DB15Technicalregulationsforestablishmentofhydrogenperoxide-inducedoxidativedamagemodelofbovinemammaryepithelialcells2020-06-10發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給本標(biāo)準(zhǔn)由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC1過(guò)氧化氫誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了過(guò)氧化氫誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)本標(biāo)準(zhǔn)適用于采用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷模型原代細(xì)胞培養(yǎng)primarycell將乳腺上皮細(xì)胞在模擬體內(nèi)生存環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、4℃離心機(jī)、4℃冰箱、-20℃冰箱、0.22μm過(guò)濾器、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、15DMEM/F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、雙抗、5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、氫化可的松、兩性霉素B、30%過(guò)氧化氫、甲醇、高壓滅菌超純水、0.4%臺(tái)盼藍(lán)、75%酒精、新潔爾滅、0.25%胰酶山羊血清、兔抗細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）18單克隆抗體、山羊抗兔DAPI染液、四氮唑藍(lán)鹽化合物（MTS）、細(xì)胞裂解液、活性氧（ROS）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、12超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）試劑盒、乳酸脫氫酶（谷氨酰胺1.5mL加入86.74mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中，0.22μm濾器過(guò)濾，密封素B100μL、10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子10μL、50μg/mL催乳素50μL、200mmol/LL-谷氨酰胺1.5mL加入96.74mL的DMEM/F12培養(yǎng)基中，0.將10%胎牛血清10mL加入90mLDMEM/F12培養(yǎng)基中，0.22將1mg兩性霉素溶于10mL無(wú)菌超純水中，0.2將0.2mg表皮生長(zhǎng)因子溶于20mLDMEM/F12培養(yǎng)基中，充分混將250IU的催乳素（按25IU/mg轉(zhuǎn)換）溶于1mLDMEM/F12培養(yǎng)基中，配制成濃度為10mg/mL的濃貯，取100μL10mg/mL濃貯溶于20mLDMEM/F12培養(yǎng)基中將5mL雙抗加入500mLPBS中，0.22μm濾器過(guò)濾，密封分將15mL雙抗加入500mLPBS中，0.在1mLH2O2中加入8mL高壓滅菌超純水稀釋到9mL，配制成濃度為1mol/L（1000mmol/L）的H2O25.3.12過(guò)氧化氫工作液配制（60H2O2工作液，0.22μm濾器過(guò)濾，-20℃保存，每次換液時(shí)現(xiàn)配。采用AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G，-20色乳汁的健康奶牛乳腺組織約200g，立即裝入干凈樣品袋36.2.2將采集的乳腺樣品放入已滅6.3.2關(guān)閉超凈臺(tái)紫外照射燈，打開超凈6.3.3將浸泡后的乳腺組織移至超凈臺(tái)內(nèi)，依次用含3%雙抗的PBS清洗三遍，75%酒精浸泡30s，含1%雙抗的PBS清洗三遍，然后將乳腺組織放入一無(wú)菌90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用眼科鑷子和剪刀剪去6.3.4將呈糊狀的乳腺組織塊吸移至），4將生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后分別制成0.5×104個(gè)/mL、1.0×104個(gè)/mL、2.0×104個(gè)培養(yǎng)24h后，用0.25%胰酶消化24孔板中0.5×104個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL、2×104個(gè)/mL的3孔細(xì)胞，分別制成1mL細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以后每隔24h計(jì)數(shù)一次，連續(xù)8d，未計(jì)數(shù)細(xì)胞組每26.7.8再用PBS緩沖液沖洗3次，5min/次，熒光倒置顯微5將傳第三代奶牛乳腺上皮細(xì)胞使用完全培養(yǎng)基懸浮，并以2×105個(gè)/mL或2×104個(gè)/mL密度分別接種7.2過(guò)氧化氫誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞8過(guò)氧化氫誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷數(shù)量達(dá)20%8.2氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖率測(cè)將乳腺上皮細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，濃度為2×104將96孔板放入酶標(biāo)儀中中速搖動(dòng)10min，490nm讀取吸光度（OD）值，OD值范圍為0.20～0.25。8.2.7氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞8.3氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化-抗氧化指68.3.1氧化損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化-抗600μmol/L的H2O2作用于乳腺上皮細(xì)胞6h后，棄上清，抽取1mLPBS清洗每孔內(nèi)貼壁生長(zhǎng)上皮細(xì)胞2次，棄去上清液，每孔加入200