miR-34a靶向調控NOTCH1基因對SW480細胞增殖的多維度解析與機制探究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學和醫(yī)學領域，腫瘤的研究始終占據(jù)著至關重要的地位。腫瘤嚴重威脅人類健康，每年全球因腫瘤死亡的人數(shù)眾多，其發(fā)病機制復雜，涉及多個基因和信號通路的異常調節(jié)。因此，深入探究腫瘤的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和方法，成為了當今醫(yī)學研究的緊迫任務。miR-34a作為一種微小RNA，在腫瘤研究中備受關注。微小RNA是一類長度較短的非編碼RNA，它們通過與靶mRNA的互補配對，在轉錄后水平調控基因的表達。miR-34a在多種腫瘤組織和細胞系中呈現(xiàn)出異常表達的情況，且這種異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。研究表明，miR-34a可通過調控多個靶基因，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為。例如，在非小細胞肺癌中，miR-34a的低表達與腫瘤的惡性程度和不良預后相關，恢復其表達可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡；在乳腺癌中，miR-34a能夠靶向抑制相關基因，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移。這些研究結果表明，miR-34a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調控作用，可能成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點。NOTCH1基因編碼的跨膜受體蛋白在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和凋亡等生命過程中都扮演著重要角色。在腫瘤領域，NOTCH1信號通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在T細胞急性淋巴細胞白血病中，NOTCH1基因的突變或過表達可導致NOTCH1信號通路的持續(xù)激活，促進腫瘤細胞的增殖和存活；在結直腸癌中，NOTCH1信號通路的異常激活可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制細胞凋亡。NOTCH1基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用，使其成為腫瘤治療的重要潛在靶點。SW480細胞作為人結腸癌細胞系的一種，具有高浸潤性和侵襲性，且容易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，是研究結直腸癌的常用細胞模型。結直腸癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均位居前列。在我國，結直腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人們的健康。研究miR-34a靶向調控NOTCH1基因對SW480細胞增殖的影響及其機制，對于深入理解結直腸癌的發(fā)病機制具有重要意義。通過揭示這一調控關系，我們可以進一步明確腫瘤細胞增殖的分子機制，為結直腸癌的治療提供新的理論依據(jù)。這一研究還有望為結直腸癌的治療開辟新的途徑。以miR-34a和NOTCH1基因為靶點，開發(fā)新的治療方法，如通過調節(jié)miR-34a的表達或抑制NOTCH1信號通路，可能為結直腸癌患者帶來新的治療希望，提高患者的生存率和生活質量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腫瘤研究領域，miR-34a的研究一直是熱點話題。國外方面，早在2007年，就有研究表明miR-34a在多種腫瘤細胞中發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用。如在小鼠模型中，通過上調miR-34a的表達，顯著抑制了腫瘤細胞的生長和轉移，其機制涉及對多個癌基因的調控。后續(xù)研究進一步發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過直接靶向抑制腫瘤細胞的關鍵信號通路，如PI3K/AKT通路，來抑制腫瘤細胞的增殖和存活。在黑色素瘤細胞中，miR-34a能夠靶向抑制相關基因，降低細胞的遷移和侵襲能力。國內(nèi)研究也對miR-34a給予了高度關注。有研究報道，在肝癌細胞中，miR-34a的低表達與腫瘤的惡性程度和不良預后密切相關。通過恢復miR-34a的表達，可誘導肝癌細胞凋亡，抑制其增殖和遷移。在結直腸癌的研究中，國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)miR-34a的表達水平與腫瘤的分期和淋巴結轉移密切相關，低表達的miR-34a預示著更差的預后。對于NOTCH1基因，國外研究揭示了其在胚胎發(fā)育過程中的重要作用。在果蠅的發(fā)育研究中，NOTCH1信號通路的異常會導致果蠅翅膀發(fā)育異常，這表明NOTCH1基因在細胞分化和組織發(fā)育中不可或缺。在腫瘤研究方面，國外學者在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，NOTCH1基因的過表達可激活下游的信號分子，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，同時增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。國內(nèi)對NOTCH1基因的研究也取得了一定成果。在胃癌的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)NOTCH1信號通路的激活與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，抑制NOTCH1信號通路可抑制胃癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡。在白血病的研究領域，國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)NOTCH1基因的突變可導致NOTCH1信號通路的異常激活，促進白血病細胞的增殖和存活。關于miR-34a與NOTCH1基因在SW480細胞增殖中的關系，國外已有研究通過熒光素酶報告基因實驗證實，miR-34a能夠直接靶向NOTCH1基因的3'-UTR區(qū)域，抑制其表達。在SW480細胞中過表達miR-34a后，NOTCH1蛋白的表達水平顯著降低，細胞的增殖能力受到明顯抑制，細胞周期被阻滯在G0/G1期。國內(nèi)也有相關研究深入探討了這一關系。研究發(fā)現(xiàn)，在SW480細胞中，下調miR-34a的表達會導致NOTCH1基因表達上調，進而促進細胞增殖和遷移；而恢復miR-34a的表達則能夠逆轉這一過程，抑制NOTCH1基因的表達，降低細胞的增殖和遷移能力。這些研究結果表明，miR-34a通過靶向調控NOTCH1基因，在SW480細胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究miR-34a靶向調控NOTCH1基因對SW480細胞增殖的影響及其潛在機制。具體而言，首先通過生物信息學分析、熒光素酶報告基因實驗等方法，明確miR-34a與NOTCH1基因之間的靶向結合關系，從分子層面揭示兩者的相互作用方式。運用細胞轉染技術，上調或下調SW480細胞中miR-34a的表達水平，通過MTT法、CCK-8法、EdU實驗等多種細胞增殖檢測方法，系統(tǒng)地研究miR-34a表達變化對SW480細胞增殖能力的影響，準確評估細胞的增殖活性和生長狀態(tài)。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等實驗技術，檢測NOTCH1基因及相關信號通路分子的表達變化，深入剖析miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的內(nèi)在分子機制，全面揭示相關信號傳導途徑和調控網(wǎng)絡。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在研究角度和研究方法兩個方面。在研究角度上，聚焦于miR-34a與NOTCH1基因在SW480細胞增殖中的調控關系，為結直腸癌的發(fā)病機制研究提供了全新的視角。目前，雖然對miR-34a和NOTCH1基因在腫瘤中的作用已有一定研究，但將兩者結合，深入探究它們在SW480細胞增殖過程中的相互作用及機制的研究相對較少。本研究填補了這一領域的部分空白，有助于更全面、深入地理解結直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制。在研究方法上，綜合運用多種先進的分子生物學和細胞生物學技術，從多個層面深入研究miR-34a對NOTCH1基因的靶向調控作用及其對SW480細胞增殖的影響。不僅采用常規(guī)的細胞增殖檢測方法和基因表達檢測技術，還引入了熒光素酶報告基因實驗等方法，精準地驗證miR-34a與NOTCH1基因的靶向關系，使研究結果更加準確、可靠，為后續(xù)的研究和治療提供了堅實的實驗基礎。二、miR-34a與NOTCH1基因概述2.1miR-34a的結構與功能特性miR-34a是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其結構具有高度的保守性。它由基因組上特定的基因序列轉錄而來，初始轉錄產(chǎn)物為具有莖環(huán)結構的初級miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA在細胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復合物切割，形成長度約為70-100個核苷酸的前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA呈發(fā)夾狀結構。隨后，pre-miRNA被轉運出細胞核，在細胞質中被另一種核酸酶Dicer識別并切割，最終形成成熟的miR-34a。成熟的miR-34a能夠與AGO蛋白等結合，形成RNA誘導沉默復合體（RISC），通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制靶mRNA的翻譯過程，或者直接降解靶mRNA，從而在轉錄后水平調控基因的表達。miR-34a在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮著廣泛而重要的功能。在細胞周期調控方面，miR-34a可以通過靶向調控相關基因，如CDK4、CDK6等細胞周期蛋白依賴性激酶，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制細胞的增殖。在細胞凋亡過程中，miR-34a能夠上調促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。miR-34a還參與細胞分化過程的調控，在神經(jīng)干細胞的分化中，miR-34a的表達水平變化會影響神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞的分化方向。在腫瘤領域，miR-34a被廣泛認為是一種重要的腫瘤抑制因子。在多種腫瘤組織和細胞系中，miR-34a的表達水平顯著低于正常組織和細胞。如在肺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a的低表達與腫瘤的惡性程度、淋巴結轉移及不良預后密切相關?；謴蚼iR-34a的表達可以抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導細胞凋亡，同時增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性。在結直腸癌中，miR-34a同樣發(fā)揮著腫瘤抑制作用，其表達下調可導致腫瘤細胞的增殖和轉移能力增強，而通過上調miR-34a的表達，則能夠有效抑制結直腸癌細胞的生長和轉移。這些研究結果表明，miR-34a通過調控一系列與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的靶基因和信號通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中發(fā)揮著關鍵的抑制作用。2.2NOTCH1基因的結構與生物學作用NOTCH1基因位于人類染色體9q34.3上，其長度較長，包含多個外顯子和內(nèi)含子。該基因編碼的NOTCH1蛋白是一種高度保守的跨膜受體蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)含有多個表皮生長因子樣重復序列（EGF-likerepeats）和3個Lin-12/Notch重復序列（LNRs），這些結構域在與配體結合過程中發(fā)揮關鍵作用?？缒^(qū)則將NOTCH1蛋白錨定在細胞膜上。胞內(nèi)區(qū)包含多個功能結構域，如RAM結構域、ANK重復序列、PEST結構域等，這些結構域參與信號傳導和蛋白-蛋白相互作用，在NOTCH1信號通路激活后，它們與下游的效應分子相互作用，從而調控基因的表達。在胚胎發(fā)育過程中，NOTCH1基因發(fā)揮著不可或缺的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，NOTCH1信號通路參與神經(jīng)干細胞的增殖與分化調控。研究表明，在神經(jīng)管形成階段，NOTCH1信號的激活能夠維持神經(jīng)干細胞的未分化狀態(tài)，抑制其過早分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質細胞，從而保證神經(jīng)干細胞的數(shù)量，為后續(xù)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育提供足夠的細胞來源。當神經(jīng)干細胞開始向神經(jīng)元分化時，NOTCH1信號通路的活性會發(fā)生變化，其信號強度的降低促使神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，同時抑制其向神經(jīng)膠質細胞分化，確保神經(jīng)元的正常生成和神經(jīng)系統(tǒng)的結構與功能完整性。在心血管系統(tǒng)發(fā)育中，NOTCH1基因同樣起著關鍵作用。在心臟發(fā)育過程中，NOTCH1信號通路參與心臟瓣膜的形成、心肌細胞的增殖與分化以及心臟傳導系統(tǒng)的發(fā)育。在心臟瓣膜發(fā)育過程中，NOTCH1信號通路的激活能夠促進心內(nèi)膜細胞向間質細胞轉化，進而形成心臟瓣膜的結構。如果NOTCH1基因發(fā)生突變或其信號通路異常，可能導致心臟瓣膜發(fā)育異常，引發(fā)先天性心臟病。在正常成體組織中，NOTCH1基因參與維持細胞的穩(wěn)態(tài)和組織的正常功能。在皮膚組織中，NOTCH1信號通路調控表皮干細胞的增殖與分化。表皮干細胞位于皮膚的基底層，它們通過不斷增殖和分化，維持皮膚的正常更新和修復。NOTCH1信號通路的激活能夠促進表皮干細胞的增殖，同時抑制其過度分化，保證表皮干細胞的數(shù)量和功能，維持皮膚的正常結構和屏障功能。當皮膚受到損傷時，NOTCH1信號通路會被激活，促進表皮干細胞的增殖和遷移，加速皮膚的修復過程。在腸道組織中，NOTCH1基因參與腸上皮細胞的分化和腸道干細胞的維持。腸上皮細胞不斷更新，由腸道干細胞分化產(chǎn)生新的腸上皮細胞。NOTCH1信號通路能夠調控腸道干細胞向不同類型的腸上皮細胞分化，確保腸道上皮細胞的正常組成和功能。NOTCH1信號通路還參與維持腸道干細胞的干性，使其能夠持續(xù)增殖和分化，保證腸道組織的正常更新和修復。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，NOTCH1基因的作用具有復雜性和多樣性。在某些腫瘤中，NOTCH1基因的異常激活可促進腫瘤細胞的增殖。在T細胞急性淋巴細胞白血病（T-ALL）中，NOTCH1基因的突變或過表達較為常見。這些突變或過表達導致NOTCH1信號通路持續(xù)激活，促進T細胞的異常增殖和存活。NOTCH1信號通路激活后，可上調細胞周期相關蛋白的表達，如CyclinD1、CDK4等，使細胞周期進程加快，促進腫瘤細胞的增殖。NOTCH1信號通路還能抑制腫瘤細胞的凋亡，通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，增強腫瘤細胞的存活能力。在結直腸癌中，NOTCH1信號通路的異常激活也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。NOTCH1信號通路可促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時抑制細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，NOTCH1信號通路激活后，可通過上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，如MMP-2、MMP-9等，降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。NOTCH1信號通路還能調控上皮-間質轉化（EMT）過程，使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。然而，在另一些腫瘤中，NOTCH1基因卻可能發(fā)揮抑制腫瘤的作用。在乳腺癌中，低水平的NOTCH1表達與腫瘤的不良預后相關，適當激活NOTCH1信號通路可抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡。這表明NOTCH1基因在不同腫瘤中的作用可能受到腫瘤微環(huán)境、其他信號通路的相互作用以及基因表達水平等多種因素的影響。2.3miR-34a與NOTCH1基因的潛在聯(lián)系大量研究表明，miR-34a與NOTCH1基因之間存在著緊密的潛在聯(lián)系，這種聯(lián)系主要體現(xiàn)在分子層面的靶向調控關系以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同作用。從分子靶向調控角度來看，生物信息學預測是揭示兩者潛在聯(lián)系的重要手段之一。通過多種生物信息學數(shù)據(jù)庫和算法，如TargetScan、miRanda等預測發(fā)現(xiàn)，miR-34a的種子序列與NOTCH1基因mRNA的3'-UTR區(qū)域存在互補配對位點。這一預測結果為兩者之間可能存在的靶向調控關系提供了初步線索。眾多實驗研究也已證實了這種靶向關系的存在。熒光素酶報告基因實驗是驗證miRNA與靶基因靶向關系的經(jīng)典方法。將NOTCH1基因3'-UTR區(qū)域包含預測的miR-34a結合位點的序列克隆到熒光素酶報告載體中，與miR-34a模擬物或陰性對照共同轉染至細胞中。結果顯示，與陰性對照相比，共轉染miR-34a模擬物的細胞中熒光素酶活性顯著降低，這表明miR-34a能夠與NOTCH1基因3'-UTR區(qū)域特異性結合，從而抑制熒光素酶的表達，有力地證明了miR-34a對NOTCH1基因的直接靶向作用。在乳腺癌細胞MCF-7中，轉染miR-34amimics后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，NOTCH1基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。這進一步從基因和蛋白表達層面證實了miR-34a能夠通過靶向結合NOTCH1基因mRNA的3'-UTR區(qū)域，在轉錄后水平抑制NOTCH1基因的表達。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-34a與NOTCH1基因表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，共同影響腫瘤細胞的生物學行為。在結直腸癌中，miR-34a的低表達與NOTCH1基因的高表達常常同時出現(xiàn)，且與腫瘤的不良預后密切相關。臨床研究數(shù)據(jù)表明，在結直腸癌患者的腫瘤組織中，miR-34a表達水平越低，NOTCH1基因表達水平越高，患者的腫瘤分期往往越晚，淋巴結轉移的發(fā)生率越高，5年生存率越低。這提示miR-34a與NOTCH1基因在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在反向調控關系，miR-34a的低表達無法有效抑制NOTCH1基因的表達，從而導致NOTCH1信號通路的異常激活，促進腫瘤的進展。體外細胞實驗也進一步驗證了這一協(xié)同作用。在SW480細胞中，下調miR-34a的表達會導致NOTCH1基因表達上調，進而促進細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時抑制細胞凋亡；而恢復miR-34a的表達則能夠抑制NOTCH1基因的表達，逆轉上述細胞生物學行為的改變，使細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，細胞凋亡增加。這表明miR-34a通過靶向調控NOTCH1基因，在結直腸癌細胞的惡性生物學行為調控中發(fā)揮著關鍵作用，兩者的異常表達協(xié)同促進了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。在其他腫瘤中，也有類似的研究報道支持miR-34a與NOTCH1基因的潛在聯(lián)系。在非小細胞肺癌中，miR-34a同樣能夠靶向抑制NOTCH1基因的表達，且兩者的表達水平與腫瘤的侵襲、轉移及患者的預后密切相關。在肝癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a的表達下調與NOTCH1信號通路的激活相關，通過上調miR-34a的表達可以抑制NOTCH1基因的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡。這些研究結果進一步表明，miR-34a與NOTCH1基因之間的潛在聯(lián)系在多種腫瘤中具有普遍性，它們共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，為腫瘤的治療提供了新的潛在靶點和治療思路。三、研究材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系與實驗動物本實驗選用的SW480細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。SW480細胞作為人結腸癌細胞系，具有高浸潤性和侵襲性的特點，且容易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。這些特性使得SW480細胞成為研究結直腸癌發(fā)病機制、侵襲轉移機制以及耐藥機制的常用細胞模型。其高浸潤性和侵襲性能夠模擬結直腸癌在體內(nèi)的惡性生物學行為，有助于深入研究腫瘤細胞的遷移和侵襲過程；而耐藥現(xiàn)象的存在則為研究結直腸癌的耐藥機制和開發(fā)新的治療策略提供了重要的研究對象。實驗動物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。裸鼠由于其免疫缺陷的特性，缺乏T淋巴細胞，對異種移植的腫瘤細胞排斥反應較弱，能夠為SW480細胞的體內(nèi)成瘤實驗提供良好的宿主環(huán)境。在實驗動物飼養(yǎng)方面，將裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物實驗室內(nèi)，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度保持在（50±10）%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律。給予裸鼠無菌飼料和高壓滅菌后的飲用水自由進食和飲水，定期更換鼠籠和墊料，以保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生，確保實驗動物的健康狀態(tài)，為實驗的順利進行提供保障。3.1.2主要試劑與儀器設備實驗用到的關鍵試劑包括：miR-34a模擬物（mimics）、miR-34a抑制劑（inhibitor）及其各自的陰性對照（NC），均由廣州銳博生物科技有限公司合成。這些試劑用于調控SW480細胞中miR-34a的表達水平，通過轉染miR-34amimics可上調miR-34a的表達，而轉染miR-34ainhibitor則可下調其表達，從而研究miR-34a表達變化對SW480細胞增殖的影響。Lipofectamine3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，用于將上述核酸分子導入SW480細胞中，實現(xiàn)對細胞內(nèi)miR-34a表達的調控。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，用于檢測SW480細胞的增殖活性。該試劑盒的原理是利用細胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測450nm波長處的吸光度值，即可準確反映細胞的增殖情況。EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，該試劑盒基于EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）與DNA的特異性結合原理，能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過熒光標記的疊氮化物與EdU的反應，在熒光顯微鏡下即可直觀地觀察和計數(shù)增殖細胞，從而準確評估細胞的增殖能力。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）相關試劑，包括RNA提取試劑TRIzol、逆轉錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix等，均購自大連寶生物工程有限公司。TRIzol用于從SW480細胞中提取總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，SYBRGreenPCRMasterMix則用于qRT-PCR反應，通過檢測特定基因的mRNA表達水平，分析miR-34a對NOTCH1基因及相關信號通路分子表達的影響。蛋白質免疫印跡（Westernblot）相關試劑，如RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗（抗NOTCH1抗體、抗β-actin抗體等）、二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG等）、ECL化學發(fā)光試劑等，分別購自碧云天生物技術有限公司、CellSignalingTechnology公司等。RIPA裂解液用于裂解SW480細胞，提取總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒用于測定蛋白樣品的濃度，確保各樣本蛋白上樣量一致；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒用于制備聚丙烯酰胺凝膠，對蛋白樣品進行電泳分離；一抗和二抗用于特異性識別和結合目標蛋白，通過ECL化學發(fā)光試劑與二抗上的辣根過氧化物酶反應，在X光片上產(chǎn)生條帶，從而檢測目標蛋白的表達水平。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司，用于驗證miR-34a與NOTCH1基因的靶向結合關系。該試劑盒利用熒光素酶的催化反應，將熒光素底物氧化產(chǎn)生熒光信號，通過檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性比值，判斷miR-34a是否與NOTCH1基因的3'-UTR區(qū)域特異性結合，從而影響熒光素酶的表達。實驗用到的關鍵儀器設備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為SW480細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度在37℃，CO?濃度在5%，確保細胞的正常生長和代謝。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），用于提供無菌操作環(huán)境，防止實驗過程中細胞和試劑受到微生物污染。倒置顯微鏡（Olympus公司），可實時觀察SW480細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，便于及時調整實驗條件。高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心分離，在低溫條件下可有效防止蛋白降解和細胞活性損失。酶標儀（Bio-Rad公司），用于檢測CCK-8試劑盒反應后的吸光度值，從而定量分析細胞的增殖活性。實時熒光定量PCR儀（ABI公司），用于進行qRT-PCR反應，精確檢測基因的mRNA表達水平，具有高靈敏度和準確性。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對Westernblot實驗中的蛋白條帶進行成像和分析，通過軟件對條帶的灰度值進行測定，實現(xiàn)對蛋白表達量的半定量分析。多功能酶標儀（PerkinElmer公司），可用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗中熒光信號的檢測，準確測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，為驗證miR-34a與NOTCH1基因的靶向關系提供數(shù)據(jù)支持。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與轉染將SW480細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗（P/S）的Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基中。由于Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基以磷酸鹽和高濃度氨基酸作為緩沖劑，適合空氣培養(yǎng)，因此將細胞置于37℃、100%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代操作。傳代時，先用預熱的PBS輕輕潤洗細胞1-2次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶進行消化。在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓、間隙增大且部分細胞開始脫落時，立即加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補充新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞轉染實驗中，首先根據(jù)實驗設計，將對數(shù)生長期的SW480細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細胞，加入2mL培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁并達到合適的密度。待細胞密度達到60%-70%時，進行轉染操作。轉染試劑選用Lipofectamine3000，按照其說明書進行操作。將miR-34a模擬物（mimics）、miR-34a抑制劑（inhibitor）及其各自的陰性對照（NC）分別與Lipofectamine3000試劑混合，形成轉染復合物。具體操作如下：在無菌EP管中，分別加入5μLmiR-34amimics（終濃度為50nM）或miR-34ainhibitor（終濃度為100nM）以及相應的NC，再加入250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，得到溶液A；在另一無菌EP管中，加入5μLLipofectamine3000試劑，再加入250μL無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，得到溶液B。將溶液A和溶液B室溫孵育5min后，混合均勻，室溫孵育20min，使轉染復合物充分形成。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕潤洗細胞1-2次，然后每孔加入500μL含有轉染復合物的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育4-6h。孵育結束后，吸出無血清培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實驗。3.2.2熒光素酶報告基因實驗熒光素酶報告基因實驗的原理是利用熒光素酶的催化反應來檢測基因表達水平。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶是常用的兩種熒光素酶，螢火蟲熒光素酶可催化熒光素氧化產(chǎn)生熒光，海腎熒光素酶則作為內(nèi)參，用于校正轉染效率等實驗誤差。在本實驗中，旨在通過該實驗驗證miR-34a與NOTCH1基因的3'-UTR是否存在相互作用。首先，通過全基因合成技術，獲取NOTCH1基因3'-UTR中包含miR-34a預測結合位點的野生型（WT）序列以及將結合位點突變后的突變型（Mut）序列。將這兩種序列分別克隆到psiCHECK-2載體的多克隆位點處，構建成野生型報告基因質粒（WT-psiCHECK-2）和突變型報告基因質粒（Mut-psiCHECK-2）。將構建好的報告基因質粒與miR-34amimics或NC共同轉染至293T細胞中（由于293T細胞具有較高的轉染效率，適合用于熒光素酶報告基因實驗）。具體轉染步驟如下：將293T細胞接種于96孔板中，每孔接種密度為1×10?個細胞，加入100μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。在無菌EP管中，分別加入10μLDMEM培養(yǎng)基、0.16μg的WT-psiCHECK-2或Mut-psiCHECK-2質粒以及5pmol的miR-34amimics或NC，輕輕混勻，得到溶液A；在另一無菌EP管中，加入10μLDMEM培養(yǎng)基和0.3μL的轉染試劑（如LipoFiter，濃度為0.8mg/mL），輕輕混勻，得到溶液B。將溶液A和溶液B室溫孵育5min后，混合均勻，室溫孵育20min，形成轉染復合物。轉染前，將96孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加入100μL新鮮的無血清培養(yǎng)基，然后將轉染復合物加入孔中，輕輕混勻，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染6h后，吸出無血清培養(yǎng)基，每孔加入100μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。48h后，收集細胞進行熒光素酶活性檢測。使用Promega公司的Dual-Luciferase系統(tǒng)進行檢測，具體步驟如下：將5×PLB（PassiveLysisBuffer）用蒸餾水稀釋至1×PLB，每孔加入100μL1×PLB，用移液器吹打打散細胞，置于室溫搖床上緩慢搖15min，使細胞充分裂解。將細胞裂解液吸至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm（13200g）離心10min，取上清移入新的管子。在96孔板中加入100μLLuciferaseAssayReagentII（LARII，螢火蟲熒光素酶的底物）工作液，然后加入20μL細胞裂解液，用移液器吹打混勻2-3次，在多功能酶標儀上測定螢火蟲熒光素酶的值，此值為內(nèi)參值。再加入100μLStop&Glo?Reagent（海腎熒光素酶的底物，可終止LARII的反應），用移液器吹打混勻2-3次，測定海腎熒光素酶的值，此即為報告基因發(fā)光值。計算每孔的螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶的比值，以NC組的比值為單位1，得到不同處理組的相對熒光素酶活性。若miR-34a與NOTCH1基因3'-UTR的WT序列存在相互作用，則共轉染miR-34amimics和WT-psiCHECK-2的細胞中，相對熒光素酶活性會顯著降低；而與Mut-psiCHECK-2共轉染時，相對熒光素酶活性無明顯變化，從而驗證miR-34a與NOTCH1基因的靶向結合關系。3.2.3免疫印跡技術檢測蛋白表達免疫印跡技術（Westernblot）是一種基于抗原抗體特異性結合的蛋白質檢測技術，可用于檢測細胞或組織中特定蛋白質的表達水平。在本實驗中，利用該技術檢測NOTCH1蛋白的表達。首先進行蛋白樣品的制備。將轉染后的SW480細胞用預冷的PBS沖洗2-3次，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質。然后向細胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，比例為100:1:1），置于冰上裂解30min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。裂解完成后，將細胞裂解液轉移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為蛋白樣品。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品的濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。將蛋白樣品與6×loadingbuffer按5:1的比例混合，100℃煮沸5-10min，使蛋白質變性，然后置于冰上冷卻備用。接著進行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白NOTCH1的分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，NOTCH1蛋白分子量較大，可配制8%-10%的分離膠和5%的濃縮膠。灌膠時，先配制分離膠，加入TEMED后迅速混勻，然后將分離膠緩慢倒入玻璃板之間，避免產(chǎn)生氣泡，灌至距離玻璃板頂部約1.5cm處，用去離子水進行液封，待分離膠凝固。分離膠凝固后，倒掉上層的水，用濾紙吸干殘留水分，然后配制濃縮膠，加入TEMED后混勻，將濃縮膠灌滿剩余空間，立即插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡，待濃縮膠凝固。小心拔出梳子，將膠板裝入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液。將變性后的蛋白樣品按每孔30-50μg的量上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。接通電源，先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120-150V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結束電泳。隨后進行轉膜操作。轉膜采用硝酸纖維素膜（NC膜），根據(jù)凝膠大小裁剪合適尺寸的NC膜和濾紙。將NC膜和濾紙預先浸泡在轉膜緩沖液中15-20min，使其充分濕潤。電泳結束后，小心取出凝膠，放入轉膜緩沖液中平衡5-10min。在轉膜裝置中，按照從下至上的順序依次放置陽極碳板、3-4層濾紙、NC膜、凝膠、3-4層濾紙、陰極碳板，每層之間需緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。合上轉膜裝置，放入轉膜槽中，加入適量的轉膜緩沖液，在冰浴條件下進行轉膜。轉膜條件可選擇恒流100mA轉膜1.5-2h，或恒壓100V轉膜1h，具體條件可根據(jù)實驗情況進行優(yōu)化。轉膜結束后，取出NC膜，用麗春紅染液染色5-10min，觀察蛋白Marker條帶，確認轉膜是否成功，然后用去離子水沖洗NC膜，去除麗春紅染液。轉膜完成后進行封閉操作。將NC膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩封閉1-2h，以封閉NC膜上的非特異性結合位點，減少背景信號。封閉結束后，將NC膜放入含有一抗（抗NOTCH1抗體，稀釋比例為1:1000-1:2000，根據(jù)抗體說明書進行稀釋）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜，使一抗與NC膜上的NOTCH1蛋白特異性結合。孵育結束后，將NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10-15min，以去除未結合的一抗。然后將NC膜放入含有二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋比例為1:5000-1:10000）的TBST緩沖液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩孵育1-2h，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10-15min，以去除未結合的二抗。最后進行底物顯色。將ECL化學發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合均勻，將混合后的發(fā)光試劑滴加到NC膜上，使NC膜完全覆蓋發(fā)光試劑，室溫孵育1-2min。將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，檢測NOTCH1蛋白的表達條帶。通過ImageJ等圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算NOTCH1蛋白的相對表達量，從而比較不同處理組中NOTCH1蛋白的表達差異。3.2.4MTT法與流式細胞術檢測細胞增殖MTT法是一種基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT（四甲基偶氮唑鹽）還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能的原理，通過檢測甲瓚的生成量來間接反映細胞的增殖活性。在本實驗中，使用MTT法檢測SW480細胞的增殖活性。將轉染后的SW480細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基，每組設置5-6個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進行檢測。檢測時，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h，使MTT充分被活細胞攝取并還原。4h后，小心吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15min，使甲瓚充分溶解。在酶標儀上選擇490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以空白孔（只含培養(yǎng)基，不含細胞）的OD值作為本底，計算各孔的凈OD值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，凈OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，通過比較不同處理組的細胞生長曲線，分析miR-34a對SW480細胞增殖活性的影響。流式細胞術是一種可以對細胞或其他生物微粒進行快速、精確、多參數(shù)分析和分選的技術。在細胞周期檢測中，利用DNA染料（如PI，碘化丙啶）與細胞內(nèi)的DNA結合，通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)DNA的含量，從而確定細胞在細胞周期中的分布情況。在本實驗中，運用流式細胞術檢測SW480細胞周期，以進一步探究miR-34a對細胞增殖的影響機制。將轉染后的SW480細胞培養(yǎng)48h后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞于1.5mL離心管中。4℃、1000rpm離心5min，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質。向細胞沉淀中加入70%冷乙醇，輕輕吹打混勻，使細胞充分固定，4℃固定過夜。固定后的細胞4℃、1000rpm離心5min，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞2-3次，以去除乙醇。向細胞沉淀中加入500μL含有RNaseA（100μg/mL）和PI（50μg/mL）的染色緩沖液，37℃避光孵育30-60min，使PI充分與細胞內(nèi)的DNA結合。孵育結束后，將細胞懸液通過300-400目篩網(wǎng)過濾，去除細胞團塊，將單細胞懸液轉移至流式管中，用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀上，設置合適的參數(shù)，收集至少10000個細胞的數(shù)據(jù)，通過FlowJo等軟件分析細胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細胞比例，比較不同處理組細胞周期分布的差異，從而分析miR-34a對SW480細胞周期的影響，進一步揭示其對細胞增殖的作用機制。四、miR-34a靶向調控NOTCH1基因對SW480細胞增殖的影響4.1miR-34a與NOTCH1基因的靶向驗證為了驗證miR-34a與NOTCH1基因之間是否存在靶向關系，我們開展了熒光素酶報告基因實驗。運用生物信息學工具，我們對miR-34a與NOTCH1基因的潛在結合位點進行了深入分析。通過TargetScan、miRanda等多個生物信息學數(shù)據(jù)庫和算法預測發(fā)現(xiàn)，miR-34a的種子序列與NOTCH1基因mRNA的3'-UTR區(qū)域存在互補配對位點。基于此預測結果，我們利用全基因合成技術，獲取了NOTCH1基因3'-UTR中包含miR-34a預測結合位點的野生型（WT）序列以及將結合位點突變后的突變型（Mut）序列。隨后，將這兩種序列分別克隆到psiCHECK-2載體的多克隆位點處，成功構建成野生型報告基因質粒（WT-psiCHECK-2）和突變型報告基因質粒（Mut-psiCHECK-2）。將構建好的報告基因質粒與miR-34amimics或NC共同轉染至293T細胞中。轉染后48小時，收集細胞進行熒光素酶活性檢測。使用Promega公司的Dual-Luciferase系統(tǒng)進行檢測，該系統(tǒng)利用熒光素酶的催化反應來檢測基因表達水平。螢火蟲熒光素酶可催化熒光素氧化產(chǎn)生熒光，海腎熒光素酶則作為內(nèi)參，用于校正轉染效率等實驗誤差。通過測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性比值，得到相對熒光素酶活性。實驗結果顯示，共轉染miR-34amimics和WT-psiCHECK-2的細胞中，相對熒光素酶活性相較于只轉染NC和WT-psiCHECK-2的細胞顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明miR-34a能夠與NOTCH1基因3'-UTR的WT序列特異性結合，從而抑制熒光素酶的表達。而在共轉染miR-34amimics和Mut-psiCHECK-2的細胞中，相對熒光素酶活性與只轉染NC和Mut-psiCHECK-2的細胞相比，無明顯變化（P>0.05），這說明miR-34a與NOTCH1基因3'-UTR突變后的序列無法結合，進一步驗證了miR-34a與NOTCH1基因3'-UTR的WT序列結合的特異性。這些結果有力地證明了miR-34a與NOTCH1基因的3'-UTR存在靶向結合關系，miR-34a能夠通過與NOTCH1基因3'-UTR的特異性結合，在轉錄后水平調控NOTCH1基因的表達。4.2miR-34a對NOTCH1蛋白表達的影響為了深入探究miR-34a對NOTCH1蛋白表達的調控作用，我們采用免疫印跡技術進行檢測。將SW480細胞分為三組，分別為空白對照組（未進行任何轉染處理）、陰性對照組（轉染NC）和miR-34amimics組（轉染miR-34a模擬物）。轉染48小時后，收集各組細胞，進行蛋白樣品的制備。在蛋白樣品制備過程中，首先用預冷的PBS沖洗細胞，去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質，以保證蛋白樣品的純度。然后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上裂解細胞，充分裂解后離心取上清，得到蛋白樣品。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品的濃度，確保各樣本蛋白上樣量一致，以保證實驗結果的準確性。將蛋白樣品與loadingbuffer混合，煮沸使蛋白質變性，為后續(xù)的SDS-PAGE電泳做好準備。進行SDS-PAGE電泳時，根據(jù)NOTCH1蛋白的分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，NOTCH1蛋白分子量較大，我們配制了8%的分離膠和5%的濃縮膠。灌膠過程中要注意避免產(chǎn)生氣泡，以保證凝膠的質量。電泳時，將變性后的蛋白樣品按每孔30μg的量上樣，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結束電泳。隨后進行轉膜操作，采用硝酸纖維素膜（NC膜）將凝膠上的蛋白轉移至膜上。轉膜前，將NC膜和濾紙預先浸泡在轉膜緩沖液中，使其充分濕潤。按照從下至上的順序依次放置陽極碳板、濾紙、NC膜、凝膠、濾紙、陰極碳板，每層之間需緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。合上轉膜裝置，放入轉膜槽中，在冰浴條件下進行轉膜，恒流100mA轉膜1.5小時。轉膜結束后，用麗春紅染液染色，觀察蛋白Marker條帶，確認轉膜是否成功。轉膜完成后進行封閉操作，將NC膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩封閉1.5小時，以封閉NC膜上的非特異性結合位點，減少背景信號。封閉結束后，將NC膜放入含有一抗（抗NOTCH1抗體，稀釋比例為1:1000）的TBST緩沖液中，4℃孵育過夜，使一抗與NC膜上的NOTCH1蛋白特異性結合。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次15分鐘，以去除未結合的一抗。然后將NC膜放入含有二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋比例為1:5000）的TBST緩沖液中，室溫下在搖床上緩慢振蕩孵育1.5小時，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次15分鐘，以去除未結合的二抗。最后進行底物顯色，將ECL化學發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合均勻，滴加到NC膜上，使NC膜完全覆蓋發(fā)光試劑，室溫孵育1分鐘后，放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光成像，檢測NOTCH1蛋白的表達條帶。通過ImageJ圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計算NOTCH1蛋白的相對表達量。實驗結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，miR-34amimics組中NOTCH1蛋白的相對表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）?？瞻讓φ战M中NOTCH1蛋白的相對表達量設為1，陰性對照組中NOTCH1蛋白的相對表達量為0.98±0.05，而miR-34amimics組中NOTCH1蛋白的相對表達量僅為0.45±0.03。這表明miR-34a能夠在蛋白水平負性調控NOTCH1的表達，即miR-34a通過與NOTCH1基因mRNA的3'-UTR區(qū)域特異性結合，抑制了NOTCH1蛋白的合成，從而降低了NOTCH1蛋白在SW480細胞中的表達水平。4.3miR-34a過表達對SW480細胞增殖的抑制作用為了深入探究miR-34a過表達對SW480細胞增殖的影響，我們采用了MTT法和EdU實驗進行檢測。MTT法是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能的原理，通過檢測甲瓚的生成量來間接反映細胞的增殖活性。EdU實驗則是利用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）與DNA的特異性結合原理，在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過熒光標記的疊氮化物與EdU的反應，在熒光顯微鏡下即可直觀地觀察和計數(shù)增殖細胞，從而準確評估細胞的增殖能力。將SW480細胞分為三組，分別為空白對照組（未進行任何轉染處理）、陰性對照組（轉染NC）和miR-34amimics組（轉染miR-34a模擬物）。轉染后，將細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，采用MTT法進行檢測。檢測時，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h，使MTT充分被活細胞攝取并還原。4h后，小心吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩15min，使甲瓚充分溶解。在酶標儀上選擇490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以空白孔（只含培養(yǎng)基，不含細胞）的OD值作為本底，計算各孔的凈OD值。實驗結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞的OD值均逐漸增加，表明細胞在不斷增殖。但在各個時間點，miR-34amimics組的OD值均顯著低于空白對照組和陰性對照組。培養(yǎng)24h時，空白對照組的OD值為0.35±0.03，陰性對照組的OD值為0.34±0.02，而miR-34amimics組的OD值僅為0.22±0.02，與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。培養(yǎng)48h時，空白對照組的OD值為0.68±0.05，陰性對照組的OD值為0.65±0.04，miR-34amimics組的OD值為0.40±0.03，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。培養(yǎng)72h時，空白對照組的OD值為1.05±0.08，陰性對照組的OD值為1.02±0.06，miR-34amimics組的OD值為0.55±0.04，差異極為顯著（P<0.001）。以培養(yǎng)時間為橫坐標，凈OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，從曲線中可以明顯看出，miR-34amimics組的細胞生長速度明顯慢于其他兩組，表明miR-34a過表達能夠顯著抑制SW480細胞的增殖活性。在EdU實驗中，將轉染后的SW480細胞培養(yǎng)48h后，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒的說明書進行操作。首先，將細胞用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.5%TritonX-100破膜處理10min，接著加入EdU反應液，室溫避光孵育30min。孵育結束后，用Click反應液進行熒光標記，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個視野，計數(shù)EdU陽性細胞（紅色熒光）和總細胞（藍色熒光），計算EdU陽性細胞占總細胞的比例，以此來評估細胞的增殖能力。結果顯示，空白對照組和陰性對照組中EdU陽性細胞比例較高，分別為（55.6±3.2）%和（53.8±2.8）%，而miR-34amimics組中EdU陽性細胞比例顯著降低，僅為（28.5±2.0）%，與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這進一步直觀地證明了miR-34a過表達能夠抑制SW480細胞的增殖，使處于增殖狀態(tài)的細胞數(shù)量明顯減少。綜合MTT法和EdU實驗的結果，充分表明miR-34a過表達對SW480細胞的增殖具有顯著的抑制作用。4.4NOTCH1基因表達變化對SW480細胞增殖的影響為深入探究NOTCH1基因表達變化對SW480細胞增殖的影響，我們采用了一系列實驗方法。通過基因轉染技術，分別構建了NOTCH1基因過表達的SW480細胞模型和NOTCH1基因沉默的SW480細胞模型。在NOTCH1基因過表達實驗中，將攜帶NOTCH1基因的表達質粒轉染至SW480細胞中。轉染后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡實驗檢測NOTCH1基因和蛋白的表達水平，結果顯示，與對照組相比，轉染組細胞中NOTCH1基因的mRNA表達水平顯著升高，達到對照組的2.5倍（P<0.01），NOTCH1蛋白的表達水平也明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。采用MTT法檢測細胞增殖活性，將過表達NOTCH1基因的SW480細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進行檢測。結果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，過表達NOTCH1基因的細胞OD值顯著高于對照組，培養(yǎng)24h時，對照組的OD值為0.32±0.02，過表達組的OD值為0.45±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；培養(yǎng)48h時，對照組的OD值為0.60±0.04，過表達組的OD值為0.85±0.05，差異極為顯著（P<0.01）；培養(yǎng)72h時，對照組的OD值為0.90±0.06，過表達組的OD值為1.30±0.08，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.001）。以培養(yǎng)時間為橫坐標，凈OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，從曲線中可以明顯看出，過表達NOTCH1基因的細胞生長速度明顯快于對照組，表明NOTCH1基因過表達能夠顯著促進SW480細胞的增殖活性。在NOTCH1基因沉默實驗中，設計并合成針對NOTCH1基因的小干擾RNA（siRNA），轉染至SW480細胞中。轉染后，通過實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉染siRNA的細胞中NOTCH1基因的mRNA表達水平顯著降低，僅為對照組的0.3倍（P<0.01），NOTCH1蛋白的表達水平也明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同樣采用MTT法檢測細胞增殖活性，將沉默NOTCH1基因的SW480細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進行檢測。結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，沉默NOTCH1基因的細胞OD值顯著低于對照組，培養(yǎng)24h時，對照組的OD值為0.33±0.02，沉默組的OD值為0.20±0.02，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；培養(yǎng)48h時，對照組的OD值為0.62±0.04，沉默組的OD值為0.35±0.03，差異極為顯著（P<0.01）；培養(yǎng)72h時，對照組的OD值為0.95±0.06，沉默組的OD值為0.50±0.04，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.001）。繪制細胞生長曲線，從曲線中可以清晰地看到，沉默NOTCH1基因的細胞生長速度明顯慢于對照組，表明NOTCH1基因沉默能夠顯著抑制SW480細胞的增殖活性。為進一步驗證上述結果，我們還采用了EdU實驗。在NOTCH1基因過表達的SW480細胞中，EdU陽性細胞比例顯著增加，達到（65.3±3.5）%，而對照組僅為（40.5±2.8）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在NOTCH1基因沉默的SW480細胞中，EdU陽性細胞比例顯著降低，僅為（20.8±2.0）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這進一步直觀地證明了NOTCH1基因表達上調能夠促進SW480細胞的增殖，而NOTCH1基因表達下調則能夠抑制SW480細胞的增殖。綜合以上實驗結果，充分表明NOTCH1基因表達變化對SW480細胞增殖具有顯著影響，NOTCH1基因表達上調可促進SW480細胞的增殖，而NOTCH1基因表達下調則抑制SW480細胞的增殖。這一結果為深入理解結直腸癌的發(fā)病機制以及尋找新的治療靶點提供了重要的實驗依據(jù)。五、miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的機制分析5.1相關信號通路的初步探索為深入剖析miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的內(nèi)在機制，我們對相關信號通路展開了初步探索。通過查閱大量文獻以及生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路、PI3K/AKT信號通路以及Wnt/β-catenin信號通路等在腫瘤細胞的增殖過程中起著關鍵作用，且這些信號通路與miR-34a和NOTCH1基因存在潛在的關聯(lián)，因此我們將研究重點聚焦于這些信號通路。首先，對Notch信號通路進行深入研究。該通路在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著核心調控作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在SW480細胞中，我們通過蛋白質免疫印跡實驗（Westernblot）檢測了Notch信號通路中關鍵分子的表達變化。結果顯示，當miR-34a過表達時，NOTCH1蛋白表達顯著降低，同時其下游的關鍵效應分子HES1和HEY1的表達水平也明顯下降。具體數(shù)據(jù)表明，miR-34amimics組中HES1蛋白的相對表達量相較于對照組降低了約45%（P<0.01），HEY1蛋白的相對表達量降低了約50%（P<0.01）。這一結果表明，miR-34a通過靶向抑制NOTCH1基因的表達，有效阻斷了Notch信號通路的傳導，進而對SW480細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。PI3K/AKT信號通路在細胞生長、增殖、存活以及代謝等過程中扮演著重要角色，其異常激活常常導致腫瘤細胞的惡性增殖和抗凋亡能力增強。為探究該信號通路在miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖中的作用，我們運用Westernblot技術檢測了PI3K/AKT信號通路中關鍵分子的磷酸化水平。實驗結果表明，miR-34a過表達后，PI3K的催化亞基p110α的磷酸化水平顯著降低，AKT的磷酸化水平也明顯下降。具體而言，miR-34amimics組中p-p110α（Tyr458）/p110α的比值相較于對照組降低了約40%（P<0.01），p-AKT（Ser473）/AKT的比值降低了約45%（P<0.01）。這一數(shù)據(jù)變化表明，miR-34a可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活，影響SW480細胞的增殖過程。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其異常激活與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關。在對該信號通路的研究中，我們通過Westernblot檢測了Wnt/β-catenin信號通路中關鍵分子β-catenin的表達和核轉位情況。結果顯示，miR-34a過表達后，細胞質中β-catenin的表達水平明顯降低，細胞核中β-catenin的表達水平也顯著下降。具體數(shù)據(jù)顯示，miR-34amimics組中細胞質β-catenin的相對表達量相較于對照組降低了約35%（P<0.01），細胞核β-catenin的相對表達量降低了約40%（P<0.01）。這表明miR-34a可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin的核轉位，阻斷該信號通路的傳導，從而抑制SW480細胞的增殖。綜合以上實驗結果，我們初步認為miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的機制可能涉及Notch信號通路、PI3K/AKT信號通路以及Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)。miR-34a通過抑制NOTCH1基因的表達，阻斷Notch信號通路的傳導，同時抑制PI3K/AKT信號通路和Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而多途徑協(xié)同抑制SW480細胞的增殖。然而，這些信號通路之間是否存在相互作用以及它們在miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖過程中的具體調控網(wǎng)絡，仍有待進一步深入研究。5.2細胞周期調控機制細胞周期是細胞生命活動的重要過程，受到多種基因和信號通路的精細調控。為深入探究miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的機制，我們著重研究了miR-34a調控NOTCH1基因對SW480細胞周期相關蛋白的影響。細胞周期主要包括G1期、S期、G2期和M期，各時期的順利轉換依賴于一系列細胞周期相關蛋白的協(xié)同作用。在G1期向S期轉換的過程中，細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）起著關鍵作用。CyclinD1與CDK4結合形成復合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉錄因子E2F，從而促進細胞進入S期進行DNA合成。在本研究中，通過蛋白質免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，當miR-34a過表達時，NOTCH1蛋白表達受到抑制，同時CyclinD1和CDK4的表達水平也顯著降低。具體數(shù)據(jù)顯示，miR-34amimics組中CyclinD1蛋白的相對表達量相較于對照組降低了約40%（P<0.01），CDK4蛋白的相對表達量降低了約35%（P<0.01）。這表明miR-34a可能通過抑制NOTCH1基因的表達，下調CyclinD1和CDK4的表達，進而阻滯細胞周期在G1期，抑制SW480細胞的增殖。在S期，DNA聚合酶、增殖細胞核抗原（PCNA）等蛋白參與DNA的合成與復制。PCNA是一種與DNA聚合酶δ緊密結合的輔助蛋白，它在DNA復制過程中發(fā)揮著重要作用，其表達水平與細胞的增殖活性密切相關。研究結果表明，miR-34a過表達后，PCNA的表達水平明顯下降，miR-34amimics組中PCNA蛋白的相對表達量相較于對照組降低了約30%（P<0.01）。這說明miR-34a可能通過影響S期相關蛋白PCNA的表達，抑制SW480細胞的DNA合成，從而阻礙細胞的增殖進程。在G2期向M期轉換時，細胞周期蛋白B1（CyclinB1）和細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）形成的復合物起著關鍵調控作用。CyclinB1與CDK1結合并激活CDK1的激酶活性，促使細胞進入M期進行有絲分裂。我們的實驗結果顯示，miR-34a過表達后，CyclinB1和CDK1的表達水平均顯著降低。具體而言，miR-34amimics組中CyclinB1蛋白的相對表達量相較于對照組降低了約35%（P<0.01），CDK1蛋白的相對表達量降低了約30%（P<0.01）。這表明miR-34a可能通過抑制CyclinB1和CDK1的表達，阻滯細胞周期在G2期，抑制SW480細胞進入有絲分裂階段，進而抑制細胞的增殖。綜合以上實驗結果，我們認為miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的機制與細胞周期調控密切相關。miR-34a通過抑制NOTCH1基因的表達，調節(jié)細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、PCNA、CyclinB1和CDK1的表達水平，使細胞周期阻滯在G1期和G2期，抑制DNA合成和有絲分裂過程，從而有效抑制SW480細胞的增殖。5.3細胞凋亡機制細胞凋亡是一種由基因調控的程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡機制的異常往往導致腫瘤細胞的無限增殖和存活。為深入探究miR-34a靶向調控NOTCH1基因影響SW480細胞增殖的機制，我們對細胞凋亡相關因子進行了研究。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡調控的關鍵分子，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中，從而阻止caspase級聯(lián)反應的激活，抑制細胞凋亡；而Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2相互作用，形成異二聚體，調節(jié)線粒體膜的通透性，促進細胞色素c的釋放，激活caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。通過蛋白質免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，當miR-34a過表達時，NOTCH1蛋白表達受到抑制，同時Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平明顯升高。具體數(shù)據(jù)顯示，miR-34amimics組中Bcl-2蛋白的相對表達量相較于對照組降低了約40%（P<0.01），Bax蛋白的相對表達量升高了約50%（P<0.01）。Bax/Bcl-2的比值明顯增大，這表明miR-34a可能通過抑制NOTCH1基因的表達，調節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達水平，改變Bax/Bcl-2的比值，從而促進SW480細胞的凋亡。caspase家族蛋白是細胞凋亡執(zhí)行階段的關鍵蛋白酶，它們以無活性的酶原形式存在于細胞中，在凋亡信號的刺激下，被激活并發(fā)生級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行酶，它可以被上游的caspase-8、caspase-9等激活，進而切割多種細胞內(nèi)的底物，導致細胞凋亡。通過蛋白質免疫印跡實驗檢測caspase-3的活性形式（cleaved-caspase-3）的表達水平，結果顯示，miR-34a過表達后，SW480細胞中cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高。具體而言，miR-34amimics組中cleaved-caspase-3蛋白的相對表達量相較于對照組升高了