DB15Real-timePCRMethodforAuthentificationofCamelDerivedMaterials2020-10-20發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB15/T2026—2020I本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件起草單位：錫林郭勒職業(yè)學(xué)院、錫林郭勒食品藥品檢驗(yàn)檢測和風(fēng)險(xiǎn)評估中駱駝源性成分檢測方法實(shí)時(shí)熒光PCR法本文件描述了動(dòng)物產(chǎn)品（肉、乳）中駱駝源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢本文件規(guī)定了鮮肉與加工肉制品的檢出限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；鮮乳與加工乳制品的檢出限為5%GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循1DB15/T2026—202025試劑和材料5.2異戊醇。5.3異丙醇。），），）：CTTACCTTGTTACGACTTRHEX-TTCTCATACGTTTTGCACTTATTTAT-MGBDB15/T2026—2020ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-B6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀：通道數(shù)≥3，溫度控制精度<±0.1℃。6.4微量移液器：0.5L～10L，10L～100L，20L～200L，100L～1000L。6.5金屬浴或恒溫水浴鍋：溫度控制精度<±0.5℃。分混勻，裝入清潔容器中，加封后，注明標(biāo)記稱取100mg均質(zhì)固態(tài)樣品于1.5mL滅菌離心管中；加入700LCTAB提取液（5.6），充分混勻，加入等體積三氯甲烷和異戊醇混合液（體積比為24:1），旋渦混勻，13新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13000rpm離心5min，棄去上清液，75%乙醇洗滌兩次（13000rpm離心30s棄去上清液），室溫晾干，加入20L～50L滅菌水溶解，-20℃保存。對陽性3DB15/T2026—2020管上層乳脂和中間層的液體，保留底部沉淀；向離心管中加入600LPBS緩沖液（5.8），將沉淀懸浮部沉淀；向離心管中加入60L乳化劑（5.7）和540LPBS緩沖液（5.8），振蕩至沉淀完后續(xù)提取步驟按照7.2.1方法進(jìn)行。用滅菌水代替樣品進(jìn)行核酸抽提作為提取空白對照。也可以使用同ng/L時(shí)，建議用滅菌水稀釋；若濃度小于10ng/L或比值小于1.7時(shí)，建議重新進(jìn)行DNA提取。c=A×N×50/1000???????????（1）設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照以及提取空白對照。所有樣品設(shè)置平行反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表2。正向引物（10mol/L）反向引物（10mol/L）駱駝特異性探針（10mol/L）質(zhì)控探針（10mol/L）4DB15/T2026—2020反應(yīng)程序根據(jù)不同廠家的商品試劑盒或不同型號(hào)的實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)b)陰性對照：特異性探針無熒光對數(shù)增長或9結(jié)果判定與表述9.1結(jié)果判定9.2結(jié)果表述9.2.1樣品陽性，表述為“檢出駱駝源性成分”。9.2.2樣品陰性，表述為“未檢出駱駝源性成分”。5DB15/T2026—2020A.1駱駝特異性基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列（120bp）及引物和探針位置TTGAACTAGGCCATG(G/A)AGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCTTCAAATCCAATG