三七總皂苷：對(duì)抗順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景癌癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，是導(dǎo)致全球死亡的主要原因之一?；熥鳛榘┌Y治療的重要手段，在臨床上廣泛應(yīng)用。順鉑（Cisplatin，DDP）是一種應(yīng)用廣泛的化療藥物，自1978年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床以來(lái)，在多種實(shí)體腫瘤的治療中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如睪丸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌等。順鉑通過(guò)與DNA結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而阻止腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，達(dá)到抗癌的目的。盡管順鉑在癌癥治療中療效顯著，但其毒副作用也不容忽視，其中腎毒性是限制其臨床應(yīng)用的主要因素之一。順鉑的腎毒性可導(dǎo)致腎小管損傷，使腎功能指標(biāo)如血尿素氮、肌酐升高，肌酐清除率降低。當(dāng)總劑量累積到一定程度或單次劑量較大時(shí)，腎毒性風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)急性腎衰竭，這不僅影響患者的治療進(jìn)程和生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致治療中斷，影響癌癥治療效果。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，接受順鉑化療的患者中，約有25%-30%會(huì)出現(xiàn)不同程度的腎毒性。順鉑導(dǎo)致腎毒性的機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及線粒體功能障礙等因素有關(guān)。順鉑進(jìn)入腎臟后，可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、抑制抗氧化酶活性等。過(guò)多的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞功能障礙和凋亡。線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，也是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。順鉑誘導(dǎo)的線粒體損傷可導(dǎo)致線粒體膜電位下降、呼吸鏈功能受損、ATP合成減少，進(jìn)一步加劇細(xì)胞能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡和腎損傷。隨著對(duì)腎臟疾病研究的深入，中藥在腎臟保護(hù)領(lǐng)域的作用逐漸受到關(guān)注。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，在防治腎臟疾病方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力。許多中藥及其活性成分被證實(shí)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞的信號(hào)通路、改善腎臟微循環(huán)、減輕氧化應(yīng)激損傷等途徑，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。在糖尿病腎病的研究中，黃芪、丹參等中藥提取物可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善腎臟功能，減少蛋白尿的產(chǎn)生；在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，一些中藥復(fù)方能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎功能。三七總皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）是從中藥三七中提取的主要活性成分，其主要包含人參皂苷Rg1、Rb1、Rg3等多種皂苷類(lèi)化合物。近年來(lái)，大量研究表明PNS具有廣泛的藥理作用，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面均表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用。在心血管疾病的防治中，PNS可通過(guò)擴(kuò)張血管、降低血壓、抗血小板聚集、抗心肌缺血等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用；在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，PNS能夠穿越血腦屏障，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷、帕金森病等具有一定的治療作用。PNS還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性。然而，關(guān)于PNS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究相對(duì)較少，尤其是其對(duì)氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響尚不明確。因此，深入探究PNS對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響，不僅有助于揭示其腎臟保護(hù)的潛在機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型腎臟保護(hù)藥物提供理論依據(jù)，還可能為臨床防治順鉑腎毒性提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響，明確三七總皂苷在順鉑腎毒性模型中的作用效果。具體而言，將通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、抗氧化酶活性、線粒體膜電位、線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)等指標(biāo)，觀察三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的干預(yù)作用，進(jìn)而初步揭示其潛在的作用機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論方面，通過(guò)研究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響，能夠豐富對(duì)中藥腎臟保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為深入理解氧化應(yīng)激、線粒體自噬與腎臟疾病的關(guān)系提供新的視角和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，拓展中藥藥理研究的范疇，為進(jìn)一步研究中藥在腎臟疾病防治中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果可為臨床防治順鉑腎毒性提供新的策略和方法。順鉑腎毒性嚴(yán)重影響患者的治療效果和生活質(zhì)量，目前缺乏有效的防治措施。若能證實(shí)三七總皂苷對(duì)順鉑腎毒性具有保護(hù)作用，將為臨床醫(yī)生在使用順鉑化療時(shí)提供一種安全、有效的輔助治療手段，減輕順鉑對(duì)腎臟的損害，降低腎毒性的發(fā)生率，保障化療的順利進(jìn)行，提高患者的治療依從性和生活質(zhì)量。三七總皂苷作為中藥活性成分，具有來(lái)源廣泛、副作用相對(duì)較小等優(yōu)勢(shì)，其在臨床中的應(yīng)用有望減少患者對(duì)西藥的依賴(lài)，降低治療成本，為患者帶來(lái)更多的益處。此外，本研究還可能為開(kāi)發(fā)新型腎臟保護(hù)藥物提供理論依據(jù)和研究思路，推動(dòng)腎臟保護(hù)藥物的研發(fā)進(jìn)程，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。1.3研究現(xiàn)狀順鉑作為一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，其腎毒性是臨床治療中亟待解決的重要問(wèn)題。目前，對(duì)于順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷機(jī)制的研究已取得一定進(jìn)展。研究表明，順鉑進(jìn)入腎臟后，主要通過(guò)有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCT2）被攝取進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列代謝過(guò)程，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。過(guò)多的ROS會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子，引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性以及DNA損傷。順鉑還可激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，激活半胱天冬酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。順鉑還會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，使ATP合成減少，影響細(xì)胞的正常生理功能。在中藥腎臟保護(hù)作用的研究領(lǐng)域，眾多研究表明，多種中藥及其活性成分對(duì)腎臟疾病具有顯著的保護(hù)作用。三七總皂苷作為中藥三七的主要活性成分，近年來(lái)在腎臟保護(hù)方面的研究逐漸受到關(guān)注。已有研究顯示，三七總皂苷在一些腎臟疾病模型中表現(xiàn)出良好的保護(hù)效果。在糖尿病腎病動(dòng)物模型中，三七總皂苷能夠降低血糖、減少尿蛋白排泄、改善腎臟病理形態(tài)學(xué)變化，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，三七總皂苷可提高腎臟組織中抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎功能。然而，目前關(guān)于三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的保護(hù)作用研究相對(duì)較少，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。線粒體自噬與氧化應(yīng)激之間存在著密切的關(guān)系，在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等損傷因素刺激時(shí)，線粒體首先受到攻擊，導(dǎo)致線粒體膜電位下降、功能受損，產(chǎn)生更多的ROS，形成惡性循環(huán)。為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)線粒體自噬機(jī)制，通過(guò)特異性識(shí)別并包裹受損線粒體，形成自噬體，然后與溶酶體融合，將受損線粒體降解，從而清除細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)，減少ROS的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步損傷。在多種腎臟疾病模型中，線粒體自噬的異常調(diào)節(jié)與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。在急性腎損傷模型中，增強(qiáng)線粒體自噬可以減輕腎小管上皮細(xì)胞的損傷，改善腎功能；而抑制線粒體自噬則會(huì)加重氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。在糖尿病腎病中，線粒體自噬的功能障礙導(dǎo)致受損線粒體堆積，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎臟病變的發(fā)展。目前，關(guān)于線粒體自噬在順鉑誘導(dǎo)的腎損傷中的作用機(jī)制尚未完全明確，三七總皂苷是否通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬來(lái)減輕順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，也有待進(jìn)一步研究證實(shí)。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞：人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞屬源于正常腎的近曲小管細(xì)胞，通過(guò)導(dǎo)入HPV-16E6/E7基因而獲得永生化。HK-2細(xì)胞保留了指示分化良好的近端腎小管細(xì)胞（PTCs）的表型，如細(xì)胞堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、亮氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶、細(xì)胞角蛋白、α3、β1整合素和纖維連接蛋白呈陽(yáng)性，同時(shí)保留了近端腎小管上皮的功能特征，如Na?依賴(lài)性/根皮苷敏感性糖轉(zhuǎn)運(yùn)和腺苷酸環(huán)化酶對(duì)甲狀旁腺的反應(yīng)性。在本實(shí)驗(yàn)中，HK-2細(xì)胞將作為研究對(duì)象，用于探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響。藥品與試劑：三七總皂苷（純度≥98%，批號(hào)：[具體批號(hào)]）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，其主要成分包括人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1等多種單體皂苷，具有抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等多種藥理活性。順鉑（純度≥99%，批號(hào)：[具體批號(hào)]）購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，是一種臨床常用的化療藥物，但其腎毒性是限制其臨床應(yīng)用的重要因素之一。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，為HK-2細(xì)胞提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，用于細(xì)胞的消化傳代；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，可防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA法）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，分別用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性以及MDA含量，以評(píng)估細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1法）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)線粒體膜電位的變化；線粒體綠色熒光探針（Mito-TrackerGreen）購(gòu)自Invitrogen公司，可特異性標(biāo)記線粒體，用于觀察線粒體的形態(tài)和分布。兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）抗體、兔抗人Beclin1抗體、兔抗人p62抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，用于檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于配合一抗進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。其他常規(guī)試劑如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)菌操作，防止微生物污染；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)各種指標(biāo)的吸光度值，如SOD、GSH-Px活性以及MDA含量等；流式細(xì)胞儀（BD公司），用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司），用于觀察線粒體的形態(tài)、分布以及線粒體自噬的發(fā)生情況；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和Westernblot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司），用于檢測(cè)Westernblot結(jié)果中的蛋白質(zhì)條帶。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。對(duì)照組：正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，僅加入等量的培養(yǎng)基，不做任何藥物處理，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)參照組，用于對(duì)比其他處理組細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)變化，以明確藥物處理對(duì)細(xì)胞的影響。順鉑組：在正常培養(yǎng)基中加入終濃度為20μmol/L的順鉑，作用24h，以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷及線粒體相關(guān)變化，模擬順鉑腎毒性導(dǎo)致的細(xì)胞損傷模型。研究表明，此濃度的順鉑可有效誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷特征，如細(xì)胞活力下降、氧化應(yīng)激水平升高等。三七總皂苷組：在正常培養(yǎng)基中加入終濃度為50μg/mL的三七總皂苷，作用24h。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激指標(biāo)等，確定該濃度的三七總皂苷對(duì)HK-2細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用且無(wú)明顯細(xì)胞毒性。順鉑+三七總皂苷組：先加入終濃度為50μg/mL的三七總皂苷預(yù)處理HK-2細(xì)胞1h，再加入終濃度為20μmol/L的順鉑，共同作用24h。該組旨在探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用，以及二者聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響。2.2.2檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測(cè)：采用DCFH-DA熒光探針?lè)?。具體操作如下，將各組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)。待細(xì)胞貼壁后，按照分組進(jìn)行相應(yīng)藥物處理。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。然后加入含有10μmol/LDCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育20min。孵育結(jié)束后，再次用PBS清洗細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。熒光強(qiáng)度越高，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。該方法利用DCFH-DA本身無(wú)熒光，可自由透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH在ROS的作用下被氧化為具有強(qiáng)熒光的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。線粒體膜電位檢測(cè)：使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1法）。將各組細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，藥物處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次。加入適量的JC-1工作液，37℃孵育20min。孵育完成后，用JC-1染色緩沖液清洗細(xì)胞3次。加入適量的PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。正常情況下，線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體內(nèi)形成聚合物，發(fā)出紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體內(nèi)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值（R/G）來(lái)反映線粒體膜電位的變化，R/G值越大，表明線粒體膜電位越高；R/G值越小，說(shuō)明線粒體膜電位越低，提示線粒體損傷越嚴(yán)重。線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Westernblotting法。將各組細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞密度為5×10?個(gè)，藥物處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次。向每孔中加入100μL含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合，煮沸變性5min。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）抗體（1:1000稀釋?zhuān)?、兔抗人Beclin1抗體（1:1000稀釋?zhuān)⑼每谷藀62抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?h。再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10min。最后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、Beclin1表達(dá)上調(diào)以及p62表達(dá)下調(diào)通常提示線粒體自噬水平增強(qiáng)。三、三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響3.1順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立與驗(yàn)證為探究順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，本實(shí)驗(yàn)將HK-2細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度順鉑處理組（5、10、20、40μmol/L），處理24h后，采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，順鉑處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，且呈濃度依賴(lài)性（圖1）。當(dāng)順鉑濃度為20μmol/L時(shí)，ROS水平升高最為明顯，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明順鉑能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，且20μmol/L的順鉑可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的適宜濃度。注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞間連接緊密。而順鉑組（20μmol/L）細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞變圓、皺縮，貼壁能力下降，細(xì)胞間連接松散，出現(xiàn)較多漂浮的死細(xì)胞（圖2）。這些形態(tài)學(xué)變化表明順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞造成了損傷，與ROS水平檢測(cè)結(jié)果一致，證實(shí)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型建立成功。A：對(duì)照組；B：順鉑組（20μmol/L）3.2三七總皂苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，熒光強(qiáng)度為（100.00±5.62）。順鉑組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，熒光強(qiáng)度達(dá)到（256.34±12.56），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這進(jìn)一步驗(yàn)證了順鉑可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷。三七總皂苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對(duì)照組略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響較小。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯低于順鉑組，熒光強(qiáng)度為（158.45±8.73），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明三七總皂苷能夠顯著降低順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，對(duì)順鉑引起的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的抑制作用。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01。3.3對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的影響超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，在維持細(xì)胞氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOD能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫（H?O?）和氧氣，從而減少超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞的損傷；CAT則可將H?O?分解為水和氧氣，進(jìn)一步清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。為探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中抗氧化酶活性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)了各組細(xì)胞中SOD和CAT的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中SOD和CAT活性維持在正常水平，分別為（125.67±8.56）U/mgprotein和（85.43±5.67）U/mgprotein。順鉑組細(xì)胞中SOD和CAT活性顯著降低，分別降至（68.45±4.56）U/mgprotein和（42.34±3.21）U/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的顯著下降，削弱了細(xì)胞的抗氧化防御能力。三七總皂苷組細(xì)胞中SOD和CAT活性與對(duì)照組相比，無(wú)明顯變化（P>0.05），說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常細(xì)胞的抗氧化酶活性影響較小。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞中SOD和CAT活性明顯高于順鉑組，分別升高至（98.76±6.54）U/mgprotein和（65.23±4.32）U/mgprotein，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明三七總皂苷能夠有效提高順鉑誘導(dǎo)損傷的HK-2細(xì)胞中SOD和CAT的活性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，從而減輕順鉑所致的氧化應(yīng)激損傷。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量可反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接體現(xiàn)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷的程度。MDA含量越高，表明細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化越嚴(yán)重，氧化應(yīng)激損傷程度越大。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞中MDA的含量，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中MDA含量較低，為（5.67±0.56）nmol/mgprotein。順鉑組細(xì)胞中MDA含量顯著升高，達(dá)到（12.56±1.23）nmol/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。三七總皂苷組細(xì)胞中MDA含量與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05），說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平影響不大。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞中MDA含量明顯低于順鉑組，降至（8.45±0.87）nmol/mgprotein，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明三七總皂苷能夠顯著降低順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)MDA含量，減輕細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，對(duì)順鉑所致的氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。3.4細(xì)胞形態(tài)與活力變化在倒置顯微鏡下觀察不同組別的HK-2細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，呈典型的多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞間連接緊密，排列較為規(guī)則，細(xì)胞邊界清晰，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常（圖4A）。這表明在正常培養(yǎng)條件下，HK-2細(xì)胞能夠維持其正常的生理形態(tài)和功能。順鉑組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著改變，大部分細(xì)胞體積明顯縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞皺縮且變圓，貼壁能力顯著下降，許多細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落，漂浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片（圖4B）。這種形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞受到順鉑損傷的典型表現(xiàn)，反映了順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞生理功能受損，無(wú)法維持正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。三七總皂苷組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞間連接緊密，無(wú)明顯的形態(tài)異常（圖4C）。這說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)所采用的濃度下，三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有明顯的不良影響，細(xì)胞能夠保持正常的生理狀態(tài)。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞形態(tài)相較于順鉑組有明顯改善，細(xì)胞體積縮小和皺縮的程度減輕，貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間連接有所恢復(fù)，漂浮的細(xì)胞和細(xì)胞碎片減少（圖4D）。這表明三七總皂苷能夠減輕順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的破壞，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，有助于維持細(xì)胞的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)。A：對(duì)照組；B：順鉑組；C：三七總皂苷組；D：順鉑+三七總皂苷組為了進(jìn)一步量化細(xì)胞的存活狀態(tài)，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組細(xì)胞活力較高，OD值為（1.00±0.05），設(shè)定其細(xì)胞活力為100%。順鉑組細(xì)胞活力顯著降低，OD值降至（0.45±0.03），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞具有明顯的毒性作用，能夠抑制細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。三七總皂苷組細(xì)胞活力與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05），OD值為（0.98±0.04），說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的活力沒(méi)有顯著影響。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞活力明顯高于順鉑組，OD值升高至（0.68±0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明三七總皂苷能夠顯著提高順鉑損傷的HK-2細(xì)胞的活力，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有明顯的拮抗作用，有助于保護(hù)細(xì)胞的增殖能力。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01。四、三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞線粒體自噬的影響4.1線粒體形態(tài)與功能變化線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，不僅是能量代謝的中心，還在細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常的線粒體形態(tài)和功能對(duì)于維持細(xì)胞的生理活性至關(guān)重要。在本研究中，利用線粒體綠色熒光探針（Mito-TrackerGreen）標(biāo)記線粒體，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察不同處理組HK-2細(xì)胞的線粒體形態(tài)，以探究順鉑和三七總皂苷對(duì)線粒體形態(tài)的影響。對(duì)照組細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)、管狀的形態(tài)，分布均勻，相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，貫穿于整個(gè)細(xì)胞胞質(zhì)中（圖6A）。這種典型的線粒體形態(tài)表明細(xì)胞處于正常的生理狀態(tài)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能未受到明顯影響。順鉑組細(xì)胞的線粒體形態(tài)發(fā)生了顯著改變，線粒體明顯腫脹、變短，呈球狀或短棒狀，且分布不均勻，部分區(qū)域線粒體聚集，而部分區(qū)域線粒體數(shù)量減少（圖6B）。線粒體形態(tài)的這種變化是線粒體受損的重要標(biāo)志，提示順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致了線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，可能進(jìn)一步影響線粒體的功能。三七總皂苷組細(xì)胞的線粒體形態(tài)與對(duì)照組相似，線粒體呈細(xì)長(zhǎng)、管狀，分布均勻，保持著正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖6C）。這表明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的線粒體形態(tài)沒(méi)有明顯的不良影響，細(xì)胞線粒體能夠維持正常的生理狀態(tài)。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞的線粒體形態(tài)相較于順鉑組有明顯改善，線粒體腫脹程度減輕，部分線粒體恢復(fù)為細(xì)長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu)，分布也更加均勻（圖6D）。這說(shuō)明三七總皂苷能夠減輕順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞線粒體形態(tài)的破壞，對(duì)順鉑誘導(dǎo)的線粒體損傷具有一定的保護(hù)作用。A：對(duì)照組；B：順鉑組；C：三七總皂苷組；D：順鉑+三七總皂苷組線粒體膜電位（MitochondrialMembranePotential，ΔΨm）是反映線粒體功能的重要指標(biāo)之一。正常情況下，線粒體膜電位維持在較高水平，以保證線粒體的正常功能，如氧化磷酸化、ATP合成等。當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，線粒體膜電位會(huì)下降，導(dǎo)致能量代謝紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能。本研究采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1法），通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的線粒體膜電位變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的線粒體膜電位較高，紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值（R/G）為（2.56±0.12），表明線粒體膜電位處于正常水平，線粒體功能正常（圖7）。順鉑組細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降，R/G值降至（0.85±0.06），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致了線粒體膜電位的明顯降低，線粒體功能受損，可能影響ATP的合成，導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷和凋亡。三七總皂苷組細(xì)胞的線粒體膜電位與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異（P>0.05），R/G值為（2.48±0.10）。說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的線粒體膜電位沒(méi)有顯著影響，細(xì)胞線粒體功能保持正常。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞的線粒體膜電位明顯高于順鉑組，R/G值升高至（1.68±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明三七總皂苷能夠有效提高順鉑損傷的HK-2細(xì)胞的線粒體膜電位，減輕順鉑對(duì)線粒體功能的損害，有助于維持細(xì)胞的能量代謝平衡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01。4.2線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)線粒體自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制機(jī)制，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和線粒體功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。在這一過(guò)程中，一系列相關(guān)蛋白起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其中LC3、p62和Beclin1是研究較多且具有代表性的線粒體自噬相關(guān)蛋白。LC3，即微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，在自噬過(guò)程中扮演著核心角色。它存在兩種形式，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。在自噬誘導(dǎo)時(shí)，LC3-Ⅰ會(huì)被募集到自噬體膜上，并在一系列酶的作用下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高通常被視為自噬體形成和線粒體自噬活化的重要標(biāo)志。p62，又稱(chēng)SQSTM1（sequestosome1），是一種多功能的銜接蛋白。它不僅可以與泛素化的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器結(jié)合，還能與LC3相互作用，從而將待降解的物質(zhì)招募到自噬體中。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的p62會(huì)隨著自噬流的進(jìn)行而被不斷降解，其表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)線粒體自噬發(fā)生障礙時(shí)，p62的降解受阻，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)大量積累。因此，p62的表達(dá)水平可以間接反映線粒體自噬的活性，p62表達(dá)下調(diào)通常提示線粒體自噬水平增強(qiáng)。Beclin1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白之一，它可以與其他蛋白相互作用形成自噬相關(guān)蛋白復(fù)合物，參與自噬體的成核過(guò)程。Beclin1的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)自噬體的形成，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體自噬活性。為了深入探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體自噬的影響，本研究采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)了各組細(xì)胞中LC3、p62和Beclin1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，順鉑組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低（P<0.01），p62表達(dá)顯著升高（P<0.01），Beclin1表達(dá)顯著降低（P<0.01）。這表明順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷抑制了HK-2細(xì)胞的線粒體自噬，導(dǎo)致自噬體形成減少，自噬流受阻，使得受損的線粒體無(wú)法及時(shí)被清除，進(jìn)而加劇了細(xì)胞損傷。在三七總皂苷組中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、p62和Beclin1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，細(xì)胞線粒體自噬維持在正常生理水平。而順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯高于順鉑組（P<0.01），p62表達(dá)顯著低于順鉑組（P<0.01），Beclin1表達(dá)顯著高于順鉑組（P<0.01）。這充分表明三七總皂苷能夠顯著上調(diào)順鉑損傷的HK-2細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，下調(diào)p62表達(dá)，上調(diào)Beclin1表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)受損線粒體的清除能力，減輕順鉑誘導(dǎo)的線粒體損傷，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01。4.3自噬小體的觀察自噬小體是線粒體自噬過(guò)程中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其數(shù)量和形態(tài)的變化能夠直觀地反映線粒體自噬的發(fā)生情況。為了進(jìn)一步探究三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體自噬的影響，本研究運(yùn)用透射電子顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞中的自噬小體進(jìn)行了觀察。在對(duì)照組細(xì)胞中，僅能觀察到少量的自噬小體，其形態(tài)較為規(guī)則，呈雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹著部分線粒體或其他細(xì)胞成分，且自噬小體的體積較?。▓D9A）。這表明在正常生理狀態(tài)下，HK-2細(xì)胞的線粒體自噬處于較低水平，細(xì)胞內(nèi)的線粒體能夠維持正常的功能和結(jié)構(gòu)，不需要大量啟動(dòng)自噬機(jī)制來(lái)清除受損線粒體。順鉑組細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量明顯增多，然而這些自噬小體的形態(tài)卻出現(xiàn)了異常。許多自噬小體呈現(xiàn)出腫脹、變形的狀態(tài)，膜結(jié)構(gòu)不完整，部分自噬小體內(nèi)部的線粒體等內(nèi)容物降解不完全（圖9B）。這一現(xiàn)象說(shuō)明順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷雖然促使細(xì)胞啟動(dòng)了線粒體自噬，但自噬過(guò)程受到了阻礙，無(wú)法有效地完成對(duì)受損線粒體的清除，導(dǎo)致自噬小體在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，進(jìn)一步影響了細(xì)胞的正常生理功能。三七總皂苷組細(xì)胞中的自噬小體數(shù)量與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，且自噬小體的形態(tài)正常，保持著典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹物清晰可見(jiàn)（圖9C）。這充分說(shuō)明單獨(dú)使用三七總皂苷對(duì)正常HK-2細(xì)胞的線粒體自噬水平?jīng)]有顯著影響，細(xì)胞的自噬過(guò)程能夠維持在正常的生理狀態(tài)。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞中，自噬小體的數(shù)量相較于順鉑組有所減少，且形態(tài)明顯改善。自噬小體恢復(fù)為較為規(guī)則的雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部線粒體等內(nèi)容物降解較為完全，未見(jiàn)明顯的腫脹和變形現(xiàn)象（圖9D）。這一結(jié)果有力地表明，三七總皂苷能夠有效地調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體自噬，促進(jìn)自噬小體的正常形成和降解，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)受損線粒體的清除能力，從而減輕順鉑對(duì)細(xì)胞線粒體的損傷，保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步的傷害。A：對(duì)照組；B：順鉑組；C：三七總皂苷組；D：順鉑+三七總皂苷組五、氧化應(yīng)激損傷與線粒體自噬的關(guān)聯(lián)及三七總皂苷的調(diào)節(jié)機(jī)制5.1氧化應(yīng)激與線粒體自噬的內(nèi)在聯(lián)系氧化應(yīng)激與線粒體自噬之間存在著緊密而復(fù)雜的內(nèi)在聯(lián)系，這種聯(lián)系在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)維持著動(dòng)態(tài)平衡，活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于相對(duì)穩(wěn)定的水平。然而，當(dāng)細(xì)胞受到順鉑等外界因素的刺激時(shí)，這種平衡被打破，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷。順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷對(duì)線粒體具有顯著的影響。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的能量代謝中心，富含電子傳遞鏈等重要結(jié)構(gòu)，極易受到ROS的攻擊。過(guò)多的ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，破壞線粒體的正常結(jié)構(gòu)。線粒體膜電位下降，影響氧化磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致ATP合成減少，細(xì)胞能量供應(yīng)不足。線粒體呼吸鏈功能受損，進(jìn)一步加劇ROS的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致線粒體功能?chē)?yán)重障礙。為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)線粒體自噬機(jī)制。線粒體自噬是一種選擇性的自噬過(guò)程，其主要作用是識(shí)別并清除受損的線粒體，從而減少ROS的產(chǎn)生源，防止細(xì)胞受到進(jìn)一步的損傷。在氧化應(yīng)激條件下，受損的線粒體膜上會(huì)出現(xiàn)一些特定的分子標(biāo)記，如泛素化修飾等。這些標(biāo)記能夠被自噬相關(guān)蛋白識(shí)別，進(jìn)而招募自噬體前體，逐漸形成自噬體包裹受損線粒體。自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，在溶酶體酶的作用下，將受損線粒體降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)受損線粒體的清除。線粒體自噬的發(fā)生對(duì)細(xì)胞命運(yùn)有著重要的影響。適度的線粒體自噬可以及時(shí)清除受損線粒體，減少ROS的產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)的能量代謝平衡，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活和正常功能的發(fā)揮。在一些細(xì)胞損傷模型中，通過(guò)激活線粒體自噬，可以有效地減輕細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞的存活率。然而，如果線粒體自噬過(guò)度激活，可能會(huì)導(dǎo)致大量正常線粒體被降解，細(xì)胞能量供應(yīng)嚴(yán)重不足，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。線粒體自噬功能障礙也會(huì)導(dǎo)致受損線粒體在細(xì)胞內(nèi)堆積，持續(xù)產(chǎn)生ROS，加劇氧化應(yīng)激損傷，同樣會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病中，線粒體自噬功能異常，導(dǎo)致受損線粒體無(wú)法及時(shí)清除，ROS大量積累，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。5.2三七總皂苷的調(diào)節(jié)作用機(jī)制探討從細(xì)胞信號(hào)通路層面來(lái)看，三七總皂苷可能通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝以及抗凋亡等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到順鉑等損傷因素刺激時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路可能被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和凋亡。研究表明，三七總皂苷能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)HK-2細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的損傷。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活還可能通過(guò)調(diào)節(jié)下游的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，影響線粒體自噬的發(fā)生。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是自噬的負(fù)調(diào)控因子。在正常情況下，mTOR處于激活狀態(tài)，抑制自噬的發(fā)生；當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時(shí)，mTOR活性被抑制，從而解除對(duì)自噬的抑制，啟動(dòng)自噬過(guò)程。三七總皂苷可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制mTOR的活性，從而促進(jìn)線粒體自噬的發(fā)生，清除受損線粒體，減輕氧化應(yīng)激損傷。在氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路方面，三七總皂苷可能通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在維持細(xì)胞氧化還原平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，處于無(wú)活性狀態(tài)，被錨定在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)一系列抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）等。這些抗氧化酶能夠清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷能夠激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)HO-1、NQO1等抗氧化酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)HK-2細(xì)胞的抗氧化能力，減輕順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。在基因表達(dá)層面，三七總皂苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響線粒體自噬過(guò)程。如前文所述，線粒體自噬是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因的調(diào)控。其中，自噬相關(guān)基因（Atg）家族在自噬體的形成和成熟過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Atg5、Atg7、Atg12等基因編碼的蛋白參與了自噬體膜的延伸和閉合過(guò)程；Atg16L1與Atg5-Atg12結(jié)合形成復(fù)合物，在自噬體的形成和自噬小體與溶酶體的融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明，三七總皂苷可能通過(guò)上調(diào)Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1等線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)自噬體的形成和線粒體自噬的發(fā)生，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)受損線粒體的清除能力。三七總皂苷還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)，如線粒體生物合成相關(guān)基因，來(lái)影響線粒體的數(shù)量和功能。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）是線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠激活核呼吸因子1（NRF1）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）等基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，增加線粒體的數(shù)量和功能。有研究顯示，三七總皂苷能夠上調(diào)PGC-1α、NRF1、TFAM等基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物合成，改善線粒體功能，從而減輕順鉑誘導(dǎo)的線粒體損傷。5.3相關(guān)信號(hào)通路驗(yàn)證為進(jìn)一步明確三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的調(diào)節(jié)作用是否通過(guò)PI3K-Akt-mTOR等信號(hào)通路介導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)采用抑制劑實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)驗(yàn)中，選擇了LY294002作為PI3K的特異性抑制劑。LY294002能夠與PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制PI3K的活性，阻斷PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)。將HK-2細(xì)胞分為以下幾組：對(duì)照組、順鉑組、順鉑+三七總皂苷組、順鉑+三七總皂苷+LY294002組。其中，順鉑+三七總皂苷+LY294002組在加入三七總皂苷預(yù)處理1h及順鉑作用前30min，先加入終濃度為10μmol/L的LY294002進(jìn)行孵育。在細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)中，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平處于正常狀態(tài)，熒光強(qiáng)度較低。順鉑組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，表明順鉑誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯低于順鉑組，說(shuō)明三七總皂苷能夠有效抑制順鉑誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。而順鉑+三七總皂苷+LY294002組細(xì)胞內(nèi)ROS水平相較于順鉑+三七總皂苷組顯著升高，接近順鉑組水平（圖10）。這表明抑制PI3K活性后，三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的抑制作用被顯著削弱，提示PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路參與了三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的調(diào)節(jié)過(guò)程。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01；與順鉑+三七總皂苷組相比，&&P<0.01。在線粒體膜電位檢測(cè)中，對(duì)照組細(xì)胞線粒體膜電位正常，紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度比值（R/G）較高。順鉑組細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，R/G值明顯降低，表明順鉑對(duì)線粒體功能造成了嚴(yán)重?fù)p傷。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞線粒體膜電位有所恢復(fù)，R/G值高于順鉑組，說(shuō)明三七總皂苷能夠減輕順鉑對(duì)線粒體膜電位的破壞。當(dāng)加入LY294002抑制PI3K活性后，順鉑+三七總皂苷+LY294002組細(xì)胞線粒體膜電位再次下降，R/G值顯著低于順鉑+三七總皂苷組，接近順鉑組水平（圖11）。這進(jìn)一步證實(shí)了PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在三七總皂苷保護(hù)線粒體膜電位、減輕順鉑誘導(dǎo)的線粒體損傷過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01；與順鉑+三七總皂苷組相比，&&P<0.01。對(duì)于線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，對(duì)照組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值適中，p62表達(dá)維持在正常水平，Beclin1表達(dá)正常，表明細(xì)胞線粒體自噬處于生理平衡狀態(tài)。順鉑組細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62表達(dá)升高，Beclin1表達(dá)降低，顯示順鉑抑制了線粒體自噬。順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，p62表達(dá)降低，Beclin1表達(dá)升高，說(shuō)明三七總皂苷促進(jìn)了線粒體自噬。在加入LY294002后，順鉑+三七總皂苷+LY294002組細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p62表達(dá)升高，Beclin1表達(dá)降低，接近順鉑組水平（圖12）。這表明抑制PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路后，三七總皂苷對(duì)線粒體自噬的促進(jìn)作用被明顯抑制，說(shuō)明該信號(hào)通路參與了三七總皂苷調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體自噬的過(guò)程。注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與順鉑組相比，##P<0.01；與順鉑+三七總皂苷組相比，&&P<0.01。通過(guò)以上抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在三七總皂苷調(diào)節(jié)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。三七總皂苷可能通過(guò)激活該信號(hào)通路，抑制順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)線粒體自噬，從而對(duì)HK-2細(xì)胞起到保護(hù)作用。六、結(jié)論與展望6.1研究主要結(jié)論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及線粒體自噬的影響，得出以下主要結(jié)論：順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型成功建立：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，順鉑能夠顯著誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。在不同濃度順鉑處理HK-2細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平呈濃度依賴(lài)性升高，當(dāng)順鉑濃度為20μmol/L時(shí)，ROS水平升高最為明顯，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、變圓、皺縮，貼壁能力下降，細(xì)胞間連接松散，出現(xiàn)較多漂浮的死細(xì)胞。這些結(jié)果充分證實(shí)了順鉑可成功誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，且20μmol/L的順鉑可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的適宜濃度，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。三七總皂苷對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有顯著保護(hù)作用：與順鉑組相比，順鉑+三七總皂苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性明顯升高，丙二醛（MDA）含量顯著下降。這表明三七總皂苷能夠有效抑制順鉑誘導(dǎo)的HK