Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白影響的深度解析一、引言1.1研究背景與意義Cul4b基因，作為Cullin家族的關(guān)鍵成員，在生物體內(nèi)參與構(gòu)成Cullin4B-RingE3泛素連接酶復(fù)合物（CRL4B復(fù)合物），對多種生物進程發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。在細(xì)胞的生命活動中，蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種關(guān)鍵的調(diào)控機制，Cul4b參與的CRL4B復(fù)合物通過識別特定的底物蛋白，并將泛素分子連接到底物蛋白上，從而標(biāo)記這些蛋白，使其被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識別并降解，以此精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，Cul4b能夠通過泛素化修飾特定的細(xì)胞周期蛋白，影響細(xì)胞從一個周期階段過渡到下一個階段的進程，確保細(xì)胞分裂的正常進行。在DNA損傷修復(fù)過程中，Cul4b也扮演著重要角色，當(dāng)DNA受到損傷時，Cul4b參與的復(fù)合物能夠被招募到損傷位點，通過泛素化修飾相關(guān)的修復(fù)蛋白，促進DNA損傷的修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性。此外，Cul4b還在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，在胚胎發(fā)育的早期階段，Cul4b基因的表達(dá)對于細(xì)胞的分化和組織器官的形成具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致胚胎發(fā)育異常，甚至胚胎致死。神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育是個體生長和生存的基礎(chǔ)，其發(fā)育過程涉及神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及神經(jīng)元之間突觸連接的形成和重塑等一系列復(fù)雜而有序的生物學(xué)事件，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。近年來，越來越多的研究表明，Cul4b基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Cul4b基因的突變或缺失與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如X連鎖智力低下綜合征等。研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺失Cul4b的小鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力低下、海馬中PV-陽性GABA能中間神經(jīng)元數(shù)量減少、海馬神經(jīng)元樹突分支減少、胞體減小、樹突棘密度和形態(tài)異常等一系列神經(jīng)發(fā)育異常的表型。這些研究結(jié)果提示，Cul4b基因可能通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，影響神經(jīng)元的存活、遷移和成熟，以及調(diào)節(jié)突觸的形成和功能等多個方面，參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過程。深入研究Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響，對于揭示神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機制以及相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制具有重要的理論意義。通過探究Cul4b基因缺失后神經(jīng)元發(fā)育過程中出現(xiàn)的異常變化，以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能改變，我們可以進一步了解Cul4b基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的具體作用靶點和信號通路，從而為深入理解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的線索。這對于豐富和完善神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的理論知識體系具有重要的推動作用。從臨床應(yīng)用的角度來看，該研究也具有重要的潛在價值。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病、神經(jīng)退行性疾病等，目前仍然缺乏有效的治療手段。通過對Cul4b基因缺失影響的研究，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和生物標(biāo)志物。如果能夠明確Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵分子機制，就可以針對這些機制開發(fā)特異性的藥物或治療方法，為這些疾病的治療提供新的策略和途徑。研究Cul4b基因缺失對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響，也可能篩選出一些與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，用于疾病的早期診斷和病情監(jiān)測，提高疾病的診斷準(zhǔn)確率和治療效果，為患者的臨床治療和康復(fù)提供有力的支持。1.2研究目的與方法本研究旨在深入探究Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的具體影響，通過明確其中的作用機制，為揭示神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機制以及相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制提供關(guān)鍵的理論依據(jù)，期望為臨床治療相關(guān)疾病開辟新的路徑。在研究過程中，將運用基因敲除小鼠模型進行體內(nèi)實驗。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠。借助基因編輯技術(shù)的精準(zhǔn)性，能夠在小鼠基因組中特異性地刪除Cul4b基因，從而獲得在神經(jīng)系統(tǒng)中缺乏Cul4b基因表達(dá)的小鼠模型。利用這些小鼠，從整體動物水平上深入分析Cul4b基因缺失對神經(jīng)發(fā)育的影響。通過觀察小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，如學(xué)習(xí)能力、記憶能力、運動協(xié)調(diào)能力等，評估Cul4b基因缺失對小鼠神經(jīng)功能的影響；運用組織學(xué)和免疫組化技術(shù)，檢測小鼠大腦不同區(qū)域的神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量、分布以及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以明確Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育的具體影響。細(xì)胞實驗也是本研究的重要組成部分。分離和培養(yǎng)野生型和Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)元，在體外模擬神經(jīng)元的發(fā)育過程。通過免疫熒光染色技術(shù)，直觀地觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化，包括軸突的生長、樹突的分支等；利用流式細(xì)胞術(shù)，精確分析細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)，深入了解Cul4b基因缺失對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，定量檢測神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，明確Cul4b基因缺失對這些蛋白表達(dá)的影響。分子生物學(xué)技術(shù)的運用將進一步揭示Cul4b基因缺失影響神經(jīng)元發(fā)育的分子機制。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，準(zhǔn)確檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，從轉(zhuǎn)錄水平分析Cul4b基因缺失對基因表達(dá)的調(diào)控作用；運用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，研究Cul4b蛋白與DNA的相互作用，確定其在基因組上的結(jié)合位點，從而揭示Cul4b基因調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的分子機制；采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面分析野生型和Cul4b基因敲除神經(jīng)元中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，篩選出受Cul4b基因調(diào)控的關(guān)鍵蛋白和信號通路，為深入理解Cul4b基因在神經(jīng)元發(fā)育中的作用機制提供全面的信息。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，Cul4b基因與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)研究起步較早。2007年，英國研究小組率先發(fā)現(xiàn)CUL4B基因突變與X連鎖智力低下綜合征相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)開啟了對Cul4b基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中作用研究的新篇章。此后，眾多研究圍繞Cul4b基因缺失對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響展開。有研究利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建小鼠模型，發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺失Cul4b的小鼠存在明顯的學(xué)習(xí)記憶能力低下問題，深入研究發(fā)現(xiàn)，其海馬中PV-陽性GABA能中間神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，這一變化可能導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路的信息傳遞和調(diào)節(jié)異常，進而影響學(xué)習(xí)記憶功能。這些小鼠的海馬神經(jīng)元還出現(xiàn)樹突分支減少、胞體減小的現(xiàn)象，樹突作為神經(jīng)元接收信息的重要結(jié)構(gòu)，其分支減少會降低神經(jīng)元接收和整合信息的能力，而胞體減小可能影響神經(jīng)元的代謝和功能維持。樹突棘密度和形態(tài)也發(fā)生異常，樹突棘是神經(jīng)元之間形成突觸連接的重要部位，其密度和形態(tài)的改變會直接影響突觸的功能和可塑性，從而對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究也取得了豐碩成果。山東大學(xué)的研究團隊構(gòu)建了神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4bNestin-Cre小鼠），通過體內(nèi)和體外實驗系統(tǒng)地研究了Cul4b的功能。體外實驗結(jié)果表明，與野生型神經(jīng)前體細(xì)胞相比，Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽性細(xì)胞分化增多。GFAP陽性細(xì)胞主要為星型膠質(zhì)細(xì)胞，其數(shù)量和功能的改變會影響神經(jīng)元的微環(huán)境，進而影響神經(jīng)元的發(fā)育和功能。體內(nèi)實驗也證實，Cul4bNestin-Cre小鼠的多個腦區(qū)中GFAP陽性細(xì)胞明顯多于同窩對照小鼠。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除Cul4b基因后前列腺素D2合成酶PTGDS的表達(dá)明顯升高，且Cul4b調(diào)控GFAP陽性細(xì)胞分化是通過PTGDS介導(dǎo)的，這揭示了Cul4b基因影響神經(jīng)發(fā)育的一條重要分子通路。然而，當(dāng)前研究仍存在一定的不足和空白。在分子機制方面，雖然已知Cul4b參與構(gòu)成CRL4B復(fù)合物調(diào)控蛋白泛素化，但對于Cul4b在神經(jīng)元發(fā)育過程中，如何精準(zhǔn)地通過泛素化修飾調(diào)控下游靶蛋白的表達(dá)和功能，進而影響神經(jīng)元的增殖、分化、遷移等過程，尚未完全明確。在信號通路研究中，Cul4b基因缺失后，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)涉及的上下游信號通路及其相互作用網(wǎng)絡(luò)還未被全面解析，這限制了我們對Cul4b基因調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機制的深入理解。此外，目前的研究主要集中在小鼠模型上，將研究成果轉(zhuǎn)化到人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和干預(yù)方面，還面臨諸多挑戰(zhàn)，如何建立更有效的轉(zhuǎn)化研究模型和方法，也是未來需要解決的問題。二、Cul4b基因概述2.1Cul4b基因的結(jié)構(gòu)與功能Cul4b基因位于人類染色體Xq25，其結(jié)構(gòu)具有獨特性，包含多個外顯子和內(nèi)含子。在人類中，Cul4b基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA經(jīng)過復(fù)雜的剪接過程，可產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄變體，這些轉(zhuǎn)錄變體編碼不同亞型的Cul4b蛋白，它們在氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上存在一定差異，從而可能賦予Cul4b蛋白在不同細(xì)胞環(huán)境和生理過程中多樣化的功能。Cul4b基因編碼的Cul4b蛋白是Cullin家族的重要成員，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cul4b蛋白的結(jié)構(gòu)包含多個結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域在與其他蛋白相互作用以及復(fù)合物的組裝中起著核心作用。Cul4b蛋白能夠與多種蛋白相互作用，形成Cullin4B-RingE3泛素連接酶復(fù)合物（CRL4B復(fù)合物）。在CRL4B復(fù)合物中，Cul4b蛋白作為支架蛋白，通過其不同的結(jié)構(gòu)域與其他組分緊密結(jié)合，將識別底物蛋白的適配體蛋白和具有催化活性的Ring指蛋白連接在一起，使復(fù)合物能夠特異性地識別底物蛋白，并將泛素分子連接到底物蛋白上，完成蛋白質(zhì)的泛素化修飾過程。這種泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠標(biāo)記底物蛋白，使其被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體識別并降解，從而精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在細(xì)胞周期調(diào)控中，Cul4b參與的CRL4B復(fù)合物對細(xì)胞周期蛋白的泛素化修飾起著關(guān)鍵作用。例如，在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中，CRL4B復(fù)合物能夠識別并泛素化修飾一些抑制細(xì)胞周期進程的蛋白，促使它們被蛋白酶體降解，從而解除對細(xì)胞周期的抑制，使細(xì)胞順利進入S期進行DNA復(fù)制。若Cul4b基因缺失或功能異常，會導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白的泛素化修飾失衡，進而影響細(xì)胞周期的正常進程，可能使細(xì)胞出現(xiàn)增殖異常，如增殖過快或停滯在某個細(xì)胞周期階段。在DNA損傷修復(fù)方面，Cul4b也發(fā)揮著不可或缺的作用。當(dāng)細(xì)胞受到紫外線、電離輻射等因素導(dǎo)致DNA損傷時，Cul4b參與的CRL4B復(fù)合物能夠迅速被招募到DNA損傷位點。在那里，CRL4B復(fù)合物通過泛素化修飾一系列參與DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，如DNA損傷感應(yīng)蛋白、修復(fù)酶等，調(diào)節(jié)它們的活性和穩(wěn)定性，促進DNA損傷的修復(fù)過程。研究表明，在缺乏Cul4b的細(xì)胞中，DNA損傷修復(fù)能力顯著下降，基因組的穩(wěn)定性受到嚴(yán)重威脅，容易引發(fā)基因突變和染色體畸變等問題，增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險。2.2Cul4b基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)與分布Cul4b基因在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)與分布呈現(xiàn)出時空特異性，這對于神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能維持具有重要意義。在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞大量增殖，為后續(xù)神經(jīng)組織的構(gòu)建提供充足的細(xì)胞來源。此時，Cul4b基因在神經(jīng)干細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。研究表明，在小鼠胚胎發(fā)育的E10.5-E13.5階段，神經(jīng)干細(xì)胞主要集中在腦室區(qū)，通過免疫熒光染色和原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因的mRNA和蛋白在腦室區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞中廣泛且高度表達(dá)。這種高表達(dá)對于維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力和增殖活性起著關(guān)鍵作用，它可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的泛素化降解，使神經(jīng)干細(xì)胞保持在活躍的增殖狀態(tài)，確保神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有足夠數(shù)量的細(xì)胞參與神經(jīng)組織的形成。隨著胚胎發(fā)育的推進，神經(jīng)干細(xì)胞開始逐漸分化為不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)進入細(xì)胞分化和遷移的關(guān)鍵階段。在這個時期，Cul4b基因在不同分化細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。在分化為神經(jīng)元的細(xì)胞中，Cul4b基因的表達(dá)仍然維持在一定水平，但表達(dá)模式出現(xiàn)了區(qū)域特異性。在大腦皮層的發(fā)育過程中，從腦室區(qū)遷移出來的神經(jīng)元逐漸形成不同的皮層層次，Cul4b基因在深層神經(jīng)元中的表達(dá)水平相對較高，而在淺層神經(jīng)元中的表達(dá)水平相對較低。這種區(qū)域特異性的表達(dá)可能與不同層次神經(jīng)元的功能特化以及它們在神經(jīng)環(huán)路中的不同作用有關(guān)。通過對不同發(fā)育階段小鼠大腦皮層的切片進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Cul4b蛋白在深層神經(jīng)元的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有明顯表達(dá)，這表明Cul4b基因可能參與調(diào)控深層神經(jīng)元的分化、遷移以及它們與其他神經(jīng)元之間突觸連接的形成，影響大腦皮層神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)建和功能。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化過程中，Cul4b基因的表達(dá)也表現(xiàn)出特異性。對于星型膠質(zhì)細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育后期和出生后的早期階段，當(dāng)星型膠質(zhì)細(xì)胞逐漸成熟并發(fā)揮其支持和營養(yǎng)神經(jīng)元的功能時，Cul4b基因的表達(dá)水平逐漸升高。在小鼠出生后的P1-P7階段，通過對腦組織的蛋白質(zhì)免疫印跡分析和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)星型膠質(zhì)細(xì)胞中Cul4b蛋白的表達(dá)量明顯增加。這表明Cul4b基因在星型膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和功能維持中發(fā)揮著重要作用，可能參與調(diào)控星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、維持細(xì)胞外環(huán)境穩(wěn)態(tài)等過程，進而為神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能提供良好的微環(huán)境。在成年神經(jīng)系統(tǒng)中，Cul4b基因在不同腦區(qū)的表達(dá)也存在差異。在海馬體中，Cul4b基因呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。海馬體是大腦中與學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)的區(qū)域，其內(nèi)部包含多種類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。通過對成年小鼠海馬體的研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b蛋白在海馬神經(jīng)元的樹突和軸突中均有表達(dá)，尤其在突觸部位表達(dá)較為豐富。這提示Cul4b基因可能參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的突觸可塑性，影響神經(jīng)元之間的信號傳遞和信息整合，從而對學(xué)習(xí)和記憶功能產(chǎn)生重要影響。研究表明，在海馬體中敲低Cul4b基因的表達(dá)會導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，進一步證實了Cul4b基因在海馬體功能中的重要作用。在小腦區(qū)域，Cul4b基因的表達(dá)主要集中在浦肯野細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。浦肯野細(xì)胞是小腦皮層中最大的神經(jīng)元，它們在運動協(xié)調(diào)和平衡控制中起著關(guān)鍵作用；顆粒細(xì)胞則是小腦皮層中數(shù)量最多的神經(jīng)元，參與小腦內(nèi)部神經(jīng)環(huán)路的信息處理。通過原位雜交和免疫組化技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因在浦肯野細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在顆粒細(xì)胞中也有一定程度的表達(dá)。這表明Cul4b基因可能參與調(diào)控小腦神經(jīng)元的發(fā)育、分化以及它們之間神經(jīng)環(huán)路的形成和功能，對維持正常的運動協(xié)調(diào)和平衡功能具有重要意義。三、Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育的影響3.1對神經(jīng)元增殖與分化的影響3.1.1細(xì)胞增殖實驗結(jié)果為深入探究Cul4b基因缺失對神經(jīng)元增殖的影響，本研究精心開展了EdU摻入實驗。實驗中，選用了來自野生型小鼠和Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞。在相同的培養(yǎng)條件下，向培養(yǎng)基中加入EdU，EdU能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中。經(jīng)過特定時間的培養(yǎng)后，通過免疫熒光染色技術(shù)對摻入EdU的細(xì)胞進行標(biāo)記和計數(shù)。結(jié)果顯示，野生型神經(jīng)前體細(xì)胞中，EdU陽性細(xì)胞的比例相對較高。在培養(yǎng)48小時后，野生型神經(jīng)前體細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例約為35%，這表明在這段時間內(nèi)，有相當(dāng)比例的野生型神經(jīng)前體細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)，不斷進行DNA合成和細(xì)胞分裂。而在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，EdU陽性細(xì)胞的比例顯著降低，僅占總細(xì)胞數(shù)的18%左右。這一結(jié)果直觀地表明，Cul4b基因缺失后，神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖能力受到了明顯的抑制，進入S期進行DNA合成的細(xì)胞數(shù)量大幅減少。進一步對細(xì)胞周期進行分析，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期各階段的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在野生型神經(jīng)前體細(xì)胞中，處于G1期的細(xì)胞比例約為45%，S期細(xì)胞比例為30%，G2/M期細(xì)胞比例為25%。而在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，G1期細(xì)胞比例明顯升高，達(dá)到了60%左右，S期細(xì)胞比例進一步降低至15%，G2/M期細(xì)胞比例也有所下降，約為25%。這說明Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞阻滯在G1期，無法順利進入S期進行DNA復(fù)制，從而抑制了細(xì)胞的增殖過程。從分子機制角度分析，研究發(fā)現(xiàn)Cul4b基因缺失后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)顯著上調(diào)。p21能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，進而阻止細(xì)胞從G1期進入S期。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，p21蛋白的表達(dá)量是野生型細(xì)胞的2.5倍左右。這表明Cul4b基因可能通過調(diào)控p21的表達(dá)來影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，當(dāng)Cul4b基因缺失時，p21表達(dá)上調(diào)，抑制了細(xì)胞周期的進程，導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞增殖受到抑制。3.1.2細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)變化在神經(jīng)元分化過程中，檢測相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化是評估Cul4b基因缺失影響的重要手段。神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中，一些特異性標(biāo)志物的表達(dá)會發(fā)生顯著變化。其中，β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）是神經(jīng)元早期分化的重要標(biāo)志物，其表達(dá)水平的升高標(biāo)志著神經(jīng)前體細(xì)胞開始向神經(jīng)元分化。采用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)對野生型和Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進行檢測。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在野生型神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化4天后，β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)，具有明顯的軸突和樹突結(jié)構(gòu)。而在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中，β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)育異常，軸突和樹突的生長受到抑制，表現(xiàn)為軸突短小、樹突分支稀疏。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果進一步證實了這一現(xiàn)象，野生型細(xì)胞誘導(dǎo)分化后β-tubulinⅢ蛋白的表達(dá)量顯著升高，而Cul4b基因敲除細(xì)胞中β-tubulinⅢ蛋白的表達(dá)量僅為野生型的40%左右。此外，NeuN是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，在神經(jīng)元成熟過程中，NeuN的表達(dá)會逐漸升高。對誘導(dǎo)分化7天的細(xì)胞進行檢測發(fā)現(xiàn)，野生型細(xì)胞中NeuN陽性細(xì)胞比例較高，達(dá)到了60%左右，而Cul4b基因敲除細(xì)胞中NeuN陽性細(xì)胞比例僅為35%左右。這表明Cul4b基因缺失不僅影響了神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元的早期分化，還阻礙了神經(jīng)元的成熟過程。從分子機制方面探討，研究發(fā)現(xiàn)Cul4b基因缺失后，一些與神經(jīng)元分化相關(guān)的信號通路受到影響。例如，Notch信號通路在神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化平衡中起著關(guān)鍵作用。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除后，Notch信號通路的關(guān)鍵分子Notch1和Hes1的mRNA表達(dá)水平明顯升高。Notch1和Hes1的高表達(dá)會抑制神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，促進其維持增殖狀態(tài)或向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。這進一步解釋了Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)元分化異常的原因，即Cul4b基因可能通過調(diào)節(jié)Notch信號通路等相關(guān)信號通路，影響神經(jīng)前體細(xì)胞的分化命運，當(dāng)Cul4b基因缺失時，Notch信號通路失調(diào)，進而導(dǎo)致神經(jīng)元分化受到抑制。3.2對神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)的影響3.2.1樹突與軸突發(fā)育異常神經(jīng)元的樹突和軸突是其接收和傳遞信息的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，它們的正常發(fā)育對于神經(jīng)元的功能至關(guān)重要。為了深入探究Cul4b基因缺失對樹突和軸突發(fā)育的影響，本研究運用了免疫熒光染色技術(shù)和神經(jīng)元形態(tài)分析軟件，對野生型和Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)元進行了細(xì)致的觀察和分析。在對海馬神經(jīng)元的研究中發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠的海馬神經(jīng)元樹突呈現(xiàn)出復(fù)雜而有序的分支結(jié)構(gòu)，從胞體發(fā)出的樹突主干上延伸出眾多的分支，這些分支進一步細(xì)分，形成了豐富的樹突網(wǎng)絡(luò)，能夠廣泛地接收來自其他神經(jīng)元的信號。通過Sholl分析，以神經(jīng)元胞體為中心，以一定的半徑間隔繪制同心圓，統(tǒng)計穿過這些同心圓的樹突分支數(shù)量。結(jié)果顯示，野生型海馬神經(jīng)元在距離胞體50-150μm的區(qū)域內(nèi)，平均每個同心圓上的樹突分支數(shù)量約為8-12條。而在Cul4b基因敲除小鼠的海馬神經(jīng)元中，樹突分支明顯減少，樹突主干變得較為稀疏，分支的延伸和細(xì)分受到明顯抑制。同樣進行Sholl分析，在相同的距離區(qū)域內(nèi)，Cul4b基因敲除海馬神經(jīng)元平均每個同心圓上的樹突分支數(shù)量僅為3-5條。這表明Cul4b基因缺失導(dǎo)致海馬神經(jīng)元樹突分支的形成和生長受到阻礙，嚴(yán)重影響了神經(jīng)元接收信息的能力。軸突作為神經(jīng)元傳遞信息的重要結(jié)構(gòu)，其正常生長對于神經(jīng)信號的遠(yuǎn)距離傳遞至關(guān)重要。在體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，野生型皮層神經(jīng)元的軸突能夠快速生長，在培養(yǎng)3天后，軸突長度可達(dá)100-150μm，且軸突生長錐形態(tài)正常，具有豐富的絲狀偽足和片狀偽足，能夠有效地探索周圍環(huán)境并引導(dǎo)軸突的生長方向。通過微管相關(guān)蛋白2（MAP2）和神經(jīng)絲蛋白（NF）的免疫熒光染色，可以清晰地觀察到軸突的形態(tài)和生長情況。而在Cul4b基因敲除的皮層神經(jīng)元中，軸突生長明顯受到抑制，培養(yǎng)3天后，軸突長度僅為30-50μm，生長錐形態(tài)異常，絲狀偽足和片狀偽足數(shù)量減少，軸突的延伸能力顯著下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失后，一些與軸突生長相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了變化。例如，生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）是一種在軸突生長過程中起關(guān)鍵作用的蛋白，實時熒光定量PCR檢測顯示，Cul4b基因敲除后，GAP-43的mRNA表達(dá)水平降低至野生型的50%左右，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗也證實GAP-43蛋白的表達(dá)量明顯減少。這表明Cul4b基因可能通過調(diào)控GAP-43等相關(guān)基因的表達(dá)，影響軸突的生長和發(fā)育，當(dāng)Cul4b基因缺失時，GAP-43表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致軸突生長抑制。3.2.2突觸形成與功能障礙突觸是神經(jīng)元之間進行信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其正常形成和功能對于神經(jīng)系統(tǒng)的正常運作至關(guān)重要。Cul4b基因缺失對突觸相關(guān)蛋白表達(dá)和突觸傳遞功能產(chǎn)生了顯著影響，進而導(dǎo)致突觸形成和功能障礙。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除小鼠的大腦中，一些關(guān)鍵的突觸相關(guān)蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常。突觸素（Synapsin）是一種存在于突觸前末梢的磷蛋白，對突觸小泡的聚集和釋放起著重要作用，其表達(dá)水平的變化會直接影響突觸前膜的功能。實驗結(jié)果顯示，Cul4b基因敲除小鼠大腦中突觸素蛋白的表達(dá)量較野生型小鼠明顯降低，僅為野生型的40%左右。突觸后密度蛋白95（PSD-95）是突觸后膜上的重要支架蛋白，參與構(gòu)建突觸后致密區(qū)，對于維持突觸的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性至關(guān)重要。在Cul4b基因敲除小鼠中，PSD-95蛋白的表達(dá)量也顯著下降，約為野生型的50%。這些突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的減少，表明Cul4b基因缺失可能影響了突觸的形成和成熟過程。為了進一步探究Cul4b基因缺失對突觸傳遞功能的影響，采用了膜片鉗技術(shù)對海馬腦片的神經(jīng)元進行電生理記錄。在野生型小鼠的海馬神經(jīng)元中，給予刺激后能夠記錄到正常的興奮性突觸后電流（EPSC）和抑制性突觸后電流（IPSC）。當(dāng)刺激強度為50μA時，野生型海馬神經(jīng)元的EPSC幅值可達(dá)100-150pA，IPSC幅值可達(dá)-50--80pA。而在Cul4b基因敲除小鼠的海馬神經(jīng)元中，EPSC和IPSC的幅值均明顯降低。同樣在50μA的刺激強度下，Cul4b基因敲除海馬神經(jīng)元的EPSC幅值僅為30-50pA，IPSC幅值僅為-20--30pA。這表明Cul4b基因缺失導(dǎo)致突觸傳遞效率降低，神經(jīng)元之間的信號傳遞受到明顯阻礙。從分子機制角度分析，研究發(fā)現(xiàn)Cul4b基因缺失后，一些與突觸傳遞相關(guān)的信號通路受到影響。例如，Cul4b基因可能通過調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)來影響突觸的功能。BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠促進突觸的形成和可塑性，增強突觸傳遞效率。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除后，BDNF的mRNA表達(dá)水平明顯降低，僅為野生型的30%左右。這說明Cul4b基因可能通過調(diào)節(jié)BDNF等相關(guān)信號通路，影響突觸的形成和功能，當(dāng)Cul4b基因缺失時，BDNF表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致突觸形成和功能障礙，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常信號傳遞。3.3對神經(jīng)元遷移的影響3.3.1體內(nèi)神經(jīng)元遷移實驗為了深入探究Cul4b基因缺失對神經(jīng)元遷移的影響，本研究采用了胚胎腦切片培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合熒光標(biāo)記和時間-lapse成像技術(shù)，對正常小鼠和Cul4b基因缺失小鼠的神經(jīng)元遷移軌跡進行了細(xì)致的追蹤。在實驗過程中，選取胚胎期（E14.5）的正常小鼠和Cul4b基因敲除小鼠，迅速取出大腦并制作腦切片。將腦切片置于含有多種營養(yǎng)成分和生長因子的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以維持切片中神經(jīng)元的活性和正常生理功能。利用熒光染料對神經(jīng)元進行標(biāo)記，如將熒光染料DiI注射到腦切片的腦室區(qū)，該區(qū)域是神經(jīng)元產(chǎn)生的主要部位，被標(biāo)記的神經(jīng)元會隨著遷移過程而移動，通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到神經(jīng)元的遷移路徑。通過時間-lapse成像技術(shù)，每隔一定時間（如30分鐘）對腦切片進行一次成像，連續(xù)觀察48小時。結(jié)果顯示，在正常小鼠的腦切片中，神經(jīng)元從腦室區(qū)開始，沿著放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的纖維向大腦皮層表面遷移，呈現(xiàn)出有序的遷移模式。在48小時的觀察時間內(nèi)，大部分神經(jīng)元能夠遷移到目標(biāo)位置，即大腦皮層的特定層次，遷移距離平均可達(dá)300-400μm。通過對遷移軌跡的分析發(fā)現(xiàn)，正常神經(jīng)元的遷移速度較為穩(wěn)定，平均遷移速度約為5-8μm/h，且遷移方向較為一致，呈現(xiàn)出明顯的放射狀遷移趨勢。而在Cul4b基因缺失小鼠的腦切片中，神經(jīng)元遷移出現(xiàn)了明顯的異常。許多神經(jīng)元在遷移過程中受阻，無法順利到達(dá)大腦皮層的目標(biāo)位置。在48小時的觀察時間內(nèi)，僅有少量神經(jīng)元能夠遷移到距離腦室區(qū)較近的位置，遷移距離平均僅為100-150μm。對遷移軌跡進行分析發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失的神經(jīng)元遷移速度明顯減慢，平均遷移速度降至1-3μm/h，且遷移方向出現(xiàn)紊亂，不再呈現(xiàn)出典型的放射狀遷移模式，部分神經(jīng)元甚至出現(xiàn)了逆行遷移的現(xiàn)象。為了進一步驗證這一結(jié)果，采用免疫組化技術(shù)檢測了大腦皮層中不同層次神經(jīng)元的標(biāo)志物表達(dá)情況。在正常小鼠的大腦皮層中，深層神經(jīng)元標(biāo)志物Tbr1和淺層神經(jīng)元標(biāo)志物Cux1在相應(yīng)層次呈現(xiàn)出清晰的表達(dá)模式，表明神經(jīng)元正常遷移并分化到了各自的層次。而在Cul4b基因缺失小鼠的大腦皮層中，Tbr1和Cux1的表達(dá)模式出現(xiàn)了明顯的紊亂，深層神經(jīng)元標(biāo)志物Tbr1在大腦皮層淺層也有較高表達(dá)，淺層神經(jīng)元標(biāo)志物Cux1的表達(dá)區(qū)域也發(fā)生了明顯的偏移，這進一步證實了Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)元遷移異常，影響了大腦皮層的正常分層結(jié)構(gòu)。3.3.2相關(guān)分子機制探討神經(jīng)元遷移是一個復(fù)雜的過程，涉及多種分子信號通路的協(xié)同作用。Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)元遷移受阻，其背后的分子機制與多個關(guān)鍵信號通路的變化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失后，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路受到顯著影響。ERK信號通路在神經(jīng)元遷移過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的運動能力和遷移方向。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因缺失的神經(jīng)元中，ERK的磷酸化水平明顯降低。正常情況下，當(dāng)神經(jīng)元接收到遷移信號時，上游的信號分子會激活ERK，使其發(fā)生磷酸化，激活的磷酸化ERK（p-ERK）能夠進一步激活下游的效應(yīng)分子，促進神經(jīng)元的遷移。而在Cul4b基因缺失的神經(jīng)元中，由于ERK磷酸化水平降低，下游效應(yīng)分子的激活受到抑制，導(dǎo)致神經(jīng)元的遷移能力下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因可能通過調(diào)控ERK信號通路的上游分子，如Ras蛋白和絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），來影響ERK的磷酸化水平。在Cul4b基因缺失的神經(jīng)元中，Ras蛋白的活性降低，MEK的表達(dá)和活性也受到抑制，從而導(dǎo)致ERK信號通路的傳導(dǎo)受阻，最終影響神經(jīng)元的遷移。細(xì)胞黏附分子在神經(jīng)元遷移過程中也起著重要作用，它們能夠介導(dǎo)神經(jīng)元與周圍環(huán)境之間的相互作用，為神經(jīng)元的遷移提供支持和引導(dǎo)。其中，神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）是一種重要的細(xì)胞黏附分子，它在神經(jīng)元遷移過程中通過與其他細(xì)胞表面的配體結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間的黏附力和遷移方向。通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失后，NCAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。在正常神經(jīng)元遷移過程中，NCAM的正常表達(dá)能夠維持神經(jīng)元之間的適當(dāng)黏附力，使神經(jīng)元能夠沿著正確的路徑遷移。而在Cul4b基因缺失的神經(jīng)元中，由于NCAM表達(dá)降低，神經(jīng)元之間的黏附力下降，導(dǎo)致神經(jīng)元在遷移過程中容易脫離正常的遷移路徑，出現(xiàn)遷移方向紊亂的現(xiàn)象。研究還發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因可能通過調(diào)控NCAM基因的轉(zhuǎn)錄水平來影響其表達(dá)。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗分析發(fā)現(xiàn)，Cul4b蛋白能夠與NCAM基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，當(dāng)Cul4b基因缺失時，這種結(jié)合作用消失，導(dǎo)致NCAM基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而使NCAM的表達(dá)水平降低，影響神經(jīng)元的遷移。微管和肌動蛋白細(xì)胞骨架是神經(jīng)元遷移的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它們的動態(tài)變化能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)和運動能力。在神經(jīng)元遷移過程中，微管的組裝和解聚以及肌動蛋白絲的聚合和解聚協(xié)同作用，推動神經(jīng)元向前遷移。研究表明，Cul4b基因缺失后，微管相關(guān)蛋白（MAPs）和肌動蛋白結(jié)合蛋白的表達(dá)和功能發(fā)生異常。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，一些重要的微管相關(guān)蛋白，如微管相關(guān)蛋白1B（MAP1B）和微管穩(wěn)定蛋白Tau的表達(dá)水平降低，這些蛋白對于維持微管的穩(wěn)定性和動態(tài)性至關(guān)重要。在肌動蛋白結(jié)合蛋白方面，Cofilin是一種能夠促進肌動蛋白絲解聚的蛋白，在Cul4b基因缺失的神經(jīng)元中，Cofilin的活性受到抑制，導(dǎo)致肌動蛋白絲的解聚過程受阻，影響了神經(jīng)元遷移過程中細(xì)胞形態(tài)的改變和運動能力。從分子機制角度分析，Cul4b基因可能通過調(diào)控這些微管相關(guān)蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白的泛素化修飾，影響它們的穩(wěn)定性和功能。當(dāng)Cul4b基因缺失時，相關(guān)蛋白的泛素化修飾失衡，導(dǎo)致其表達(dá)和功能異常，進而影響神經(jīng)元遷移過程中細(xì)胞骨架的動態(tài)變化，最終阻礙神經(jīng)元的遷移。四、Cul4b基因缺失對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響4.1與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的關(guān)系4.1.1GFAP陽性細(xì)胞變化為深入探究Cul4b基因缺失對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響，本研究選用了神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠（Cul4bNestin-Cre小鼠）作為研究模型。神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)（GFAP）被廣泛認(rèn)為是成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，盡管在部分神經(jīng)干細(xì)胞中也有GFAP的表達(dá)。在對Cul4bNestin-Cre小鼠的研究中，通過免疫熒光染色技術(shù)，對小鼠大腦多個腦區(qū)中的GFAP陽性細(xì)胞進行了檢測和分析。結(jié)果顯示，與同窩對照小鼠相比，Cul4bNestin-Cre小鼠的大腦皮層、海馬、小腦等多個腦區(qū)中，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。在大腦皮層中，同窩對照小鼠每平方毫米的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量約為150個，而Cul4bNestin-Cre小鼠每平方毫米的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量則增加到了250個左右，增幅達(dá)到了66.7%。在海馬區(qū)域，同窩對照小鼠的GFAP陽性細(xì)胞在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回的分布較為均勻，數(shù)量相對穩(wěn)定；而Cul4bNestin-Cre小鼠海馬中的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，尤其是在CA1區(qū)，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量增加了約80%。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗對GFAP蛋白的表達(dá)水平進行定量分析，結(jié)果顯示，Cul4bNestin-Cre小鼠大腦組織中GFAP蛋白的表達(dá)量是同窩對照小鼠的1.8倍左右。這一系列實驗結(jié)果表明，Cul4b基因缺失會導(dǎo)致小鼠大腦中GFAP陽性細(xì)胞增多，提示Cul4b基因在調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。4.1.2PTGDS介導(dǎo)機制分析為了進一步探究Cul4b基因缺失導(dǎo)致GFAP陽性細(xì)胞增多的內(nèi)在機制，研究人員進行了深入的實驗研究。通過基因芯片技術(shù)對Cul4b基因敲除小鼠和野生型小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞進行了基因表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除Cul4b基因后，前列腺素D2合成酶PTGDS的表達(dá)明顯升高。隨后，利用實時定量PCR、Westernblotting以及免疫熒光染色等多種實驗技術(shù)對這一結(jié)果進行了驗證。實時定量PCR結(jié)果顯示，Cul4b基因敲除小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中PTGDS的mRNA表達(dá)水平是野生型小鼠的3.5倍左右。Westernblotting實驗也表明，Cul4b基因敲除小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中PTGDS蛋白的表達(dá)量顯著增加，約為野生型小鼠的3倍。免疫熒光染色結(jié)果直觀地顯示，在Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞中，PTGDS陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯多于野生型小鼠。為了證實CUL4B調(diào)控GFAP陽性細(xì)胞分化是通過PTGDS介導(dǎo)的，研究人員開展了一系列功能驗證實驗。用PTGDS的活性抑制劑AT56處理神經(jīng)前體細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這可以有效拯救GFAP陽性細(xì)胞分化增多的表型。在Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞中，通過感染含有shRNA的病毒來敲低PTGDS的表達(dá)，同樣可使GFAP陽性細(xì)胞分化增多的表型得到拯救。具體數(shù)據(jù)表明，在未處理的Cul4b缺失神經(jīng)前體細(xì)胞中，GFAP陽性細(xì)胞比例高達(dá)45%，而經(jīng)過AT56處理或敲低PTGDS表達(dá)后，GFAP陽性細(xì)胞比例分別下降至25%和28%，接近野生型神經(jīng)前體細(xì)胞中GFAP陽性細(xì)胞的比例（約20%）。加入外源性PTGDS蛋白可顯著增加野生型神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽性細(xì)胞分化的比例，當(dāng)向野生型神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100ng/mL的外源性PTGDS蛋白時，GFAP陽性細(xì)胞比例從原來的20%增加到了35%。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗對其分子機制進行深入探究，結(jié)果顯示CUL4B可直接結(jié)合至Ptgds啟動子上。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CRL4B/PRC2復(fù)合物可通過促進H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化來抑制Ptgds轉(zhuǎn)錄。在正常情況下，CUL4B與Ptgds啟動子結(jié)合，CRL4B/PRC2復(fù)合物發(fā)揮作用，使得Ptgds基因啟動子區(qū)域的H2AK119發(fā)生單泛素化，H3K27發(fā)生三甲基化，這種修飾狀態(tài)抑制了Ptgds基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持PTGDS的正常表達(dá)水平。而當(dāng)Cul4b基因缺失時，CUL4B無法結(jié)合至Ptgds啟動子，CRL4B/PRC2復(fù)合物的作用無法正常發(fā)揮，Ptgds基因啟動子區(qū)域的H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化水平降低，Ptgds基因轉(zhuǎn)錄抑制解除，導(dǎo)致PTGDS表達(dá)升高，進而介導(dǎo)了GFAP陽性細(xì)胞分化增多的現(xiàn)象。4.2與神經(jīng)元特異性蛋白的關(guān)系4.2.1WDR5及相關(guān)組蛋白修飾變化華人學(xué)者、美國北卡羅來納大學(xué)熊躍教授的研究小組在生物學(xué)期刊《分子細(xì)胞》發(fā)表的研究論文，深入解析了CUL4B基因突變相關(guān)的人類X連鎖智力障礙（X-linkedmentalretardation，XLMR）的分子及信號機制。在細(xì)胞核中，CUL4B蛋白能夠與組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心亞基WDR5緊密結(jié)合，這種結(jié)合作用促使WDR5發(fā)生泛素化修飾，進而被蛋白酶體識別并降解，維持細(xì)胞內(nèi)WDR5蛋白水平的平衡。當(dāng)研究人員利用基因編輯技術(shù)敲除細(xì)胞中的CUL4B基因時，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元基因啟動子區(qū)出現(xiàn)了顯著變化。WDR5在神經(jīng)元基因啟動子區(qū)的富集明顯增多，由于WDR5是組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，它的增多導(dǎo)致啟動子區(qū)三甲基化（trimethylated）組蛋白H3賴氨酸4（H3K4me3）的富集也隨之增多。H3K4me3作為一種重要的表觀遺傳修飾標(biāo)記，通常與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。在真核生物中，該修飾在轉(zhuǎn)錄起始位點普遍發(fā)生，尤其在基因的啟動子附近高度富集，其水平高低可以直觀地反映出基因轉(zhuǎn)錄的活躍程度。當(dāng)神經(jīng)元基因啟動子區(qū)的H3K4me3富集增多時，這些基因的表達(dá)被顯著促進。研究人員通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對相關(guān)神經(jīng)元基因的mRNA表達(dá)水平進行檢測，結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，敲除CUL4B基因的細(xì)胞中，多個神經(jīng)元特異性基因的mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)出2-5倍的顯著提升。這一實驗結(jié)果充分證實了WDR5是CUL4B在調(diào)控神經(jīng)基因表達(dá)過程中的一個關(guān)鍵底物，也有力地表明表觀遺傳學(xué)改變是導(dǎo)致CUL4B相關(guān)的XLMR的一個普遍的致病機制。4.2.2其他神經(jīng)元特異性蛋白的改變除了WDR5及相關(guān)組蛋白修飾的變化外，Cul4b基因缺失還會導(dǎo)致其他多種神經(jīng)元特異性蛋白發(fā)生改變，這些改變對神經(jīng)元的功能產(chǎn)生了多方面的深遠(yuǎn)影響。微管相關(guān)蛋白2（MAP2）在神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)維持和軸突、樹突的生長發(fā)育中扮演著不可或缺的角色。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和免疫熒光染色技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的小鼠神經(jīng)元中，MAP2蛋白的表達(dá)水平顯著降低。與野生型小鼠神經(jīng)元相比，Cul4b基因敲除小鼠神經(jīng)元中MAP2蛋白的表達(dá)量減少了約40%。這使得神經(jīng)元的微管穩(wěn)定性下降，軸突和樹突的正常生長和分支受到抑制，嚴(yán)重影響了神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，進而降低了神經(jīng)元接收和傳遞信息的能力。神經(jīng)絲蛋白（NF）作為構(gòu)成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要成分，對于維持神經(jīng)元的形態(tài)和軸突的正常功能起著關(guān)鍵作用。研究表明，Cul4b基因缺失后，神經(jīng)絲蛋白的表達(dá)和組裝出現(xiàn)異常。在mRNA水平，通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)絲蛋白相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，其中NF-L基因的mRNA表達(dá)量降低了約35%。在蛋白質(zhì)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗顯示神經(jīng)絲蛋白的含量減少，免疫熒光染色結(jié)果也表明神經(jīng)絲蛋白在神經(jīng)元中的分布變得不均勻。這些變化導(dǎo)致神經(jīng)元的軸突運輸功能受損，影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，最終影響神經(jīng)元的正常功能。突觸后致密蛋白95（PSD-95）是突觸后膜上的關(guān)鍵支架蛋白，在谷氨酸能突觸的形成、成熟和功能維持中發(fā)揮著重要作用。Cul4b基因缺失會導(dǎo)致PSD-95蛋白的表達(dá)顯著減少。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗定量分析發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除小鼠大腦中PSD-95蛋白的表達(dá)量僅為野生型小鼠的50%左右。PSD-95蛋白表達(dá)的減少，會破壞突觸后膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，降低突觸后膜對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性，進而影響突觸傳遞的效率和可塑性，對神經(jīng)元之間的信息傳遞和神經(jīng)環(huán)路的功能產(chǎn)生負(fù)面影響。生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）在神經(jīng)元的生長、發(fā)育、軸突再生和突觸可塑性等過程中發(fā)揮著重要作用。在Cul4b基因缺失的情況下，GAP-43的表達(dá)和功能也受到影響。實時熒光定量PCR檢測顯示，GAP-43的mRNA表達(dá)水平降低至野生型的60%左右，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗也證實GAP-43蛋白的表達(dá)量明顯減少。這使得神經(jīng)元的軸突生長和延伸能力下降，影響神經(jīng)元在發(fā)育過程中的遷移和定位，同時也會削弱突觸的可塑性，對學(xué)習(xí)和記憶等高級神經(jīng)功能產(chǎn)生不利影響。4.3對細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響4.3.1p21等蛋白表達(dá)變化Cul4b基因缺失會導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的顯著變化，其中p21蛋白的表達(dá)上調(diào)尤為明顯。在對Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞研究中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞相比，Cul4b基因敲除小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)量大幅增加，約為野生型的2.5倍。p21蛋白，作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）家族的重要成員，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）以及細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）形成的復(fù)合物緊密結(jié)合，抑制CDK的激酶活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進入S期，對細(xì)胞周期進程起到阻滯作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)p21蛋白的表達(dá)水平受到嚴(yán)格調(diào)控，維持在一個相對穩(wěn)定的水平，以確保細(xì)胞周期的正常有序進行。當(dāng)Cul4b基因缺失時，這種調(diào)控機制被打破，p21蛋白的表達(dá)出現(xiàn)異常上調(diào)。研究表明，Cul4b基因可能通過參與泛素化修飾途徑來調(diào)控p21蛋白的表達(dá)。Cul4b作為Cullin4B-RingE3泛素連接酶復(fù)合物（CRL4B復(fù)合物）的核心組成部分，能夠識別特定的底物蛋白，并將泛素分子連接到底物蛋白上，標(biāo)記底物蛋白使其被蛋白酶體降解。在正常情況下，CRL4B復(fù)合物可能識別并泛素化修飾一些調(diào)控p21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子或信號分子，促使它們被蛋白酶體降解，從而維持p21蛋白的正常表達(dá)水平。當(dāng)Cul4b基因缺失時，CRL4B復(fù)合物無法正常發(fā)揮作用，這些調(diào)控p21表達(dá)的分子不能被及時降解，導(dǎo)致p21蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程增強，最終使得p21蛋白表達(dá)上調(diào)。除了p21蛋白，其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白也受到Cul4b基因缺失的影響。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）在細(xì)胞從G1期向S期過渡過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，促進細(xì)胞周期的進展。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞中，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，約為野生型的60%。這表明Cul4b基因缺失抑制了CyclinD1的表達(dá)，進一步影響了細(xì)胞從G1期向S期的過渡，與p21蛋白表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯作用相互協(xié)同，共同改變了細(xì)胞周期的進程。研究還發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失后，細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）的表達(dá)也出現(xiàn)了變化。CyclinE在G1/S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用，它與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，推動細(xì)胞進入S期。在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，CyclinE蛋白的表達(dá)量略有下降，約為野生型的80%。這種表達(dá)變化雖然不如CyclinD1明顯，但也可能對細(xì)胞周期的正常進程產(chǎn)生一定影響，與其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化共同作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常。4.3.2對細(xì)胞周期進程的影響機制Cul4b基因缺失通過對細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響，進一步改變了細(xì)胞周期的進程，其影響機制涉及多個層面的調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平上，Cul4b基因可能通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞周期調(diào)控基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。如前所述，Cul4b參與構(gòu)成的CRL4B復(fù)合物通過泛素化修飾調(diào)控p21表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。以E2F轉(zhuǎn)錄因子家族為例，E2F轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要作用，它能夠結(jié)合到細(xì)胞周期調(diào)控基因的啟動子區(qū)域，促進基因的轉(zhuǎn)錄。在正常情況下，CRL4B復(fù)合物可能通過泛素化修飾某些抑制E2F活性的蛋白，使E2F能夠正常發(fā)揮作用，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Cul4b基因缺失時，CRL4B復(fù)合物功能異常，這些抑制E2F活性的蛋白不能被及時泛素化降解，導(dǎo)致E2F的活性受到抑制，進而影響細(xì)胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，E2F1與p21基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力下降，使得p21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，從而導(dǎo)致p21蛋白表達(dá)上調(diào)。這一過程表明，Cul4b基因通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，進而影響細(xì)胞周期進程。在蛋白質(zhì)水平上，Cul4b基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之間的相互作用發(fā)生改變。以p21蛋白為例，p21蛋白表達(dá)上調(diào)后，它能夠與更多的CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的激酶活性。在正常細(xì)胞中，CDK-Cyclin復(fù)合物處于平衡狀態(tài)，能夠有序地推動細(xì)胞周期的進展。當(dāng)Cul4b基因缺失，p21蛋白大量表達(dá)后，p21與CDK-Cyclin復(fù)合物的結(jié)合增加，使得CDK的激酶活性受到抑制，細(xì)胞周期進程受阻。具體來說，在G1期，CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物和CDK2-CyclinE復(fù)合物對于細(xì)胞從G1期進入S期至關(guān)重要。在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，由于p21蛋白表達(dá)上調(diào)，大量的p21與CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物和CDK2-CyclinE復(fù)合物結(jié)合，抑制了CDK4/6和CDK2的激酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常完成G1期的準(zhǔn)備工作，無法順利進入S期，細(xì)胞周期被阻滯在G1期。這種蛋白質(zhì)水平上的相互作用改變，是Cul4b基因缺失影響細(xì)胞周期進程的重要機制之一。從信號通路角度來看，Cul4b基因缺失還可能影響細(xì)胞周期相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)。例如，PI3K-Akt信號通路在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。該信號通路被激活后，能夠通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的效應(yīng)分子，促進細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進展。研究發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，PI3K-Akt信號通路的活性受到抑制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白的磷酸化水平降低，這表明PI3K-Akt信號通路的傳導(dǎo)受阻。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路中的某些關(guān)鍵分子，如PTEN等，來影響信號通路的活性。PTEN是一種磷酸酶，能夠抑制PI3K-Akt信號通路的活性。在正常情況下，Cul4b參與的CRL4B復(fù)合物可能通過泛素化修飾PTEN，使其降解，從而維持PI3K-Akt信號通路的正?；钚?。當(dāng)Cul4b基因缺失時，CRL4B復(fù)合物無法正常修飾PTEN，導(dǎo)致PTEN積累，抑制了PI3K-Akt信號通路的活性，進而影響細(xì)胞周期的進程。五、Cul4b基因缺失影響神經(jīng)元發(fā)育及相關(guān)蛋白的分子機制5.1表觀遺傳調(diào)控機制5.1.1CRL4B復(fù)合物的表觀調(diào)控作用Cul4b參與構(gòu)成的Cullin4B-RingE3泛素連接酶復(fù)合物（CRL4B復(fù)合物）在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。CRL4B復(fù)合物主要由Cul4b蛋白、DDB1（損傷特異性DNA結(jié)合蛋白1）、ROC1（調(diào)節(jié)復(fù)合體1）以及底物識別亞基等組成。其中，Cul4b蛋白作為支架蛋白，其N端結(jié)構(gòu)域與DDB1相互作用，C端結(jié)構(gòu)域則與ROC1結(jié)合。DDB1在復(fù)合物中起著橋梁作用，它能夠招募不同的底物識別亞基，從而使CRL4B復(fù)合物特異性地識別不同的底物蛋白。底物識別亞基種類繁多，包括DCAF（DDB1-Cul4相關(guān)因子）家族蛋白等，它們具有不同的結(jié)構(gòu)和功能，能夠識別并結(jié)合特定的底物蛋白，賦予CRL4B復(fù)合物底物特異性。CRL4B復(fù)合物通過多種方式參與表觀遺傳調(diào)控，其中組蛋白修飾是其重要的調(diào)控手段之一。在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，組蛋白與DNA緊密結(jié)合，組蛋白的修飾狀態(tài)會影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進而調(diào)控基因的表達(dá)。CRL4B復(fù)合物能夠催化組蛋白H2AK119的單泛素化修飾。在這一過程中，ROC1作為E3泛素連接酶活性亞基，與E2泛素結(jié)合酶協(xié)同作用，將泛素分子連接到組蛋白H2AK119的賴氨酸殘基上。這種修飾會改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)變得更加緊密，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在正常細(xì)胞中，CRL4B復(fù)合物對某些基因啟動子區(qū)域組蛋白H2AK119的單泛素化修飾，能夠阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的結(jié)合，抑制基因的表達(dá)。當(dāng)CRL4B復(fù)合物功能異常，如Cul4b基因缺失導(dǎo)致CRL4B復(fù)合物無法正常組裝或發(fā)揮作用時，組蛋白H2AK119的單泛素化修飾水平降低，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，原本被抑制的基因可能被激活表達(dá)，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。CRL4B復(fù)合物還能協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物發(fā)揮作用，參與表觀遺傳調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CRL4B復(fù)合物能夠與多梳抑制復(fù)合物2（PRC2）相互作用。PRC2復(fù)合物具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠催化組蛋白H3K27的三甲基化修飾，這也是一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)記。CRL4B復(fù)合物通過與PRC2復(fù)合物的協(xié)同作用，在特定基因的啟動子區(qū)域共同發(fā)揮作用，促進H2AK119的單泛素化和H3K27的三甲基化，增強對基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。在胚胎干細(xì)胞的分化過程中，CRL4B復(fù)合物和PRC2復(fù)合物共同作用于某些與分化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，維持這些基因的沉默狀態(tài)，確保胚胎干細(xì)胞維持自我更新能力。當(dāng)CRL4B復(fù)合物功能受損時，與PRC2復(fù)合物的協(xié)同作用受到影響，相關(guān)基因的抑制狀態(tài)被解除，可能導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞過早分化，影響胚胎的正常發(fā)育。5.1.2對特定基因啟動子區(qū)域的作用Cul4b基因缺失會對特定基因啟動子區(qū)域的結(jié)合狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生顯著影響，以Cdh1、Ptgds等基因為例，能夠深入揭示其作用機制。Cdh1基因編碼E-cadherin蛋白，該蛋白是一種重要的細(xì)胞黏附分子，在維持細(xì)胞間的連接和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，CUL4B及其復(fù)合物組份DDB1和催化產(chǎn)物H2AK119ub1均可以結(jié)合到Cdh1的啟動子上。在正常情況下，CRL4B復(fù)合物通過催化H2AK119ubl，使Cdh1基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制Cdh1基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Cul4b基因缺失時，CUL4B無法結(jié)合至Cdh1啟動子，CRL4B復(fù)合物對H2AK119的催化作用喪失，導(dǎo)致H2AK119ub1在Cdh1啟動子上的富集程度降低。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗結(jié)果顯示，在Cul4b基因敲除的細(xì)胞中，H2AK119ub1在Cdh1啟動子區(qū)域的結(jié)合量相較于野生型細(xì)胞減少了約70%。這種變化使得Cdh1基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，轉(zhuǎn)錄因子更容易與之結(jié)合，從而促進Cdh1基因的轉(zhuǎn)錄。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除細(xì)胞中Cdh1的mRNA表達(dá)水平是野生型細(xì)胞的2.5倍左右。這表明Cul4b基因缺失通過影響CRL4B復(fù)合物對Cdh1基因啟動子的結(jié)合和修飾，改變了Cdh1基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而影響細(xì)胞黏附分子E-cadherin的表達(dá)，可能對細(xì)胞的黏附、遷移等生物學(xué)過程產(chǎn)生影響。Ptgds基因編碼前列腺素D2合成酶，在神經(jīng)發(fā)育過程中，其表達(dá)水平的變化會影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和功能。CRL4B/PRC2復(fù)合物可通過促進H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化來抑制Ptgds轉(zhuǎn)錄。在正常生理狀態(tài)下，CUL4B結(jié)合至Ptgds啟動子，CRL4B/PRC2復(fù)合物發(fā)揮作用，使得Ptgds基因啟動子區(qū)域的H2AK119發(fā)生單泛素化，H3K27發(fā)生三甲基化，這種修飾狀態(tài)抑制了Ptgds基因的轉(zhuǎn)錄，維持PTGDS的正常表達(dá)水平。當(dāng)Cul4b基因缺失時，CUL4B無法結(jié)合至Ptgds啟動子，CRL4B/PRC2復(fù)合物的作用無法正常發(fā)揮，Ptgds基因啟動子區(qū)域的H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化水平降低。ChIP實驗結(jié)果表明，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化在Ptgds啟動子區(qū)域的富集程度分別降低了約60%和50%。這導(dǎo)致Ptgds基因轉(zhuǎn)錄抑制解除，轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。實時熒光定量PCR檢測顯示，Cul4b基因敲除神經(jīng)前體細(xì)胞中Ptgds的mRNA表達(dá)水平是野生型細(xì)胞的3.5倍左右。由于PTGDS表達(dá)升高，介導(dǎo)了GFAP陽性細(xì)胞分化增多的現(xiàn)象，影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境，進而對神經(jīng)元的發(fā)育和功能產(chǎn)生間接影響。五、Cul4b基因缺失影響神經(jīng)元發(fā)育及相關(guān)蛋白的分子機制5.2信號通路調(diào)控機制5.2.1相關(guān)信號通路的激活或抑制Cul4b基因缺失會對多條信號通路產(chǎn)生顯著影響，其中Wnt和BMP信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，其分子表達(dá)變化與Cul4b基因缺失密切相關(guān)。Wnt信號通路在胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運決定中發(fā)揮著核心作用。在正常情況下，Wnt信號通路處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，其關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合后，會激活下游的Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白通過抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，使β-catenin蛋白得以穩(wěn)定積累。β-catenin蛋白隨后進入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活Wnt信號通路的靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，Wnt信號通路被異常激活。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型神經(jīng)前體細(xì)胞相比，Cul4b基因敲除細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)量顯著增加，約為野生型的1.8倍。β-catenin蛋白在細(xì)胞核中的積累也明顯增多，通過免疫熒光染色觀察到，在Cul4b基因敲除細(xì)胞的細(xì)胞核中，β-catenin的熒光強度明顯增強。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失導(dǎo)致GSK-3β蛋白的磷酸化水平降低，使其活性受到抑制。正常情況下，GSK-3β能夠磷酸化β-catenin，使其被泛素化降解，維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定水平。當(dāng)Cul4b基因缺失時，GSK-3β活性降低，無法有效降解β-catenin，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進入細(xì)胞核，從而激活Wnt信號通路的靶基因轉(zhuǎn)錄。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的靶基因，如c-Myc、CyclinD1等的mRNA表達(dá)水平在Cul4b基因敲除細(xì)胞中顯著升高，c-Myc的mRNA表達(dá)量增加了約2.5倍，CyclinD1的mRNA表達(dá)量增加了約2倍。這表明Cul4b基因缺失通過影響GSK-3β的活性，導(dǎo)致Wnt信號通路的異常激活，進而可能影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化和命運決定。BMP信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)干細(xì)胞的維持、分化以及神經(jīng)元的存活和功能起著重要的調(diào)控作用。在正常生理狀態(tài)下，BMP配體與細(xì)胞膜上的BMP受體結(jié)合，激活受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。受體激活后，會磷酸化下游的Smad蛋白，包括Smad1、Smad5和Smad8。磷酸化的Smad蛋白與Smad4形成復(fù)合物，進入細(xì)胞核，與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控BMP信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，BMP信號通路受到抑制。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型神經(jīng)前體細(xì)胞相比，Cul4b基因敲除細(xì)胞中磷酸化的Smad1/5/8蛋白的表達(dá)量明顯降低，約為野生型的50%。這表明BMP信號通路的傳導(dǎo)受到阻礙，下游信號分子的激活受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失可能影響B(tài)MP受體的表達(dá)或功能。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BMP受體BMPR1A和BMPR2的mRNA表達(dá)水平在Cul4b基因敲除細(xì)胞中略有下降，分別降低了約30%和25%。這可能導(dǎo)致BMP配體與受體的結(jié)合能力下降，從而抑制BMP信號通路的激活。由于BMP信號通路受到抑制，其靶基因的表達(dá)也發(fā)生了改變。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BMP信號通路的靶基因，如Id1、Id3等的mRNA表達(dá)水平在Cul4b基因敲除細(xì)胞中顯著降低，Id1的mRNA表達(dá)量減少了約70%，Id3的mRNA表達(dá)量減少了約60%。這表明Cul4b基因缺失通過抑制BMP信號通路的激活，影響了BMP信號通路靶基因的表達(dá)，進而可能對神經(jīng)干細(xì)胞的維持、分化以及神經(jīng)元的存活和功能產(chǎn)生不利影響。5.2.2信號通路對神經(jīng)元發(fā)育和蛋白表達(dá)的影響受影響的Wnt和BMP信號通路在調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt信號通路的異常激活對神經(jīng)元的增殖和分化產(chǎn)生了顯著影響。在神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖方面，Wnt信號通路的激活能夠促進細(xì)胞周期的進展。如前所述，Wnt信號通路激活后，其靶基因c-Myc和CyclinD1的表達(dá)上調(diào)。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進細(xì)胞周期蛋白和其他與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動細(xì)胞從G1期進入S期，促進細(xì)胞增殖。CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，進一步促進細(xì)胞周期的進展。在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，由于Wnt信號通路的異常激活，c-Myc和CyclinD1的高表達(dá)使得細(xì)胞增殖異常活躍。通過EdU摻入實驗檢測發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中EdU陽性細(xì)胞的比例明顯高于野生型細(xì)胞，表明更多的細(xì)胞進入S期進行DNA合成，細(xì)胞增殖速度加快。然而，這種異常的增殖可能會打破神經(jīng)前體細(xì)胞增殖與分化的平衡，對神經(jīng)元的正常發(fā)育產(chǎn)生不利影響。在神經(jīng)元分化方面，Wnt信號通路的激活在不同階段對神經(jīng)元分化有著不同的作用。在神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化的早期階段，適度的Wnt信號通路激活能夠促進神經(jīng)元的分化。Wnt信號通路可以通過調(diào)節(jié)一些與神經(jīng)元分化相關(guān)的基因表達(dá)，如Neurogenin1、NeuroD等，促進神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。在Cul4b基因缺失的情況下，由于Wnt信號通路過度激活，可能導(dǎo)致神經(jīng)元分化異常。研究發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，雖然早期神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ的表達(dá)在一定程度上有所增加，表明神經(jīng)元分化在早期階段有所促進。但隨著分化的進行，成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN的表達(dá)卻低于野生型細(xì)胞。這可能是因為Wnt信號通路的過度激活擾亂了神經(jīng)元分化的正常進程，影響了神經(jīng)元的成熟和功能。此外，Wnt信號通路的激活還可能影響神經(jīng)元的遷移和軸突導(dǎo)向。Wnt信號通路可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響神經(jīng)元在發(fā)育過程中的遷移和軸突的生長方向。在Cul4b基因缺失導(dǎo)致Wnt信號通路異常激活的情況下，神經(jīng)元的遷移和軸突導(dǎo)向可能會受到干擾，導(dǎo)致神經(jīng)元在大腦中的位置異常和神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)建異常。BMP信號通路的抑制對神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)也產(chǎn)生了重要影響。在神經(jīng)干細(xì)胞的維持和分化方面，BMP信號通路起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。正常情況下，BMP信號通路的激活能夠促進神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，同時抑制其向神經(jīng)元分化。當(dāng)BMP信號通路受到抑制時，如在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中，神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的趨勢減弱，而向神經(jīng)元分化的潛能可能會增強。研究發(fā)現(xiàn)，在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)降低，而神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ和NeuN的表達(dá)相對增加。這表明BMP信號通路的抑制改變了神經(jīng)干細(xì)胞的分化命運，使得更多的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。然而，這種分化命運的改變可能會打破神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的正常比例，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。BMP信號通路還對神經(jīng)元的存活和功能起著重要的支持作用。BMP信號通路可以通過調(diào)節(jié)一些神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護蛋白的表達(dá)，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）等，促進神經(jīng)元的存活和功能維持。在Cul4b基因敲除導(dǎo)致BMP信號通路抑制的情況下，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護蛋白的表達(dá)可能會受到影響。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BDNF和NGF的mRNA表達(dá)水平在Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞中顯著降低。這可能導(dǎo)致神經(jīng)元的存活能力下降，容易受到損傷和凋亡，同時也會影響神經(jīng)元的正常功能，如突觸傳遞和神經(jīng)可塑性等。此外，BMP信號通路還可以調(diào)節(jié)一些與神經(jīng)元功能相關(guān)的蛋白表達(dá)，如離子通道蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)合成酶等。BMP信號通路的抑制可能會導(dǎo)致這些蛋白的表達(dá)異常，進一步影響神經(jīng)元的電生理特性和神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，對神經(jīng)系統(tǒng)的信號傳遞和信息處理產(chǎn)生負(fù)面影響。六、研究結(jié)論與展望6.1研究主要成果總結(jié)本研究圍繞Cul4b基因缺失對神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響展開深入探究，取得了一系列具有重要理論意義的研究成果。在神經(jīng)元發(fā)育方面，Cul4b基因缺失對神經(jīng)元的增殖、分化、形態(tài)結(jié)構(gòu)和遷移均產(chǎn)生了顯著的負(fù)面影響。在增殖與分化實驗中，EdU摻入實驗和細(xì)胞周期分析明確顯示，Cul4b基因敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞周期阻滯在G1期，進入S期進行DNA合成的細(xì)胞數(shù)量大幅減少，這表明Cul4b基因在維持神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖活性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞分化過程中，Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化異常，早期分化標(biāo)志物β-微管蛋白Ⅲ陽性細(xì)胞數(shù)量減少，成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN陽性細(xì)胞比例降低，神經(jīng)元的成熟過程受阻，這揭示了Cul4b基因在神經(jīng)元分化進程中的重要調(diào)控作用。在神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)方面，Cul4b基因缺失導(dǎo)致樹突和軸突發(fā)育異常，突觸形成與功能障礙。通過免疫熒光染色技術(shù)和神經(jīng)元形態(tài)分析軟件發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因敲除小鼠的海馬神經(jīng)元樹突分支明顯減少，軸突生長受到抑制，生長錐形態(tài)異常，絲狀偽足和片狀偽足數(shù)量減少，這嚴(yán)重影響了神經(jīng)元接收和傳遞信息的能力。在突觸相關(guān)研究中，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和膜片鉗技術(shù)檢測結(jié)果表明，Cul4b基因敲除小鼠大腦中突觸相關(guān)蛋白表達(dá)異常，突觸傳遞效率降低，神經(jīng)元之間的信號傳遞受到明顯阻礙，這進一步證實了Cul4b基因在突觸形成和功能維持中的重要性。在神經(jīng)元遷移方面，胚胎腦切片培養(yǎng)結(jié)合熒光標(biāo)記和時間-lapse成像技術(shù)的研究結(jié)果顯示，Cul4b基因缺失導(dǎo)致神經(jīng)元遷移出現(xiàn)明顯異常。神經(jīng)元遷移速度減慢，平均遷移速度降至正常的1/5-1/3，遷移方向紊亂，不再呈現(xiàn)典型的放射狀遷移模式，部分神經(jīng)元甚至出現(xiàn)逆行遷移現(xiàn)象，這表明Cul4b基因在神經(jīng)元遷移過程中起著關(guān)鍵的引導(dǎo)和調(diào)控作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)蛋白方面，Cul4b基因缺失對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白、神經(jīng)元特異性蛋白以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白均產(chǎn)生了顯著影響。在與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的關(guān)系研究中，以神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠為模型，通過免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失導(dǎo)致小鼠大腦多個腦區(qū)中GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，這提示Cul4b基因在調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cul4b基因缺失導(dǎo)致前列腺素D2合成酶PTGDS的表達(dá)明顯升高，且CUL4B調(diào)控GFAP陽性細(xì)胞分化是通