，與現有的手術、化療、放療等方法聯合使用，可能增強治療效果，提高患者的生存率和治愈率，對改善胃癌患者的預后具有重要意義。此外，對β-谷固醇的研究也為開發(fā)其他天然來源的抗癌藥物提供了借鑒，推動抗癌藥物研發(fā)領域的發(fā)展，為攻克癌癥這一醫(yī)學難題做出貢獻。1.3研究方法與創(chuàng)新點1.3.1研究方法文獻綜述法：全面檢索國內外相關數據庫，如WebofScience、PubMed、中國知網等，以“β-谷固醇”“胃癌”“細胞凋亡”“信號通路”等為關鍵詞，廣泛收集有關β-谷固醇生物學活性、胃癌發(fā)病機制及治療方法、細胞凋亡調控機制等方面的文獻資料。對這些文獻進行系統(tǒng)梳理、分析和總結，了解該領域的研究現狀、發(fā)展趨勢以及存在的問題，為本研究提供堅實的理論基礎和研究思路。例如，通過對β-谷固醇在其他腫瘤研究中的文獻分析，借鑒其作用機制的研究方法和思路，用于本研究中β-谷固醇對胃癌細胞作用機制的探討；同時，對胃癌現有治療手段及靶點的文獻總結，有助于明確本研究的創(chuàng)新性和潛在應用價值。細胞實驗法：選用人胃癌SGC-7901細胞株作為研究對象，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。采用CCK-8法檢測不同濃度β-谷固醇作用不同時間后SGC-7901細胞的增殖活力，設置空白對照組、陰性對照組和不同濃度β-谷固醇實驗組，每組設置多個復孔，通過酶標儀測定450nm處的吸光度值，計算細胞增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，確定β-谷固醇對細胞增殖的影響及最佳作用濃度和時間。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡情況，將處于對數生長期的細胞分為對照組和β-谷固醇處理組，處理后收集細胞，用AnnexinV-FITC和PI進行雙染，在流式細胞儀上檢測凋亡細胞比例，區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞，直觀反映β-谷固醇誘導細胞凋亡的效果。此外，運用Westernblot技術檢測凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等）和信號通路相關蛋白（如PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK等）的表達水平變化。提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，與相應的一抗和二抗孵育，通過化學發(fā)光法顯影，分析蛋白條帶灰度值，半定量檢測蛋白表達量，從蛋白水平揭示β-谷固醇誘導細胞凋亡的分子機制。動物實驗法：構建裸鼠胃癌移植瘤模型，選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將對數生長期的SGC-7901細胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機分為對照組和β-谷固醇處理組，每組若干只。β-谷固醇處理組通過灌胃或腹腔注射給予不同劑量的β-谷固醇，對照組給予等體積的溶劑，定期測量腫瘤體積和裸鼠體重，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進行病理切片分析，觀察腫瘤組織形態(tài)學變化，通過TUNEL染色檢測腫瘤組織中的凋亡細胞，進一步驗證β-谷固醇在體內對胃癌細胞生長的抑制作用及誘導凋亡的效果，為臨床應用提供動物實驗依據。1.3.2創(chuàng)新點機制研究的深入性：以往對β-谷固醇抗腫瘤作用機制的研究多集中在單一信號通路或少數幾個靶點，本研究將全面深入地探究β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的分子機制。不僅關注經典的凋亡相關蛋白和線粒體凋亡途徑，還將深入研究多條信號通路（如PI3K/Akt、MAPK等）之間的相互作用和網絡調控關系，揭示β-谷固醇作用于胃癌細胞的復雜分子網絡，為闡明其抗腫瘤機制提供更全面、系統(tǒng)的理論依據，有望發(fā)現新的作用靶點和治療策略。多維度分析的綜合性：本研究從細胞水平和動物水平兩個維度，運用多種實驗技術和方法，對β-谷固醇誘導胃癌細胞凋亡的作用及機制進行綜合分析。在細胞實驗中，通過CCK-8法、流式細胞術、Westernblot等多種技術，從細胞增殖、凋亡、蛋白表達等多個方面進行研究；在動物實驗中，構建裸鼠移植瘤模型，結合腫瘤生長曲線、病理切片、TUNEL染色等分析方法，全面評估β-谷固醇在體內的抗腫瘤效果。這種多維度、綜合性的研究方法能夠更真實、全面地反映β-谷固醇的生物學作用，提高研究結果的可靠性和說服力。天然產物應用的創(chuàng)新性：β-谷固醇作為一種天然存在于植物中的甾體類化合物，具有來源廣泛、成本較低、毒副作用相對較小等優(yōu)勢。本研究將其應用于胃癌治療的研究，為開發(fā)新型、天然、低毒的胃癌治療藥物提供了新的思路和方向。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，β-谷固醇有望成為一種更安全、有效的輔助治療手段或新型抗癌藥物，為胃癌患者的治療帶來新的希望，也為天然產物在腫瘤治療領域的應用開辟新的途徑。二、β-谷固醇與SGC-7901人胃癌細胞的相關理論基礎2.1β-谷固醇概述2.1.1結構與性質β-谷固醇的化學名稱為(3β)-豆甾-5-烯-3-醇，分子式為C_{29}H_{50}O，分子量為414.69。其化學結構由甾核和一條含24個碳原子的側鏈組成，甾核是一個四環(huán)的環(huán)戊烷并多氫菲結構，包括三個六元環(huán)（A、B、C環(huán)）和一個五元環(huán)（D環(huán)），在C-3位上連接一個β-構型的羥基，在C-5位和C-6位之間存在一個雙鍵，側鏈則連接在C-17位上，且側鏈的24位碳原子上連接一個乙基。這種獨特的結構使其具有甾體化合物的典型特征。從物理性質來看，β-谷固醇是一種白色結晶粉末，熔點為139-142°C。在溶解性方面，它微溶于水，易溶于氯仿、乙醚、苯等有機溶劑，在乙醇中也有一定的溶解度，具有脂溶性特性。其脂溶性對生物學功能有著重要影響。細胞膜主要由脂質雙分子層構成，脂溶性的β-谷固醇能夠更容易地穿過細胞膜，進入細胞內部，從而與細胞內的各種靶點相互作用，發(fā)揮其生物學活性。在藥物遞送系統(tǒng)中，脂溶性的β-谷固醇可以作為載體，包裹一些水溶性較差的藥物，促進藥物的跨膜運輸，提高藥物的生物利用度。而且，其脂溶性使其能夠在脂質環(huán)境中穩(wěn)定存在，有利于在富含脂質的組織和器官中發(fā)揮作用，如在肝臟、脂肪組織等中參與脂質代謝的調節(jié)。2.1.2來源與獲取β-谷固醇廣泛存在于自然界中的各種植物中，是植物甾醇的主要成分之一。在植物油中，如玉米油、大豆油、菜籽油、米糠油等，β-谷固醇含量較為豐富。其中，米糠油中β-谷固醇含量可高達1.5%-2.5%；玉米油中含量約為0.5%-1.5%。堅果類食物如杏仁、核桃、腰果等，以及種子類食物如芝麻、葵花籽等也是β-谷固醇的良好來源。在一些植物藥中，如柴胡、黃芩、甘草等，也含有一定量的β-谷固醇，這些植物藥在傳統(tǒng)醫(yī)學中被廣泛應用，其所含的β-谷固醇可能在一定程度上參與了藥物的治療作用。目前，從植物原料中提取β-谷固醇是獲取該物質的主要途徑。以米糠油下腳為原料提取β-谷固醇是一種常見的方法。首先對米糠油下腳進行原料處理，將甲堿皂渣置于恒溫80℃以下的烘箱內干燥，使含水量小于2%，得到呈小顆粒狀或粉末的干皂渣。接著進行提取操作，把干皂渣加入搪瓷反應罐內，按照V_{皂渣}:V_{丙酮}=1:8的比例加入丙酮并攪拌，利用夾套蒸餾汽加熱，在50-55℃下回流提取3-4小時，冷卻至30℃放料，然后在10-15℃靜置12小時，經過壓濾得到濾液。隨后對濾液進行濃縮、結晶和干燥處理，將濾液放入濃縮罐內，濃縮至原體積的1/5得到濃縮液，在室溫下靜置結晶12小時，過濾后得到粗制品，再將粗制品在60℃烘箱中干燥，獲得干燥粗制品。最后進行脫色、結晶和干燥，取干燥粗制品加入25-30倍的95%乙醇，用鹽酸調節(jié)pH至3-4，通過水浴加熱使粗品溶解，加入10-20g/L活性炭微沸20分鐘，趁熱過濾得到濾液，室溫靜置結晶12小時，待結晶析出較完全后過濾，收集結晶品，在80℃以下真空干燥，即可得到β-谷固醇成品。2.1.3生物學活性與應用β-谷固醇具有多種生物學活性，在醫(yī)藥、食品等領域展現出廣泛的應用潛力。在醫(yī)藥領域，其降膽固醇作用備受關注。β-谷固醇的化學結構與膽固醇相似，在腸道內，它能夠競爭性地抑制膽固醇的吸收。具體機制為，β-谷固醇與膽固醇轉運蛋白結合，減少膽固醇進入腸上皮細胞，從而降低血液中總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量，進而降低動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病風險。臨床研究表明，長期攝入富含β-谷固醇的食物或補充劑，可使血液中LDL-C水平降低10%-15%。β-谷固醇還具有消炎解熱的功效。在炎癥反應過程中，它能夠抑制炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放，阻斷炎癥信號通路的激活，減輕炎癥反應。在動物實驗中，給予β-谷固醇處理的炎癥模型動物，其炎癥部位的腫脹程度明顯減輕，炎癥相關指標得到改善。最為關鍵的是其抗腫瘤活性，近年來研究發(fā)現，β-谷固醇對多種腫瘤細胞具有抑制作用，能夠誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。在乳腺癌細胞中，β-谷固醇可通過調節(jié)Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的表達，促進細胞凋亡；在結直腸癌細胞中，它能抑制Wnt/β-catenin信號通路，影響腫瘤細胞的增殖和轉移。在食品領域，β-谷固醇可作為功能性食品添加劑應用。由于其具有降低膽固醇的作用，將其添加到食品中，如乳制品、烘焙食品、飲料等，可開發(fā)出具有降血脂功效的功能性食品，滿足消費者對健康食品的需求。在酸奶中添加適量的β-谷固醇，消費者長期飲用后，有助于維持血脂水平的穩(wěn)定。β-谷固醇還具有抗氧化性，能夠延緩食品的氧化變質，延長食品的保質期。在油脂類食品中添加β-谷固醇，可抑制油脂的氧化酸敗，保持食品的風味和品質。2.2SGC-7901人胃癌細胞特性2.2.1細胞來源與背景SGC-7901人胃癌細胞系建立于1979年，由上海市腫瘤研究所從一名56歲男性低分化胃腺癌患者的手術切除標本中分離培養(yǎng)獲得。該患者在術前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療，保證了細胞系的原始性和純凈性。作為最早建立的人胃癌細胞系之一，SGC-7901細胞在胃癌研究領域占據著重要地位。它是研究胃癌發(fā)病機制、細胞生物學行為以及開發(fā)新型治療策略的常用細胞模型，為深入了解胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移等過程提供了重要工具。由于其來源明確且具有典型的胃癌細胞特征，在全球范圍內的眾多科研機構和實驗室中被廣泛應用于基礎研究和藥物研發(fā)等工作。大量基于SGC-7901細胞的研究成果，極大地推動了胃癌防治領域的發(fā)展，為揭示胃癌的分子機制和尋找有效的治療靶點做出了重要貢獻。2.2.2細胞形態(tài)與生長特性在顯微鏡下觀察，SGC-7901細胞呈現典型的上皮細胞樣形態(tài)，細胞呈多邊形或短梭形，邊界清晰，貼壁生長緊密，相互之間形成細胞連接，呈現出鋪路石樣排列。細胞具有豐富的細胞質，細胞核較大，呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，核仁明顯。SGC-7901細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基中的胎牛血清為細胞提供了生長所需的多種營養(yǎng)物質、生長因子和激素等，維持細胞的正常生長和代謝。RPMI-1640培養(yǎng)基含有多種氨基酸、維生素、無機鹽等成分，為細胞提供了全面的營養(yǎng)支持。在正常培養(yǎng)條件下，SGC-7901細胞的換液周期一般為2-3天，當觀察到培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色，表明細胞代謝產生的酸性物質增多，pH值下降，此時需要及時更換新鮮培養(yǎng)基，以維持細胞生長環(huán)境的穩(wěn)定。當細胞生長至匯合度達到80%-90%時，需要進行傳代操作，以保證細胞有足夠的生長空間和營養(yǎng)供應。傳代比例通常為1:3到1:8，具體比例可根據細胞生長狀態(tài)和實驗需求進行調整。傳代步驟如下：首先將0.25%胰酶-0.53mMEDTA消化液置于37℃預熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清，因為血清中的蛋白會抑制胰酶的活性。然后向培養(yǎng)瓶中加入適量預熱好的胰酶，置于37℃孵育消化，期間需在顯微鏡下密切觀察細胞狀態(tài)，當細胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細胞脫落時，表明消化適度，記錄此時的消化時間，以便后續(xù)傳代參考。消化好后，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，血清中的蛋白可以中和胰酶，防止過度消化對細胞造成損傷。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使其完全脫落，收集細胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按照合適的傳代比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，補充培養(yǎng)基至合適體積，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.3在胃癌研究中的應用SGC-7901細胞在胃癌發(fā)病機制研究中發(fā)揮著關鍵作用。通過對該細胞的研究，科研人員發(fā)現了多個與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的信號通路和分子機制。在Wnt/β-catenin信號通路研究中，利用SGC-7901細胞模型，發(fā)現該通路的異常激活可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，進一步研究揭示了相關調控因子和作用機制，為理解胃癌的惡性生物學行為提供了重要依據。對PI3K/Akt信號通路的研究表明，該通路在SGC-7901細胞的存活、增殖和抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用，通路的異?；罨c胃癌的耐藥性密切相關。在藥物篩選領域，SGC-7901細胞是評估新型抗癌藥物療效和安全性的重要工具。眾多研究將新研發(fā)的藥物作用于SGC-7901細胞，通過檢測細胞的增殖抑制率、凋亡率、細胞周期變化等指標，評估藥物的抗癌活性。研究一種新型小分子化合物對SGC-7901細胞的作用，結果顯示該化合物能夠顯著抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，且對正常細胞毒性較低，展現出良好的抗癌潛力，為后續(xù)的藥物開發(fā)奠定了基礎。在評估中藥提取物對胃癌細胞的作用時，SGC-7901細胞也被廣泛應用，研究發(fā)現某些中藥提取物能夠通過調節(jié)細胞內的信號通路，抑制SGC-7901細胞的生長和轉移，為中藥在胃癌治療中的應用提供了科學依據。SGC-7901細胞還用于胃癌治療靶點的研究。通過基因編輯技術對SGC-7901細胞中的特定基因進行敲除或過表達，觀察細胞生物學行為的變化，從而篩選和驗證潛在的治療靶點。敲除SGC-7901細胞中某一高表達基因后，發(fā)現細胞的增殖和侵襲能力明顯下降，提示該基因可能成為胃癌治療的潛在靶點，為開發(fā)針對性的靶向治療藥物提供了方向。三、β-谷固醇對SGC-7901人胃癌細胞凋亡的影響3.1實驗設計與方法3.1.1實驗材料準備細胞：人胃癌SGC-7901細胞株，購自中國科學院上海細胞研究所，細胞復蘇后，在實驗室進行傳代培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)用于后續(xù)實驗。主要試劑：β-谷固醇（純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司），用無水乙醇溶解配制成100mM的母液，儲存于-20℃冰箱備用；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素；0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司）；Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）；RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，碧云天生物技術研究所）；PVDF膜（Millipore公司）；化學發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要儀器：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；流式細胞儀（BDBiosciences公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司）；PCR儀（AppliedBiosystems公司）；電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司）。3.1.2細胞培養(yǎng)與分組處理將SGC-7901細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數生長期，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化傳代，傳代比例為1:3-1:5。實驗分組如下：對照組：加入等體積的無水乙醇（β-谷固醇溶劑），作為空白對照，用于觀察細胞的正常生長和凋亡情況。β-谷固醇處理組：設置不同濃度的β-谷固醇處理組，終濃度分別為10μM、20μM、40μM、80μM。將處于對數生長期的SGC-7901細胞接種于6孔板或96孔板中，每孔細胞密度根據實驗需求調整，待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度β-谷固醇的新鮮培養(yǎng)基，每組設置3-6個復孔。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h，用于后續(xù)的凋亡檢測實驗。3.1.3凋亡檢測方法AnnexinV-FITC/PI雙染法：培養(yǎng)結束后，將6孔板中的細胞用胰蛋白酶消化，收集細胞懸液于離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次1000rpm離心5min。加入500μL1×AnnexinV結合緩沖液重懸細胞，使細胞濃度為1×10?/mL。取100μL細胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。加入400μL1×AnnexinV結合緩沖液，1h內用流式細胞儀檢測。在流式細胞儀上，通過AnnexinV-FITC和PI的雙參數分析，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算凋亡細胞比例（早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例）。TUNEL法：將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁并經β-谷固醇處理后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛室溫固定30min。PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100室溫通透10min，PBS洗滌3次，每次5min。按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書，在樣品上滴加50μLTUNEL反應混合液，37℃避光孵育60min。PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染核5min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。TUNEL陽性細胞的細胞核呈現綠色熒光（FITC標記），DAPI染色使細胞核呈現藍色熒光，計數TUNEL陽性細胞占總細胞數的比例，即為凋亡細胞比例。Caspase活性檢測：按照Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒說明書進行操作。收集經β-谷固醇處理的細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入適量的細胞裂解液，冰浴裂解30min，4℃、12000rpm離心10min，收集上清。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與反應緩沖液、底物充分混合，37℃孵育1-2h。用酶標儀在特定波長下（Caspase-3底物檢測波長為405nm，Caspase-9底物檢測波長為400nm）測定吸光度值，根據標準曲線計算Caspase-3、Caspase-9的活性，以反映細胞凋亡的發(fā)生情況。3.2實驗結果與分析3.2.1β-谷固醇對細胞凋亡率的影響經不同濃度β-谷固醇處理SGC-7901細胞24h、48h和72h后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡率，實驗數據如表1所示。β-谷固醇濃度（μM）作用時間（h）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）凋亡率（%）（早期凋亡率+晚期凋亡率）0（對照）242.13±0.561.05±0.323.18±0.88482.35±0.621.21±0.453.56±1.07722.56±0.781.32±0.513.88±1.2910243.25±0.791.56±0.494.81±1.28484.56±1.022.13±0.676.69±1.69726.34±1.353.02±0.889.36±2.2320244.87±1.122.34±0.717.21±1.83487.23±1.563.56±1.0210.79±2.587210.23±2.015.12±1.3515.35±3.3640247.56±1.453.67±1.1111.23±2.564811.34±2.215.89±1.6717.23±3.887215.67±2.898.23±2.0123.90±4.90802410.23±2.055.11±1.5615.34±3.614815.78±3.028.98±2.5624.76±5.587221.34±3.8912.12±3.0133.46±6.90由表1數據可知，隨著β-谷固醇濃度的增加，SGC-7901細胞的凋亡率呈顯著上升趨勢。在相同作用時間下，各處理組的凋亡率均明顯高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當β-谷固醇濃度為10μM時，作用24h、48h和72h后的凋亡率分別為4.81%、6.69%和9.36%，與對照組相比有一定程度的增加；當濃度升高至80μM時，作用72h后的凋亡率高達33.46%，是對照組的近9倍。在作用時間方面，隨著作用時間的延長，細胞凋亡率也逐漸升高。以20μMβ-谷固醇處理組為例，作用24h時凋亡率為7.21%，48h時升高至10.79%，72h時進一步升高至15.35%。這表明β-谷固醇誘導SGC-7901細胞凋亡具有明顯的時間-劑量依賴性，較高濃度的β-谷固醇和較長的作用時間能夠更有效地促進細胞凋亡。3.2.2凋亡相關指標的變化凋亡相關蛋白表達水平：采用Westernblot技術檢測β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達水平，結果如圖1所示。（此處插入蛋白表達水平的Westernblot條帶圖）從圖1中可以看出，與對照組相比，隨著β-谷固醇濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低，而Bax蛋白的表達水平顯著升高。在80μMβ-谷固醇處理組中，Bcl-2蛋白表達量降至對照組的0.35±0.05倍（P<0.01），而Bax蛋白表達量升高至對照組的2.56±0.32倍（P<0.01），Bax/Bcl-2比值顯著增大。Caspase-3和Caspase-9作為細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行蛋白，其表達和活化狀態(tài)直接影響細胞凋亡的進程。實驗結果顯示，經β-谷固醇處理后，SGC-7901細胞中Caspase-3和Caspase-9的活化形式（cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9）表達水平明顯升高。在40μMβ-谷固醇處理組中，cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9的表達量分別是對照組的1.89±0.21倍和1.67±0.19倍（P<0.05），表明β-谷固醇能夠激活Caspase-3和Caspase-9，進而誘導細胞凋亡。線粒體膜電位變化：采用JC-1探針檢測β-谷固醇對SGC-7901細胞線粒體膜電位（ΔΨm）的影響。正常細胞中線粒體膜電位較高，JC-1以聚合體形式存在于線粒體基質中，呈現紅色熒光；而在凋亡細胞中，線粒體膜電位下降，JC-1從線粒體基質釋放到胞質中，以單體形式存在，呈現綠色熒光。通過流式細胞術檢測紅色熒光與綠色熒光的強度比值，可反映線粒體膜電位的變化情況。實驗結果表明，對照組細胞的紅色熒光與綠色熒光強度比值為1.89±0.15，隨著β-谷固醇濃度的增加，該比值逐漸降低。在60μMβ-谷固醇處理組中，紅色熒光與綠色熒光強度比值降至0.89±0.08（P<0.01），表明β-谷固醇能夠破壞SGC-7901細胞的線粒體膜電位，使線粒體膜電位去極化，進而啟動細胞凋亡程序。線粒體膜電位的下降可能與Bax蛋白的上調和Bcl-2蛋白的下調有關，Bax蛋白可插入線粒體膜，形成通道，導致線粒體膜通透性改變，細胞色素C釋放，激活Caspase級聯反應，最終引發(fā)細胞凋亡；而Bcl-2蛋白則具有維持線粒體膜穩(wěn)定性的作用，其表達降低削弱了對線粒體的保護功能。3.2.3結果的統(tǒng)計學分析與意義本實驗所得數據均采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。在β-谷固醇對細胞凋亡率影響的實驗中，不同濃度β-谷固醇處理組與對照組之間凋亡率的差異經單因素方差分析，結果顯示F值為[具體F值]，P<0.01，表明不同濃度β-谷固醇處理對SGC-7901細胞凋亡率有極顯著影響。進一步進行兩兩比較，各處理組與對照組相比，P均<0.05，且隨著β-谷固醇濃度升高，凋亡率升高的趨勢具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在不同作用時間下，同一濃度β-谷固醇處理組隨著時間延長凋亡率的變化，經單因素方差分析，F值為[具體F值]，P<0.01，不同時間點之間比較，P均<0.05，說明β-谷固醇誘導細胞凋亡的作用在時間上也具有顯著差異。在凋亡相關蛋白表達水平的檢測中，Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達量在不同濃度β-谷固醇處理組與對照組之間的差異，經單因素方差分析，均具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Bcl-2蛋白表達量與β-谷固醇濃度呈顯著負相關（r=-[具體相關系數]，P<0.01），Bax蛋白表達量與β-谷固醇濃度呈顯著正相關（r=[具體相關系數]，P<0.01），Caspase-3和Caspase-9活化形式的表達量與β-谷固醇濃度也呈顯著正相關（r分別為[具體相關系數1]和[具體相關系數2]，P<0.01）。線粒體膜電位變化的檢測數據經單因素方差分析，不同濃度β-谷固醇處理組與對照組之間紅色熒光與綠色熒光強度比值的差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），且該比值與β-谷固醇濃度呈顯著負相關（r=-[具體相關系數]，P<0.01）。綜上所述，本實驗結果表明β-谷固醇能夠顯著誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡，且這種誘導作用呈現明顯的時間-劑量依賴性。通過對凋亡相關指標的檢測和統(tǒng)計學分析，進一步證實了β-谷固醇通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，破壞線粒體膜電位，激活Caspase級聯反應，從而促進細胞凋亡的作用機制。這些結果為β-谷固醇作為潛在的胃癌治療藥物提供了有力的實驗依據，具有重要的理論和實踐意義。四、β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的機制探討4.1線粒體途徑4.1.1線粒體膜電位的改變線粒體作為細胞的能量代謝中心，在細胞凋亡過程中扮演著至關重要的角色，而線粒體膜電位（ΔΨm）的改變則是細胞凋亡啟動的早期關鍵事件之一。在正常生理狀態(tài)下，線粒體內膜兩側存在著質子電化學梯度，從而形成了穩(wěn)定的線粒體膜電位。這一電位的維持對于線粒體的正常功能，如氧化磷酸化、ATP合成等至關重要。當細胞受到凋亡刺激時，線粒體膜電位會發(fā)生顯著變化。在本研究中，通過使用熒光探針JC-1對β-谷固醇處理后的SGC-7901人胃癌細胞線粒體膜電位進行檢測。JC-1是一種廣泛應用于檢測線粒體膜電位的陽離子熒光染料，其具有獨特的電位依賴性聚集特性。在正常細胞中，線粒體膜電位較高，JC-1以聚集態(tài)（J-aggregate）存在于線粒體基質中，發(fā)射紅色熒光（Ex/Em=585/590nm）；而當線粒體膜電位下降時，JC-1不能有效聚集，以單體形式存在于細胞質中，發(fā)射綠色熒光（Ex/Em=514/529nm）。通過流式細胞術分析紅色熒光與綠色熒光的強度比值，可準確反映線粒體膜電位的變化情況。實驗結果顯示，隨著β-谷固醇濃度的增加和作用時間的延長，SGC-7901細胞的線粒體膜電位逐漸下降。在對照組中，細胞的紅色熒光與綠色熒光強度比值穩(wěn)定在較高水平，表明線粒體膜電位正常。而在低濃度β-谷固醇（如10μM）處理組中，雖然線粒體膜電位有所下降，但變化相對不明顯；當β-谷固醇濃度升高至40μM及以上時，紅色熒光與綠色熒光強度比值顯著降低，說明線粒體膜電位發(fā)生了明顯的去極化。這表明β-谷固醇能夠破壞SGC-7901細胞的線粒體膜電位穩(wěn)定性，且這種破壞作用具有濃度和時間依賴性。線粒體膜電位的下降會導致線粒體呼吸鏈功能受損，ATP合成減少，細胞能量代謝紊亂。線粒體膜電位的去極化還會使線粒體內膜的通透性增加，促使凋亡相關因子如細胞色素C等從線粒體釋放到細胞質中，從而啟動細胞凋亡程序。因此，β-谷固醇誘導的線粒體膜電位改變在其誘導SGC-7901細胞凋亡過程中起著關鍵的啟動作用。4.1.2細胞色素C的釋放細胞色素C是線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ的重要組成部分，在正常情況下，它緊密結合在線粒體內膜上，參與電子傳遞和ATP的合成過程。當線粒體膜電位下降，線粒體膜通透性發(fā)生改變時，細胞色素C會從線粒體釋放到細胞質中。這一過程是線粒體凋亡途徑中的關鍵步驟，標志著細胞凋亡程序的進一步推進。在本研究中，采用Westernblot技術檢測β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中細胞質和線粒體中細胞色素C的含量變化，以明確細胞色素C的釋放情況。結果顯示，隨著β-谷固醇濃度的升高，細胞質中細胞色素C的表達水平逐漸增加，而線粒體中細胞色素C的表達水平相應降低。這表明β-谷固醇能夠促使細胞色素C從線粒體向細胞質轉移，且轉移程度與β-谷固醇的濃度呈正相關。細胞色素C從線粒體釋放到細胞質后，會與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合。在ATP/dATP存在的條件下，細胞色素C與Apaf-1結合形成多聚體，進而招募并激活procaspase-9，形成凋亡小體。凋亡小體的形成是細胞凋亡過程中的一個重要事件，它能夠激活下游的caspase級聯反應。procaspase-9被激活后，會進一步切割并激活下游的效應caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等。這些效應caspase能夠特異性地切割細胞內的多種底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞發(fā)生凋亡形態(tài)學改變，如細胞核固縮、染色質凝集、細胞膜起泡等，最終引發(fā)細胞凋亡。因此，細胞色素C的釋放是β-谷固醇誘導SGC-7901細胞凋亡過程中激活caspase級聯反應的關鍵環(huán)節(jié)，它將線粒體損傷與細胞凋亡的執(zhí)行階段緊密聯系起來。4.1.3Caspase級聯反應的激活Caspase家族是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著核心作用。根據其功能和激活順序，caspase可分為啟動型caspase（如caspase-8、caspase-9等）和效應型caspase（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等）。在β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的過程中，線粒體途徑的激活導致細胞色素C釋放，進而引發(fā)了caspase級聯反應的激活。在這一過程中，caspase-9作為啟動型caspase首先被激活。如前文所述，細胞色素C從線粒體釋放到細胞質后，與Apaf-1結合形成凋亡小體，凋亡小體招募并激活procaspase-9。激活后的caspase-9通過自身的酶切活性，切割并激活下游的效應型caspase-3。caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行階段的關鍵蛋白酶，它被激活后，能夠對多種細胞內的關鍵蛋白底物進行切割，從而導致細胞凋亡的形態(tài)學和生化改變。為了進一步探究β-谷固醇對caspase級聯反應的激活作用，本研究采用Westernblot技術檢測了β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中caspase-9和caspase-3的活化形式（cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3）的表達水平。實驗結果表明，隨著β-谷固醇濃度的增加，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高。在對照組中，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達量極低，幾乎檢測不到；而在β-谷固醇處理組中，當濃度達到40μM時，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達量明顯增加，且隨著濃度的進一步升高，表達量持續(xù)上升。這充分說明β-谷固醇能夠有效地激活caspase-9和caspase-3，啟動caspase級聯反應，促進細胞凋亡的發(fā)生。caspase-3被激活后，會切割PARP，PARP是一種參與DNA修復的重要酶，其被切割后會導致DNA修復功能受損，進一步加劇細胞的損傷和凋亡。caspase-3還會切割細胞骨架蛋白，如肌動蛋白、微管蛋白等，破壞細胞的結構完整性，使細胞發(fā)生皺縮、變形等凋亡形態(tài)學變化。因此，β-谷固醇通過激活caspase級聯反應，尤其是關鍵的caspase-9和caspase-3，在誘導SGC-7901細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的執(zhí)行作用，促使細胞走向凋亡命運。4.2死亡受體途徑4.2.1死亡受體的表達變化死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，在細胞凋亡的外源性途徑中發(fā)揮著關鍵作用。其中，Fas（又稱CD95）和腫瘤壞死因子受體1（TNF-R1）是研究較為深入的死亡受體。在本研究中，采用RT-qPCR和Westernblot技術，檢測了β-谷固醇處理不同時間后SGC-7901人胃癌細胞中Fas和TNF-R1的表達水平變化。RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，隨著β-谷固醇處理時間的延長，Fas和TNF-R1的mRNA表達水平逐漸升高。在β-谷固醇處理24h后，FasmRNA的表達量較對照組增加了1.56倍（P<0.05），TNF-R1mRNA的表達量增加了1.32倍（P<0.05）；處理48h后，FasmRNA表達量進一步升高至對照組的2.13倍（P<0.01），TNF-R1mRNA表達量升高至對照組的1.89倍（P<0.01）；處理72h時，Fas和TNF-R1mRNA的表達量分別達到對照組的2.87倍和2.56倍（P<0.01）。這表明β-谷固醇能夠顯著上調SGC-7901細胞中Fas和TNF-R1基因的轉錄水平，且上調作用具有時間依賴性。Westernblot檢測結果與RT-qPCR結果一致，β-谷固醇處理后，Fas和TNF-R1蛋白的表達水平也呈現出明顯的上升趨勢。在對照組中，Fas和TNF-R1蛋白表達較弱；而在β-谷固醇處理組中，隨著處理時間的延長，Fas和TNF-R1蛋白條帶的灰度值逐漸增大。在處理72h時，Fas蛋白表達量是對照組的2.65倍（P<0.01），TNF-R1蛋白表達量是對照組的2.34倍（P<0.01）。Fas和TNF-R1表達水平的升高，使其更容易與相應的配體FasL和TNF-α結合，從而激活死亡受體介導的凋亡信號傳導通路。Fas與FasL結合后，可形成三聚體結構，招募含有死亡結構域（DD）的接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomainprotein）。FADD通過其死亡效應結構域（DED）與procaspase-8的DED相互作用，形成死亡誘導信號復合物（DISC），進而激活procaspase-8，啟動caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡。TNF-R1與TNF-α結合后，也會招募TRADD（TNFR-associateddeathdomainprotein）等接頭蛋白，形成類似的信號復合物，激活下游的凋亡信號。因此，β-谷固醇誘導的Fas和TNF-R1表達上調，在其誘導SGC-7901細胞凋亡過程中起著重要的起始作用，為死亡受體途徑的激活奠定了基礎。4.2.2DISC的形成與作用死亡誘導信號復合物（DISC）的形成是死亡受體途徑中的關鍵環(huán)節(jié)，它將死亡受體激活的信號有效地傳遞給下游的caspase級聯反應。當Fas與FasL結合或者TNF-R1與TNF-α結合后，受體發(fā)生三聚化，其胞內的死亡結構域（DD）相互聚集。這種聚集狀態(tài)能夠招募胞內含有死亡結構域的接頭蛋白，如FADD（與Fas結合時）或TRADD（與TNF-R1結合時）。以Fas/FasL途徑為例，FADD通過其N端的死亡效應結構域（DED）與procaspase-8的DED相互作用，多個FADD與procaspase-8分子在Fas受體的胞內段聚集，形成一個高親和力的復合物，即死亡誘導信號復合物（DISC）。在本研究中，通過免疫共沉淀實驗檢測了β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中DISC的形成情況。結果顯示，與對照組相比，β-谷固醇處理組中Fas、FADD和procaspase-8之間的相互作用明顯增強，表明DISC的形成增加。隨著β-谷固醇處理時間的延長，免疫共沉淀條帶的灰度值逐漸增大，說明DISC的形成量與β-谷固醇的處理時間呈正相關。在處理48h時，DISC的形成量顯著高于24h處理組（P<0.05）；處理72h時，DISC的形成量進一步增加，與48h處理組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。DISC形成后，其中的procaspase-8通過自身的催化活性，發(fā)生自我切割和激活。激活后的caspase-8具有強大的蛋白水解酶活性，它可以切割并激活下游的效應caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等。caspase-8對caspase-3的激活是細胞凋亡執(zhí)行階段的關鍵步驟之一。caspase-8將procaspase-3切割為具有活性的cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-3進一步作用于細胞內的多種底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞發(fā)生凋亡形態(tài)學改變，如細胞核固縮、染色質凝集、細胞膜起泡等，最終引發(fā)細胞凋亡。因此，β-谷固醇促進DISC的形成，通過激活caspase-8，進而啟動caspase級聯反應，在誘導SGC-7901細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的信號傳遞和放大作用，使得死亡受體途徑的凋亡信號能夠有效地傳遞并執(zhí)行，促使細胞走向凋亡命運。4.2.3與線粒體途徑的交互作用死亡受體途徑和線粒體途徑并非孤立存在，它們在細胞凋亡過程中存在著復雜的相互關聯和協同作用，共同促進細胞凋亡的發(fā)生。在β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的過程中，這兩條途徑相互影響，形成了一個緊密的調控網絡。一方面，死亡受體途徑可以通過Bid蛋白激活線粒體途徑。Bid是Bcl-2家族中的一員，僅含有BH3結構域。當Fas/FasL或TNF-R1/TNF-α信號通路激活caspase-8后，活化的caspase-8可以切割Bid，產生截短的Bid（tBid）。tBid具有更強的促凋亡活性，它可以從細胞質轉移到線粒體，與線粒體膜上的Bax和Bak相互作用。Bax和Bak在tBid的作用下發(fā)生構象改變，形成寡聚體并插入線粒體膜，導致線粒體外膜通透性增加，進而釋放細胞色素C等凋亡因子，激活線粒體途徑。在本研究中，通過Westernblot檢測發(fā)現，β-谷固醇處理后，SGC-7901細胞中tBid的表達水平顯著升高，且與caspase-8的激活程度呈正相關。這表明在β-谷固醇誘導的凋亡過程中，死亡受體途徑通過激活caspase-8，切割Bid，從而啟動了線粒體途徑，增強了細胞凋亡的信號。另一方面，線粒體途徑也可以反饋調節(jié)死亡受體途徑。線粒體釋放的細胞色素C不僅可以激活caspase-9，啟動線粒體途徑下游的caspase級聯反應，還可以通過與Apaf-1、procaspase-9形成凋亡小體，間接影響死亡受體途徑。凋亡小體激活的caspase-9可以切割并激活caspase-3，而caspase-3除了直接作用于細胞底物導致細胞凋亡外，還可以切割并激活Bid。被激活的Bid又可以進一步促進線粒體途徑的激活，形成一個正反饋循環(huán)。此外，線粒體途徑中Bcl-2家族蛋白的表達變化也會影響死亡受體途徑。Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白可以抑制線粒體膜通透性的改變，減少細胞色素C的釋放，從而削弱線粒體途徑對死亡受體途徑的激活作用；而Bax和Bak等促凋亡蛋白則相反，它們可以促進線粒體膜通透性增加，增強兩條途徑之間的協同作用。在本研究中，β-谷固醇處理后，SGC-7901細胞中Bcl-2表達下降，Bax表達升高，這種變化有利于線粒體途徑的激活，進而增強了與死亡受體途徑的協同作用，共同促進細胞凋亡。死亡受體途徑和線粒體途徑在β-谷固醇誘導SGC-7901細胞凋亡過程中相互作用、相互促進，通過Bid等關鍵分子的介導以及Bcl-2家族蛋白的調節(jié)，形成了一個復雜而精細的調控網絡。這種協同作用使得細胞凋亡信號得到有效放大和傳遞，確保細胞能夠在凋亡刺激下順利啟動凋亡程序，為深入理解β-谷固醇誘導胃癌細胞凋亡的機制提供了更全面的視角。4.3其他可能的機制4.3.1對細胞周期的影響細胞周期的正常調控是維持細胞正常生長和增殖的關鍵，而細胞周期的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。細胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期，各時期之間存在嚴格的調控機制，確保細胞有序進行分裂和增殖。在腫瘤細胞中，細胞周期調控機制常常出現異常，導致細胞過度增殖和失控生長。研究表明，β-谷固醇可能通過影響細胞周期相關蛋白的表達和活性，阻滯SGC-7901人胃癌細胞的細胞周期進程，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。為了探究β-谷固醇對SGC-7901細胞周期的影響，采用流式細胞術檢測不同濃度β-谷固醇處理后的細胞周期分布情況。實驗結果顯示，與對照組相比，β-谷固醇處理組中處于G1期的細胞比例顯著增加，而處于S期和G2/M期的細胞比例明顯減少。在40μMβ-谷固醇處理組中，G1期細胞比例從對照組的45.6%增加至62.3%（P<0.01），S期細胞比例從35.2%下降至20.1%（P<0.01），G2/M期細胞比例從19.2%下降至17.6%（P<0.05）。這表明β-谷固醇能夠將SGC-7901細胞阻滯在G1期，抑制細胞進入S期進行DNA合成和后續(xù)的分裂過程。進一步研究發(fā)現，β-谷固醇對細胞周期的阻滯作用可能與細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調節(jié)有關。細胞周期蛋白和CDK形成復合物，在細胞周期的不同階段發(fā)揮關鍵作用。在G1期向S期轉變過程中，細胞周期蛋白D（CyclinD）與CDK4/6結合，激活CDK4/6的激酶活性，進而磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放出轉錄因子E2F，E2F促進與DNA合成相關基因的轉錄，推動細胞進入S期。在本研究中，通過Westernblot檢測發(fā)現，β-谷固醇處理后，SGC-7901細胞中CyclinD1和CDK4的表達水平顯著降低，而p-Rb的表達水平升高。這表明β-谷固醇可能通過下調CyclinD1和CDK4的表達，抑制Rb的磷酸化，使E2F不能被釋放，從而阻滯細胞周期在G1期，抑制細胞增殖。細胞周期的阻滯使得細胞有更多時間進行自我修復或啟動凋亡程序，當細胞損傷無法修復時，就會走向凋亡。因此，β-谷固醇對SGC-7901細胞周期的阻滯作用，在其誘導細胞凋亡過程中可能發(fā)揮著重要的前期調控作用，為后續(xù)凋亡事件的發(fā)生創(chuàng)造了條件。4.3.2氧化應激與凋亡的關系氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，導致活性氧（ROS）產生過多，超出細胞的抗氧化防御能力，從而對細胞造成損傷的一種狀態(tài)。ROS主要包括超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（·OH）等。在正常生理狀態(tài)下，細胞內存在一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶，以及谷胱甘肽（GSH）、維生素C、維生素E等抗氧化物質，它們能夠及時清除細胞內產生的ROS，維持細胞內氧化還原平衡。然而，當細胞受到某些刺激，如藥物、輻射、炎癥等，ROS的產生會顯著增加，而抗氧化防御系統(tǒng)的功能可能受到抑制，導致氧化應激的發(fā)生。大量研究表明，氧化應激與細胞凋亡密切相關。適度的氧化應激可以作為一種信號，激活細胞內的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡；而過度的氧化應激則會導致細胞損傷和死亡。在腫瘤細胞中，由于其代謝異?；钴S，對氧化應激更為敏感。當腫瘤細胞暴露于氧化應激環(huán)境時，ROS可以直接損傷細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等。ROS可攻擊DNA，導致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷，激活DNA損傷修復機制。如果DNA損傷嚴重且無法修復，細胞會啟動凋亡程序，以避免損傷的DNA傳遞給子代細胞。ROS還可以氧化修飾蛋白質，改變蛋白質的結構和功能，影響細胞內的信號傳導通路和代謝過程。在脂質方面，ROS可引發(fā)脂質過氧化反應，導致細胞膜的結構和功能受損，破壞細胞的完整性。在本研究中，檢測了β-谷固醇處理后SGC-7901細胞內ROS水平的變化。采用DCFH-DA探針法，DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有綠色熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可反映細胞內ROS水平。實驗結果顯示，與對照組相比，β-谷固醇處理組細胞內ROS水平顯著升高，且呈濃度依賴性。在80μMβ-谷固醇處理組中，ROS水平是對照組的2.56倍（P<0.01）。這表明β-谷固醇能夠誘導SGC-7901細胞產生氧化應激。進一步研究發(fā)現，β-谷固醇誘導的氧化應激可能通過多種途徑誘導細胞凋亡。氧化應激產生的ROS可以激活線粒體凋亡途徑。ROS可損傷線粒體膜，導致線粒體膜電位下降，促進細胞色素C的釋放，進而激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。ROS還可以通過激活MAPK等信號通路，調節(jié)凋亡相關蛋白的表達，促進細胞凋亡。在氧化應激條件下，p38MAPK和JNK信號通路被激活，它們可以磷酸化并激活下游的轉錄因子，如c-Jun、ATF2等，這些轉錄因子可上調Bax等促凋亡蛋白的表達，下調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，從而促進細胞凋亡。因此，β-谷固醇通過誘導SGC-7901細胞產生氧化應激，在其誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的介導作用，氧化應激可能是β-谷固醇誘導細胞凋亡的重要中間環(huán)節(jié)。4.3.3信號通路的調控細胞內存在多條復雜的信號通路，它們相互交織形成網絡，共同調節(jié)細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生物學過程。在腫瘤細胞中，這些信號通路常常發(fā)生異常激活或抑制，導致細胞的惡性轉化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在β-谷固醇誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡的過程中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路可能發(fā)揮著重要的調控作用。MAPK信號通路是細胞內重要的信號轉導通路之一，主要包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。在正常生理狀態(tài)下，MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡等多種生物學過程的調節(jié)。當細胞受到外界刺激時，如生長因子、細胞因子、應激信號等，MAPK信號通路被激活。以ERK途徑為例，細胞外信號與細胞膜上的受體結合，激活受體酪氨酸激酶（RTK），RTK磷酸化并招募接頭蛋白Grb2和鳥苷酸交換因子SOS，SOS促進Ras蛋白從無活性的GDP結合形式轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合形式?；罨腞as激活Raf蛋白激酶，Raf進一步磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2。激活后的ERK1/2可以進入細胞核，磷酸化多種轉錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調節(jié)相關基因的表達，從而影響細胞的生物學行為。在本研究中，通過Westernblot檢測了β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中MAPK信號通路相關蛋白的磷酸化水平。結果顯示，β-谷固醇處理后，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38MAPK的表達水平均顯著升高，且呈濃度依賴性。在60μMβ-谷固醇處理組中，p-ERK1/2、p-JNK和p-p38MAPK的表達量分別是對照組的2.13倍、2.35倍和2.08倍（P<0.01）。這表明β-谷固醇能夠激活SGC-7901細胞中的MAPK信號通路。進一步研究發(fā)現，MAPK信號通路的激活在β-谷固醇誘導細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。激活的ERK1/2在低水平時可能具有促進細胞增殖和存活的作用，但在高水平或持續(xù)激活時，則可能促進細胞凋亡。在本研究中，隨著β-谷固醇濃度的增加，ERK1/2的持續(xù)激活可能導致細胞增殖信號向凋亡信號的轉變。JNK和p38MAPK信號通路的激活則主要與細胞應激和凋亡相關。激活的JNK和p38MAPK可以磷酸化并激活下游的轉錄因子，如c-Jun、ATF2等，這些轉錄因子可上調Bax等促凋亡蛋白的表達，下調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，從而促進細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路也是細胞內重要的存活信號通路，在細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮關鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，當細胞受到生長因子、細胞因子等刺激時，PI3K被激活。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募并激活Akt。激活后的Akt可以磷酸化多種底物蛋白，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、叉頭框蛋白O（FoxO）等，調節(jié)細胞的代謝、增殖和存活。在腫瘤細胞中，PI3K/Akt信號通路常常異常激活，導致腫瘤細胞的增殖和存活能力增強，同時抑制細胞凋亡。在本研究中，檢測了β-谷固醇處理后SGC-7901細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達和磷酸化水平。結果顯示，β-谷固醇處理后，PI3K的活性降低，p-Akt的表達水平顯著下降，而Akt的總表達量無明顯變化。在50μMβ-谷固醇處理組中，p-Akt的表達量是對照組的0.45倍（P<0.01）。這表明β-谷固醇能夠抑制SGC-7901細胞中的PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路的抑制使得細胞的存活信號減弱，同時解除了對凋亡信號的抑制作用。Akt的失活導致其對GSK-3β的抑制作用減弱，激活的GSK-3β可以促進β-catenin的降解，抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。Akt的失活還會影響FoxO轉錄因子的活性，激活的FoxO可以上調Bim等促凋亡蛋白的表達，促進細胞凋亡。因此，β-谷固醇通過調節(jié)MAPK和PI3K/Akt等信號通路，在誘導SGC-7901細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的信號調控作用，這些信號通路之間相互作用，共同構成了復雜的調控網絡，影響著細胞的凋亡命運。五、研究成果的臨床轉化前景與挑戰(zhàn)5.1臨床應用的潛在價值5.1.1作為抗癌藥物的可能性β-谷固醇展現出的顯著抗腫瘤活性，使其具備成為抗癌藥物的潛力。從細胞實驗和動物實驗結果來看，β-谷固醇能夠通過多條途徑誘導SGC-7901人胃癌細胞凋亡，有效抑制腫瘤細胞的生長和增殖。在細胞水平上，β-谷固醇對胃癌細胞的作用具有時間-劑量依賴性，隨著濃度的增加和作用時間的延長，細胞凋亡率顯著上升，凋亡相關蛋白表達發(fā)生明顯改變，如Bcl-2表達下調，Bax、cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9表達上調，線粒體膜電位下降，細胞色素C釋放，這些都充分證明了其誘導細胞凋亡的能力。在動物實驗中，構建裸鼠胃癌移植瘤模型，給予β-谷固醇處理后，腫瘤體積明顯減小，生長速度減緩，TUNEL染色顯示腫瘤組織中凋亡細胞增多，進一步驗證了其在體內的抗腫瘤效果。β-谷固醇作為一種天然的植物甾體化合物，與傳統(tǒng)化療藥物相比，具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，往往會對正常細胞造成嚴重損害，導致患者出現多種不良反應，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，極大地影響了患者的生活質量和治療依從性。而β-谷固醇來源于植物，在正常生理劑量下，對人體正常細胞的毒性較低。已有研究表明，在一定濃度范圍內，β-谷固醇對正常細胞的生長和增殖沒有明顯抑制作用，且不會引起細胞形態(tài)和功能的明顯改變。這使得β-谷固醇在抗癌治療中具有更好的安全性和耐受性，有望減少患者在治療過程中的痛苦。β-谷固醇還可以與其他藥物聯合使用，發(fā)揮協同抗癌作用。在乳腺癌細胞模型中，β-谷固醇與紫杉醇聯合應用時，能夠顯著增強紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷效果，提高細胞凋亡率。其協同作用機制可能與β-谷固醇調節(jié)細胞內信號通路，增強腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性有關。在胃癌治療中，也可以嘗試將β-谷固醇與常用的化療藥物（如5-氟尿嘧啶、順鉑等）或靶向藥物聯合使用，通過不同藥物作用機制的互補，提高治療效果，同時減少單一藥物的使用劑量，降低藥物的毒副作用。因此，β-谷固醇無論是單獨使用還是與其他藥物聯合應用，都展現出作為抗癌藥物的可能性，具有廣闊的開發(fā)前景。5.1.2對胃癌治療策略的影響β-谷固醇誘導胃癌細胞凋亡機制的研究，對優(yōu)化胃癌治療方案、提高治療效果具有重要的潛在影響。當前胃癌的治療主要包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段，但由于胃癌的異質性和復雜性，這些治療方法在臨床應用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。許多胃癌患者在接受傳統(tǒng)治療后，容易出現復發(fā)和轉移，且治療過程中的不良反應嚴重影響患者的生活質量和預后。β-谷固醇的研究成果為胃癌治療提供了新的思路和方向。基于其誘導細胞凋亡的作用機制，可將β-谷固醇納入胃癌綜合治療方案中。在手術前給予患者β-谷固醇預處理，可能有助于縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術