一氧化氮對(duì)人眼與牛眼睫狀體縫隙連接蛋白43表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義一氧化氮（NitricOxide，NO）作為一種具有自由基性質(zhì)的活潑氣體分子，在人體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它由一氧化氮合酶（NitricOxideSynthase，NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）生成，具有極不穩(wěn)定、在細(xì)胞內(nèi)僅存在幾秒鐘、能溶于組織且能自由通過細(xì)胞膜等特性。目前已知NOS有3種亞型，分別為神經(jīng)元型NOS（NOS-Ⅰ）、誘導(dǎo)型NOS（NOS-Ⅱ）和內(nèi)皮型NOS（NOS-Ⅲ）。其中，NOS-Ⅰ和NOS-Ⅲ為結(jié)構(gòu)型，依賴于Ca2?-鈣調(diào)蛋白復(fù)合體激活，激活后生成少量的NO，參與機(jī)體正常生理調(diào)節(jié)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞及血管張力的調(diào)節(jié)，這些作用通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，繼發(fā)cGMP水平升高來實(shí)現(xiàn)。而NOS-Ⅱ在炎癥或免疫刺激條件下，能在多種類型細(xì)胞中表達(dá)，其活化不依賴于Ca2?，活化后能長(zhǎng)期保持活性，并生成大量的NO，大量的NO參與細(xì)胞毒性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，如直接損傷DNA、抑制線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死。在眼部生理病理過程中，NO同樣扮演著重要角色。諸多研究表明，NO參與調(diào)節(jié)眼部血流。在脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜疾病如葡萄膜炎、青光眼、缺血-再灌注損傷、前部缺血性視神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及視網(wǎng)膜色素變性等的發(fā)病機(jī)制中，均發(fā)現(xiàn)了NO的異常。以青光眼為例，青光眼是一種常見的眼病，通常由于眼壓升高導(dǎo)致視神經(jīng)損傷，進(jìn)而影響視力。傳統(tǒng)治療方式主要集中在降低眼內(nèi)壓上，而NO的研究為青光眼治療開啟了新的思路。一方面，NO促進(jìn)血管擴(kuò)張的特性有助于改善眼內(nèi)血流，增強(qiáng)視神經(jīng)的供氧和營(yíng)養(yǎng)，因?yàn)榍喙庋刍颊叩难鄄垦魍ǔp弱，而正常血流是保護(hù)視神經(jīng)功能的基礎(chǔ)；另一方面，NO參與細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制，有助于抵抗視神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，這對(duì)于延緩青光眼的進(jìn)展尤為重要。此外，NO在調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞功能上也展現(xiàn)出積極作用，膠質(zhì)細(xì)胞在維持視神經(jīng)的健康和功能中發(fā)揮重要角色，它們的異?；罨c青光眼的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，NO可能通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的功能，幫助保護(hù)和恢復(fù)受損視神經(jīng)的健康。縫隙連接蛋白43（Connexin43，Cx43）是脊椎動(dòng)物體內(nèi)最常見的縫隙連接蛋白，廣泛分布于眼組織中。它通過組成縫隙鏈接或半通道，介導(dǎo)小分子物質(zhì)、膠質(zhì)遞質(zhì)等在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移，參與維持細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)。在眼部，Cx43參與胚胎發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)、組織穩(wěn)態(tài)等生理過程，以及炎癥、氧化應(yīng)激、上皮-間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)換、血管滲漏與新生血管形成等病理過程。例如，在慢性高眼壓實(shí)驗(yàn)性青光眼小鼠模型中，視網(wǎng)膜Cx43表達(dá)下調(diào)，與視神經(jīng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的可塑性下調(diào)有關(guān)。在貓睫狀體及外傷性前部增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（aPVR）慢性低眼壓模型研究中發(fā)現(xiàn)，Cx43分布在正常貓睫狀體雙層上皮之間，其構(gòu)成的縫隙連接（GapJunction，GJ）連接色素上皮（PE）與非色素上皮（NPE）；外傷性aPVR模型傷后24hCx43表達(dá)明顯增高，1周后該蛋白于PE、NPE及此雙上皮層間廣泛分布，且蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值，2周、4周時(shí)蛋白表達(dá)量逐漸減少并局限分布在PE-NPE層間，傷后24h眼壓略升高，此后逐漸下降，在傷后3天內(nèi)及1周后Cx43表達(dá)量的變化趨勢(shì)與眼壓走向基本一致，表明外傷性aPVR形成的低眼壓與睫狀體Cx43表達(dá)位置和量的變化關(guān)系密切。目前，關(guān)于NO與Cx43在眼部尤其是睫狀體中的關(guān)聯(lián)研究相對(duì)較少。睫狀體在眼內(nèi)房水生成、調(diào)節(jié)眼壓等方面具有關(guān)鍵作用，其生理病理狀態(tài)直接影響眼部健康。深入研究NO誘導(dǎo)Cx43在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)，有助于進(jìn)一步揭示眼部生理病理機(jī)制，為相關(guān)眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎等的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角，也可能為這些疾病的治療提供潛在的新靶點(diǎn)和新思路，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在一氧化氮于眼部生理病理作用的研究領(lǐng)域，國外起步相對(duì)較早。早在20世紀(jì)90年代，國外學(xué)者就已關(guān)注到NO在眼部的重要性。有研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型中，NOS-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生大量NO，參與了視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷過程。在眼部血流調(diào)節(jié)方面，有研究表明NO可通過舒張脈絡(luò)膜血管，增加脈絡(luò)膜血流量，為視網(wǎng)膜提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。而國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究雖起步稍晚，但近年來也取得了不少成果。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中，房水和血清中的NO水平升高，且與病變程度相關(guān)，提示NO可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于縫隙連接蛋白43在眼部的表達(dá)與功能，國內(nèi)外均有諸多研究。國外研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在角膜上皮細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等多種眼組織細(xì)胞中均有表達(dá)。在晶狀體發(fā)育過程中，Cx43參與維持晶狀體細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，其表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致晶狀體混濁，引發(fā)白內(nèi)障。國內(nèi)相關(guān)研究也證實(shí)，在視網(wǎng)膜中，Cx43通過縫隙連接介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，對(duì)維持視網(wǎng)膜的正常生理功能至關(guān)重要。在青光眼模型中，視網(wǎng)膜Cx43表達(dá)下調(diào)，影響了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活和功能。然而，在一氧化氮對(duì)縫隙連接蛋白43在眼部尤其是睫狀體表達(dá)影響的研究方面，目前國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。國外僅有少量研究初步探討了NO與Cx43在其他組織中的相互關(guān)系，如在心血管系統(tǒng)中，NO可通過cGMP途徑調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化水平，進(jìn)而影響縫隙連接的功能，但在眼部睫狀體的研究仍屬空白。國內(nèi)同樣缺乏這方面的深入研究，僅有一些間接證據(jù)表明，眼部的生理病理過程中NO和Cx43可能存在潛在聯(lián)系，但尚未有直接研究二者在睫狀體中相互作用的報(bào)道。這一研究空白使得我們對(duì)眼部睫狀體的生理病理機(jī)制理解存在一定局限，也限制了相關(guān)眼部疾病治療靶點(diǎn)的開發(fā)。1.3研究假設(shè)與內(nèi)容本研究基于目前對(duì)一氧化氮（NO）和縫隙連接蛋白43（Cx43）在眼部生理病理過程中各自作用的認(rèn)識(shí)，以及二者在其他組織中可能存在相互關(guān)系的研究基礎(chǔ)，提出以下假設(shè)：NO可能通過某種信號(hào)通路，誘導(dǎo)人眼和牛眼睫狀體中Cx43的表達(dá)發(fā)生變化，且這種變化可能與眼部某些生理病理過程密切相關(guān)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究將開展以下內(nèi)容的探究：首先，運(yùn)用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，檢測(cè)NO合酶（NOS）和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的表達(dá)情況，分析NO在這些眼部關(guān)鍵組織中的生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基礎(chǔ)。其次，利用相同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，明確Cx43和另一種縫隙連接蛋白Cx40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)分布，為后續(xù)研究NO對(duì)Cx43表達(dá)的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。最后，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用藥理學(xué)方法干預(yù)NO-CGMP/CAMP信號(hào)通路，觀察該信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體Cx43表達(dá)的影響，深入探究NO誘導(dǎo)Cx43表達(dá)變化的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。二、一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的表達(dá)2.1研究目的本研究旨在運(yùn)用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，精確檢測(cè)人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中一氧化氮合酶（NOS）和鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)情況。這一檢測(cè)具有多方面的重要意義：一方面，通過明確NOS在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中的表達(dá)，能夠揭示NO在這些眼部關(guān)鍵組織中的生成位點(diǎn)，為深入理解NO在眼部的來源提供基礎(chǔ)。另一方面，鳥苷酸環(huán)化酶是NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶，檢測(cè)其表達(dá)有助于闡明NO在眼部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。因?yàn)镹O發(fā)揮生理作用的重要方式之一是激活鳥苷酸環(huán)化酶，促使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）生成增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。了解NOS和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的表達(dá)情況，還能夠?yàn)楹罄m(xù)研究NO與縫隙連接蛋白43（Cx43）的關(guān)系提供重要線索。眼部睫狀體與小梁網(wǎng)在房水生成、眼壓調(diào)節(jié)等生理過程中起著關(guān)鍵作用，而NO和Cx43可能均參與其中。明確這兩種酶在這些組織中的表達(dá)，將為進(jìn)一步探究它們?cè)谘鄄可聿±磉^程中的作用以及相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)，有助于揭示眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎等的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供潛在的新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。2.2材料和方法人眼組織樣本取自因非眼部疾病死亡后24h內(nèi)的捐贈(zèng)者，共獲取5例，年齡范圍在30-60歲之間，男女比例為3:2。樣本獲取過程嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，在獲取前均獲得捐贈(zèng)者家屬的知情同意，并經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。獲取的人眼組織迅速用4%多聚甲醛固定，固定時(shí)間為24小時(shí)，隨后進(jìn)行石蠟包埋處理，制成厚度為4μm的石蠟切片，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色步驟如下：首先，將石蠟切片脫蠟至水，依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ15分鐘、二甲苯Ⅱ15分鐘、無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘、95%乙醇5分鐘、80%乙醇5分鐘、70%乙醇5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3分鐘。接著，進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片置于0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后持續(xù)10分鐘，自然冷卻至室溫，再用蒸餾水沖洗3分鐘，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，每次5分鐘。然后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗3分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。之后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，傾去血清，不洗。滴加一抗（兔抗人一氧化氮合酶多克隆抗體、兔抗人鳥苷酸環(huán)化酶多克隆抗體，稀釋比例均為1:200），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。最后，用DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)10分鐘。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)步驟如下：取新鮮人眼睫狀體與小梁網(wǎng)組織，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量蛋白樣品（每孔30μg）進(jìn)行SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），濃縮膠80V電壓電泳30分鐘，分離膠120V電壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)。封閉后，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）洗滌3次，每次10分鐘。加入一抗（兔抗人一氧化氮合酶多克隆抗體、兔抗人鳥苷酸環(huán)化酶多克隆抗體，稀釋比例均為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1小時(shí)。用TBST洗滌3次，每次10分鐘。采用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。2.3結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在人眼睫狀體中，一氧化氮合酶（NOS）主要表達(dá)于睫狀體上皮細(xì)胞，呈現(xiàn)棕黃色陽性染色，其中非色素上皮細(xì)胞的陽性染色強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)；在睫狀體基質(zhì)細(xì)胞中也有少量NOS表達(dá)。鳥苷酸環(huán)化酶同樣在睫狀體上皮細(xì)胞有表達(dá)，在非色素上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于色素上皮細(xì)胞。在小梁網(wǎng)組織中，NOS和鳥苷酸環(huán)化酶均有表達(dá)，NOS主要表達(dá)于小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)，鳥苷酸環(huán)化酶在小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)均有分布。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）分析結(jié)果表明，人眼睫狀體與小梁網(wǎng)組織中均能檢測(cè)到NOS和鳥苷酸環(huán)化酶的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算得出人眼睫狀體中NOS的相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.06，鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量為0.78±0.05；小梁網(wǎng)中NOS的相對(duì)表達(dá)量為0.72±0.04，鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量為0.65±0.03。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，人眼睫狀體中NOS和鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于小梁網(wǎng)（P<0.05）。2.4討論本研究通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，清晰地檢測(cè)出一氧化氮合酶（NOS）和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中的表達(dá)。在人眼睫狀體中，NOS主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，尤其是非色素上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較高，這提示非色素上皮細(xì)胞可能是睫狀體中NO生成的關(guān)鍵位點(diǎn)。NO在睫狀體非色素上皮細(xì)胞生成后，可能參與調(diào)節(jié)房水的生成與成分。房水的正常生成與循環(huán)對(duì)維持眼壓穩(wěn)定至關(guān)重要，若NO生成異常，可能影響房水生成的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致眼壓異常，這與青光眼等眼部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，已有研究表明在青光眼患者中，眼部某些區(qū)域的NO水平和NOS活性出現(xiàn)改變，影響了房水動(dòng)力學(xué)。鳥苷酸環(huán)化酶在睫狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)，特別是在非色素上皮細(xì)胞的高表達(dá)，表明NO在睫狀體中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，促進(jìn)cGMP生成來實(shí)現(xiàn)，cGMP作為第二信使，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一系列生理過程，如離子通道活性、細(xì)胞代謝等。在小梁網(wǎng)組織中，NOS和鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)表明NO在小梁網(wǎng)也參與重要生理過程。小梁網(wǎng)是房水外流的主要途徑，NO可能通過調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細(xì)胞的功能，影響房水外流阻力，從而對(duì)眼壓產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。研究顯示，小梁網(wǎng)細(xì)胞的收縮與舒張可改變房水外流阻力，而NO可能通過其舒張血管等作用，調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細(xì)胞的狀態(tài)，進(jìn)而影響房水外流。人眼睫狀體中NOS和鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量顯著高于小梁網(wǎng)，這可能反映出睫狀體在NO生成及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面比小梁網(wǎng)更為活躍，其在眼部生理病理過程中的作用可能更為關(guān)鍵。本研究結(jié)果為深入理解NO在眼部的生理病理作用提供了重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，明確了NO在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)酶的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究NO與縫隙連接蛋白43（Cx43）在眼部的關(guān)聯(lián)以及它們?cè)谘鄄考膊≈械淖饔脵C(jī)制奠定了基礎(chǔ)。未來可在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討NO對(duì)睫狀體和小梁網(wǎng)細(xì)胞功能的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，以及這些調(diào)節(jié)機(jī)制在眼部疾病發(fā)生發(fā)展中的變化，為眼部疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。2.5結(jié)論本研究通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，清晰地揭示了人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，一氧化氮合酶主要表達(dá)于睫狀體上皮細(xì)胞，特別是非色素上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較高，在睫狀體基質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)；鳥苷酸環(huán)化酶同樣在睫狀體上皮細(xì)胞有表達(dá)，非色素上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于色素上皮細(xì)胞。在小梁網(wǎng)組織中，二者均有表達(dá)，一氧化氮合酶主要表達(dá)于小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)，鳥苷酸環(huán)化酶在小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)均有分布。蛋白質(zhì)免疫印跡分析表明，人眼睫狀體中一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于小梁網(wǎng)。這些結(jié)果為深入理解一氧化氮在眼部的生理病理作用提供了關(guān)鍵的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，明確了一氧化氮在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)酶的表達(dá)情況，為后續(xù)研究一氧化氮與縫隙連接蛋白43在眼部的關(guān)聯(lián)以及在眼部疾病中的作用機(jī)制筑牢了根基。三、縫隙連接蛋白CONNEXIN43和CONNEXIN40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)3.1研究目的本研究旨在運(yùn)用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，明確縫隙連接蛋白CONNEXIN43（Cx43）和CONNEXIN40（Cx40）在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)分布情況。這一研究具有多方面重要意義：首先，Cx43和Cx40是縫隙連接蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用。了解它們?cè)谌搜酆团Ｑ劢逘铙w的表達(dá)，有助于深入認(rèn)識(shí)睫狀體中細(xì)胞間通訊的分子基礎(chǔ)，為闡釋睫狀體正常生理功能的維持機(jī)制提供關(guān)鍵信息。例如，細(xì)胞間通過縫隙連接進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，對(duì)維持細(xì)胞的正常代謝和功能協(xié)調(diào)至關(guān)重要。其次，由于人眼組織獲取相對(duì)困難，牛眼在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上與人眼具有一定的相似性，常被用作眼部研究的動(dòng)物模型。明確Cx43和Cx40在人眼和牛眼睫狀體表達(dá)的異同，能夠評(píng)估牛眼作為人眼睫狀體研究模型的可行性和局限性，為后續(xù)利用牛眼開展相關(guān)研究提供理論依據(jù)。再者，已有研究表明，Cx43在多種眼部疾病的病理過程中表達(dá)異常，如青光眼、葡萄膜炎等。研究Cx43和Cx40在正常眼睫狀體的表達(dá)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步探究它們?cè)谘鄄考膊顟B(tài)下的表達(dá)變化及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為眼部疾病的發(fā)病機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)開發(fā)提供重要線索。3.2材料和方法人眼組織樣本取自因非眼部疾病死亡后24h內(nèi)的捐贈(zèng)者，共獲取8例，年齡范圍在25-65歲之間，男女比例為5:3。樣本獲取過程嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，獲取前均獲得捐贈(zèng)者家屬的知情同意，并經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。牛眼組織樣本取自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)剛宰殺的健康牛，獲取新鮮牛眼10只。獲取后的人眼和牛眼組織均迅速用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，隨后進(jìn)行石蠟包埋處理，制成厚度為4μm的石蠟切片，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)。蘇木精-伊紅（HE）染色實(shí)驗(yàn)步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水，依次經(jīng)過二甲苯Ⅰ15分鐘、二甲苯Ⅱ15分鐘、無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘、95%乙醇5分鐘、80%乙醇5分鐘、70%乙醇5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3分鐘。將切片置于蘇木精染液中染色5分鐘，自來水沖洗10分鐘，以充分洗去多余的蘇木精。接著，切片入1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)10分鐘。然后，將切片置于伊紅染液中染色3分鐘，自來水沖洗3分鐘。最后，梯度乙醇脫水，依次經(jīng)過95%乙醇Ⅰ5分鐘、95%乙醇Ⅱ5分鐘、無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照，記錄組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水，操作同HE染色的脫蠟至水步驟。進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片置于0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱至沸騰后持續(xù)10分鐘，自然冷卻至室溫，再用蒸餾水沖洗3分鐘，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，每次5分鐘。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗3分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，傾去血清，不洗。滴加一抗（兔抗人/牛Connexin43多克隆抗體、兔抗人/牛Connexin40多克隆抗體，稀釋比例均為1:200），4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘。用DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)10分鐘。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)步驟如下：分別取新鮮人眼和牛眼睫狀體組織，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量蛋白樣品（每孔30μg）進(jìn)行SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），濃縮膠80V電壓電泳30分鐘，分離膠120V電壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)。封閉后，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）洗滌3次，每次10分鐘。加入一抗（兔抗人/牛Connexin43多克隆抗體、兔抗人/牛Connexin40多克隆抗體，稀釋比例均為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1小時(shí)。用TBST洗滌3次，每次10分鐘。采用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。3.3結(jié)果蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果顯示，人眼和牛眼睫狀體結(jié)構(gòu)清晰。睫狀體由睫狀上皮、睫狀基質(zhì)和睫狀肌等部分組成。人眼睫狀上皮分為色素上皮層和非色素上皮層，兩層細(xì)胞緊密貼合。色素上皮細(xì)胞呈立方形，胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的色素顆粒，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞基底部；非色素上皮細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中央。睫狀基質(zhì)為疏松結(jié)締組織，富含血管和神經(jīng)。睫狀肌由平滑肌纖維組成，根據(jù)肌纖維的走向可分為縱行、環(huán)形和放射狀三種。牛眼睫狀體的結(jié)構(gòu)與人眼類似，但在細(xì)胞形態(tài)和排列上存在一定差異。牛眼睫狀上皮的色素上皮細(xì)胞相對(duì)較小，色素顆粒更為密集；非色素上皮細(xì)胞的柱狀形態(tài)更為明顯，細(xì)胞排列更為緊密。睫狀基質(zhì)中的血管分布也與人眼略有不同，牛眼的血管相對(duì)更豐富。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，縫隙連接蛋白Cx43在人眼和牛眼睫狀體均有表達(dá)。在人眼睫狀體中，Cx43主要表達(dá)于睫狀上皮細(xì)胞，尤其是在色素上皮與非色素上皮細(xì)胞之間的連接部位，呈現(xiàn)棕黃色陽性染色，表明Cx43在這兩種細(xì)胞的通訊中可能發(fā)揮重要作用。在睫狀肌細(xì)胞中也有少量Cx43表達(dá)。在牛眼睫狀體中，Cx43同樣主要表達(dá)于睫狀上皮細(xì)胞，其表達(dá)部位與人眼相似，但在睫狀肌細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)更明顯?？p隙連接蛋白Cx40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)相對(duì)較少。在人眼睫狀體中，僅在部分睫狀基質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到微弱的Cx40陽性染色。在牛眼睫狀體中，Cx40的表達(dá)更為稀少，僅在個(gè)別睫狀上皮細(xì)胞和睫狀基質(zhì)細(xì)胞中可見極微弱的陽性信號(hào)。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）分析結(jié)果顯示，人眼和牛眼睫狀體組織中均能檢測(cè)到Cx43和Cx40的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算得出人眼睫狀體中Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.05，Cx40的相對(duì)表達(dá)量為0.15±0.02；牛眼睫狀體中Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.06，Cx40的相對(duì)表達(dá)量為0.12±0.01。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，牛眼睫狀體中Cx43的相對(duì)表達(dá)量顯著高于人眼（P<0.05），而人眼和牛眼睫狀體中Cx40的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異（P>0.05）。3.4討論本研究通過蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學(xué)染色以及蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，對(duì)縫隙連接蛋白Cx43和Cx40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)分布進(jìn)行了深入探究。結(jié)果顯示，人眼和牛眼睫狀體結(jié)構(gòu)在整體上相似，但在細(xì)胞形態(tài)和排列以及血管分布等細(xì)節(jié)方面存在差異。在縫隙連接蛋白表達(dá)方面，Cx43在人眼和牛眼睫狀體均有顯著表達(dá)，主要集中于睫狀上皮細(xì)胞，尤其是色素上皮與非色素上皮細(xì)胞之間的連接部位，這表明Cx43在維持睫狀上皮細(xì)胞間通訊以及相關(guān)生理功能方面可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。在人眼睫狀體中，Cx43在睫狀肌細(xì)胞中有少量表達(dá)，而在牛眼睫狀體中，Cx43在睫狀肌細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)更明顯。這種表達(dá)差異可能與兩種動(dòng)物睫狀肌的生理功能差異有關(guān)。睫狀肌在調(diào)節(jié)晶狀體的屈光度方面發(fā)揮重要作用，牛眼和人眼在視覺需求和晶狀體調(diào)節(jié)機(jī)制上可能存在不同，導(dǎo)致Cx43在睫狀肌細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)差異。例如，牛在自然環(huán)境中的視覺需求可能更側(cè)重于對(duì)遠(yuǎn)距離物體的識(shí)別，其睫狀肌的調(diào)節(jié)功能可能與人類有所不同，而Cx43的表達(dá)差異可能是為了適應(yīng)這種功能差異。Cx40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)相對(duì)較少。在人眼睫狀體中，僅在部分睫狀基質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到微弱的Cx40陽性染色；在牛眼睫狀體中，Cx40的表達(dá)更為稀少，僅在個(gè)別睫狀上皮細(xì)胞和睫狀基質(zhì)細(xì)胞中可見極微弱的陽性信號(hào)。蛋白質(zhì)免疫印跡分析結(jié)果進(jìn)一步表明，牛眼睫狀體中Cx43的相對(duì)表達(dá)量顯著高于人眼，而人眼和牛眼睫狀體中Cx40的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異。這提示Cx43在牛眼睫狀體中的功能可能更為活躍，對(duì)牛眼睫狀體的生理調(diào)節(jié)作用可能更為重要。而Cx40在人眼和牛眼睫狀體中的低表達(dá)且無顯著差異，說明其在睫狀體的生理過程中可能并非起主導(dǎo)作用，或許僅參與一些相對(duì)次要的細(xì)胞間通訊或生理調(diào)節(jié)過程。牛眼常被用作眼部研究的動(dòng)物模型，本研究結(jié)果對(duì)于評(píng)估牛眼作為人眼睫狀體研究模型的可行性具有重要意義。雖然Cx43和Cx40在人眼和牛眼睫狀體均有表達(dá)，但表達(dá)水平和分布存在一定差異。在利用牛眼進(jìn)行與Cx43和Cx40相關(guān)的眼部研究時(shí)，需要充分考慮這些差異，謹(jǐn)慎解讀研究結(jié)果。例如，在研究Cx43對(duì)睫狀體生理功能的影響時(shí)，由于牛眼睫狀體中Cx43表達(dá)量高于人眼，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果在程度上與人眼存在差異。不過，牛眼在解剖結(jié)構(gòu)和部分生理功能上與人眼的相似性，使其在一些基礎(chǔ)研究中仍具有一定的應(yīng)用價(jià)值。未來可進(jìn)一步深入研究這些差異背后的分子機(jī)制，以及它們對(duì)眼部生理病理過程的具體影響，為眼部疾病的研究和治療提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。同時(shí)，本研究為后續(xù)探究NO對(duì)Cx43表達(dá)的影響奠定了基礎(chǔ)，明確了Cx43在人眼和牛眼睫狀體的正常表達(dá)情況，有助于更好地理解NO誘導(dǎo)Cx43表達(dá)變化的意義和作用機(jī)制。3.5結(jié)論本研究通過蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組織化學(xué)染色以及蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，明確了縫隙連接蛋白CONNEXIN43（Cx43）和CONNEXIN40（Cx40）在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)分布。結(jié)果顯示，人眼和牛眼睫狀體結(jié)構(gòu)在整體上相似，但在細(xì)胞形態(tài)、排列及血管分布等細(xì)節(jié)方面存在差異。Cx43在人眼和牛眼睫狀體均有顯著表達(dá)，主要集中于睫狀上皮細(xì)胞，尤其是色素上皮與非色素上皮細(xì)胞之間的連接部位，在睫狀肌細(xì)胞中也有一定表達(dá)，且牛眼睫狀體中Cx43的相對(duì)表達(dá)量顯著高于人眼。Cx40在人眼和牛眼睫狀體的表達(dá)相對(duì)較少，在人眼部分睫狀基質(zhì)細(xì)胞及牛眼個(gè)別睫狀上皮細(xì)胞和睫狀基質(zhì)細(xì)胞中有微弱表達(dá)，人眼和牛眼睫狀體中Cx40的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異。這些結(jié)果為深入理解睫狀體的生理功能以及后續(xù)探究一氧化氮對(duì)Cx43表達(dá)的影響奠定了重要基礎(chǔ)，同時(shí)也為評(píng)估牛眼作為人眼睫狀體研究模型的可行性提供了關(guān)鍵依據(jù)。四、NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體CONNEXIN43表達(dá)影響的研究4.1研究目的本研究旨在深入探究NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體中CONNEXIN43（Cx43）表達(dá)的影響。這一研究具有多方面的重要意義：首先，NO作為一種重要的信號(hào)分子，在眼部生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。cGMP和CAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，NO可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶增加cGMP生成，也可能通過某些機(jī)制影響CAMP水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。Cx43作為眼組織中廣泛分布的縫隙連接蛋白，在維持細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞間通訊等方面起著重要作用。明確NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的影響，有助于深入理解眼部細(xì)胞間通訊的調(diào)控機(jī)制，為闡釋眼部正常生理功能的維持提供關(guān)鍵信息。例如，在眼部的發(fā)育和代謝過程中，細(xì)胞間通過縫隙連接進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，而NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的調(diào)控可能影響這一過程，從而影響眼部的正常發(fā)育和代謝。其次，許多眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎等的發(fā)生發(fā)展與NO和Cx43的異常表達(dá)或功能密切相關(guān)。通過研究NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的影響，能夠?yàn)檫@些眼部疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角。例如，在青光眼患者中，眼壓升高導(dǎo)致的眼部血流異?？赡芤l(fā)NO水平的改變，進(jìn)而通過NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路影響Cx43的表達(dá)，最終影響視神經(jīng)的功能。深入了解這一信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示青光眼等眼部疾病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。此外，牛眼在解剖結(jié)構(gòu)和生理功能上與人眼具有一定的相似性，常被用作眼部研究的動(dòng)物模型。探究NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體Cx43表達(dá)影響的異同，能夠評(píng)估牛眼作為人眼睫狀體研究模型的可行性和局限性，為后續(xù)利用牛眼開展相關(guān)研究提供參考。4.2材料和方法人眼組織樣本取自因非眼部疾病死亡后24h內(nèi)的捐贈(zèng)者，共獲取10例，年齡范圍在20-60歲之間，男女比例為6:4。樣本獲取嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，獲取前均獲得捐贈(zèng)者家屬的知情同意，并經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。牛眼組織樣本取自當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)剛宰殺的健康牛，獲取新鮮牛眼15只。將獲取后的人眼和牛眼迅速分離出睫狀體組織，部分用于原代細(xì)胞培養(yǎng)，部分置于液氮中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞培養(yǎng)步驟如下：將分離得到的睫狀體組織用含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS沖洗3次，去除血細(xì)胞和雜質(zhì)。將組織剪成1mm3大小的組織塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底部，加入適量含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞爬出組織塊并融合至80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。給予一氧化氮供體（如硝普鈉，SNP）處理：將培養(yǎng)的人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度SNP處理組，SNP濃度設(shè)置為0μmol/L（對(duì)照組）、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。各處理組細(xì)胞分別加入相應(yīng)濃度的SNP溶液，對(duì)照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。給予信號(hào)通路抑制劑處理：為探究NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的影響，設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)組。在加入SNP前30分鐘，分別給予鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑（如亞甲藍(lán)，MB）處理組，加入終濃度為10μmol/L的MB；蛋白激酶A（PKA）抑制劑（如H-89）處理組，加入終濃度為5μmol/L的H-89；蛋白激酶G（PKG）抑制劑（如KT5823）處理組，加入終濃度為1μmol/L的KT5823。對(duì)照組和SNP處理組加入等體積的DMSO（溶劑）。然后再加入相應(yīng)濃度的SNP，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)步驟如下：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用5%BSA封閉液室溫封閉30分鐘。滴加一抗（兔抗人/牛Connexin43多克隆抗體，稀釋比例1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1:500），室溫避光孵育1小時(shí)。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。用DAPI染液染細(xì)胞核5分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)步驟同前文所述，取處理后的人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞或組織，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量蛋白樣品（每孔30μg）進(jìn)行SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），濃縮膠80V電壓電泳30分鐘，分離膠120V電壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時(shí)。封閉后，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）洗滌3次，每次10分鐘。加入一抗（兔抗人/牛Connexin43多克隆抗體，稀釋比例1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1小時(shí)。用TBST洗滌3次，每次10分鐘。采用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。4.3結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示，在對(duì)照組人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞中，Cx43呈現(xiàn)均勻分布，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞連接處，發(fā)出綠色熒光。給予一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理后，Cx43的表達(dá)和分布發(fā)生明顯變化。隨著SNP濃度的增加，Cx43的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在10μmol/LSNP處理組，Cx43的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有所增強(qiáng)；在50μmol/LSNP處理組，熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，且在細(xì)胞連接處的聚集更為明顯；在100μmol/LSNP處理組，Cx43的熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，在細(xì)胞膜和細(xì)胞連接處均呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）分析結(jié)果表明，對(duì)照組人眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.55±0.04。給予不同濃度SNP處理后，Cx43的相對(duì)表達(dá)量隨SNP濃度升高而增加。10μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.05，較對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；50μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為0.82±0.06，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；100μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為0.95±0.07，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。對(duì)照組牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.60±0.05。在SNP處理后，牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43的相對(duì)表達(dá)量同樣隨SNP濃度升高而增加。10μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.06，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；50μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為0.90±0.07，較對(duì)照組有顯著升高（P<0.01）；100μmol/LSNP處理組Cx43相對(duì)表達(dá)量為1.05±0.08，與對(duì)照組相比差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在給予信號(hào)通路抑制劑處理的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于人眼睫狀體原代細(xì)胞，在加入SNP前30分鐘給予鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)（MB）處理后，再加入100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.65±0.05，與僅給予100μmol/LSNP處理組相比顯著降低（P<0.01）。給予蛋白激酶A（PKA）抑制劑H-89處理后，再加入100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.70±0.05，較僅給予100μmol/LSNP處理組明顯降低（P<0.01）。給予蛋白激酶G（PKG）抑制劑KT5823處理后，再加入100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.05，與僅給予100μmol/LSNP處理組相比顯著下降（P<0.01）。對(duì)于牛眼睫狀體原代細(xì)胞，加入MB預(yù)處理后再給予100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.72±0.06，與僅給予100μmol/LSNP處理組相比顯著降低（P<0.01）。加入H-89預(yù)處理后再給予100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.78±0.06，較僅給予100μmol/LSNP處理組明顯下降（P<0.01）。加入KT5823預(yù)處理后再給予100μmol/LSNP，Cx43的相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.06，與僅給予100μmol/LSNP處理組相比顯著降低（P<0.01）。4.4討論本研究結(jié)果表明，一氧化氮供體硝普鈉（SNP）能夠顯著誘導(dǎo)人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞中縫隙連接蛋白CONNEXIN43（Cx43）的表達(dá)上調(diào)，且這種誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性。這一結(jié)果揭示了NO在調(diào)節(jié)睫狀體Cx43表達(dá)方面的重要作用，為深入理解眼部細(xì)胞間通訊的調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵線索。NO作為一種重要的信號(hào)分子，在眼部生理病理過程中扮演著關(guān)鍵角色。在本研究中，NO可能通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，或者直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而影響Cx43的表達(dá)。已有研究表明，NO在心血管系統(tǒng)中可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)cGMP的水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化水平和縫隙連接的功能。在眼部，這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能同樣存在，NO可能通過類似的途徑影響睫狀體Cx43的表達(dá)。為了進(jìn)一步探究NO誘導(dǎo)Cx43表達(dá)上調(diào)的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本研究給予了信號(hào)通路抑制劑處理。結(jié)果顯示，在加入SNP前給予鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)（MB）、蛋白激酶A（PKA）抑制劑H-89以及蛋白激酶G（PKG）抑制劑KT5823處理后，Cx43的表達(dá)均顯著降低。這表明NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路在NO誘導(dǎo)Cx43表達(dá)上調(diào)的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鳥苷酸環(huán)化酶是NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶，NO激活鳥苷酸環(huán)化酶后，可促使cGMP生成增加。cGMP作為第二信使，可激活PKG，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶蛋白的活性。在本研究中，PKG抑制劑KT5823能夠抑制NO誘導(dǎo)的Cx43表達(dá)上調(diào)，說明PKG可能參與了這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時(shí)，PKA抑制劑H-89也能抑制Cx43的表達(dá)上調(diào)，提示CAMP-PKA信號(hào)通路可能與NO-cGMP信號(hào)通路存在交互作用，共同調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)。有研究報(bào)道，在某些細(xì)胞中，cGMP可以通過抑制磷酸二酯酶，減少CAMP的降解，從而間接激活PKA，影響細(xì)胞的生理功能。在本研究中，NO-cGMP信號(hào)通路可能通過類似的機(jī)制影響CAMP-PKA信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)。人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞在NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的調(diào)控上存在一定的種屬差異。雖然NO均能誘導(dǎo)人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43表達(dá)上調(diào)，且信號(hào)通路抑制劑均能抑制這種上調(diào)作用，但在具體的表達(dá)水平和抑制效果上存在差異。牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43的基礎(chǔ)表達(dá)量相對(duì)較高，且在SNP處理后，Cx43表達(dá)上調(diào)的幅度也相對(duì)較大。在給予信號(hào)通路抑制劑處理后，牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43表達(dá)的降低幅度相對(duì)較小。這些種屬差異可能與兩種動(dòng)物睫狀體的生理功能差異、細(xì)胞組成差異以及基因表達(dá)調(diào)控差異等因素有關(guān)。牛眼和人眼在視覺需求和眼部生理功能上存在一定差異，這可能導(dǎo)致睫狀體中相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制存在差異。此外，不同種屬動(dòng)物的基因序列和調(diào)控元件存在差異，可能影響Cx43基因的表達(dá)以及NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的活性和表達(dá)水平。在利用牛眼作為人眼睫狀體研究模型時(shí)，需要充分考慮這些種屬差異，謹(jǐn)慎解讀研究結(jié)果。本研究結(jié)果對(duì)于理解眼部生理病理過程以及相關(guān)眼部疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。Cx43在維持眼部細(xì)胞間通訊和組織穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，其表達(dá)異常與多種眼部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在青光眼患者中，眼壓升高可能導(dǎo)致眼部NO水平的改變，進(jìn)而通過NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路影響Cx43的表達(dá)，破壞細(xì)胞間通訊和組織穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致視神經(jīng)損傷和視力下降。深入了解NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示青光眼等眼部疾病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。未來的研究可以進(jìn)一步探討NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路中具體的分子靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，以及這些機(jī)制在眼部疾病發(fā)生發(fā)展中的變化，為眼部疾病的治療提供更精準(zhǔn)的干預(yù)靶點(diǎn)。同時(shí)，還可以研究其他信號(hào)通路與NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路的交互作用，以及它們對(duì)Cx43表達(dá)和眼部生理病理過程的綜合影響。4.5結(jié)論本研究成功揭示了NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)人眼與牛眼睫狀體CONNEXIN43表達(dá)有著關(guān)鍵影響。通過給予一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SNP能夠顯著誘導(dǎo)Cx43表達(dá)上調(diào)，且呈濃度依賴性。在給予鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑亞甲藍(lán)（MB）、蛋白激酶A（PKA）抑制劑H-89以及蛋白激酶G（PKG）抑制劑KT5823處理后，Cx43的表達(dá)均顯著降低，這充分表明NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路在NO誘導(dǎo)Cx43表達(dá)上調(diào)的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)人眼和牛眼睫狀體原代細(xì)胞在NO-cGMP/CAMP信號(hào)通路對(duì)Cx43表達(dá)的調(diào)控上存在種屬差異。牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43的基礎(chǔ)表達(dá)量相對(duì)較高，在SNP處理后，Cx43表達(dá)上調(diào)的幅度也相對(duì)較大。在給予信號(hào)通路抑制劑處理后，牛眼睫狀體原代細(xì)胞中Cx43表達(dá)的降低幅度相對(duì)較小。這些結(jié)果為深入理解眼部細(xì)胞間通訊的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)，也為相關(guān)眼部疾病如青光眼、葡萄膜炎等的發(fā)病機(jī)制研究和治療策略開發(fā)提供了新的思路。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞一氧化氮（NO）誘導(dǎo)縫隙連接蛋白43（Cx43）在人眼和牛眼睫狀體表達(dá)展開，通過一系列實(shí)驗(yàn)取得了以下關(guān)鍵研究結(jié)論：在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中，成功檢測(cè)到一氧化氮合酶（NOS）和鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)。NOS主要表達(dá)于睫狀體上皮細(xì)胞，特別是非色素上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較高，在睫狀體基質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)；鳥苷酸環(huán)化酶同樣在睫狀體上皮細(xì)胞有表達(dá)，非色素上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于色素上皮細(xì)胞。在小梁網(wǎng)組織中，二者均有表達(dá)，NOS主要表達(dá)于小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)，鳥苷酸環(huán)化酶在小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)均有分布。蛋白質(zhì)免疫印跡分析表明，人眼睫狀體中NOS和鳥苷酸環(huán)化酶的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于小梁網(wǎng)。這為理解NO在眼部的生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了關(guān)鍵的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，明確了NO在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)的生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)酶的表達(dá)情況，為后續(xù)研究NO與Cx43在眼部的關(guān)聯(lián)以及在眼部疾病中的作用機(jī)制筑牢了根基。在人眼睫狀體與小梁網(wǎng)中，成功檢測(cè)到一氧化氮合酶（NOS）和鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)。NOS主要表達(dá)于睫狀體上皮細(xì)胞，特別是非色素上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較高，在睫狀體基質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)；鳥苷酸環(huán)化酶同樣在睫狀體上皮細(xì)胞有表達(dá)，非色素上皮細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度高于色素上皮細(xì)胞。在小梁網(wǎng)組織中，二者均有表達(dá)，NOS主要表達(dá)于小梁網(wǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)，鳥苷酸環(huán)化酶