共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶制備葡萄糖酸鈉的研究摘要本研究聚焦于共固定化葡萄糖氧化酶（GOD）和過氧化氫酶（CAT）制備葡萄糖酸鈉的工藝。采用特定載體及交聯(lián)劑對(duì)雙酶進(jìn)行固定化，通過單因素及正交試驗(yàn)，系統(tǒng)考察加酶量、pH、緩沖液離子濃度、反應(yīng)溫度、底物濃度等對(duì)固定化效果及制備工藝的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，固定化GOD酶活回收率達(dá)35%，CAT酶活回收率為43%，連續(xù)操作15批次后，酶活力仍能保持初始酶活的73%；制備葡萄糖酸鈉時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)94%，固定化酶重復(fù)使用12次后殘留酶活分別為70%（GOD）和62%（CAT）。該研究為工業(yè)化利用固定化酶生產(chǎn)葡萄糖酸鈉提供了新的思路與技術(shù)參考。關(guān)鍵詞葡萄糖氧化酶；過氧化氫酶；共固定化；葡萄糖酸鈉一、引言葡萄糖酸鈉作為一種重要的有機(jī)酸鹽，在食品、醫(yī)藥、建筑等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。其傳統(tǒng)制備方法存在環(huán)境污染、工藝復(fù)雜等問題。酶法制備葡萄糖酸鈉具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢，成為研究熱點(diǎn)。葡萄糖氧化酶（GOD）能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，而過氧化氫酶（CAT）可及時(shí)分解過氧化氫，避免其對(duì)反應(yīng)體系及酶活性的負(fù)面影響。將GOD和CAT共固定化，有望實(shí)現(xiàn)二者協(xié)同作用，提高葡萄糖酸鈉的制備效率及酶的重復(fù)利用率，降低生產(chǎn)成本。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料葡萄糖氧化酶（GOD）、過氧化氫酶（CAT）；環(huán)氧樹脂ES-4等多種固定化載體；葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸鈉等試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。2.2實(shí)驗(yàn)儀器恒溫振蕩器、pH計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)、離心機(jī)等。2.3固定化酶的制備采用共價(jià)結(jié)合法，以環(huán)氧樹脂ES-4為載體，將GOD和CAT共固定化。具體步驟為：稱取一定量的環(huán)氧樹脂ES-4，用適量的緩沖液溶脹后，加入一定比例的GOD和CAT溶液，在特定溫度、pH及離子強(qiáng)度的緩沖液中，恒溫振蕩反應(yīng)一定時(shí)間，使酶與載體充分結(jié)合，反應(yīng)結(jié)束后，用緩沖液反復(fù)洗滌固定化酶，去除未結(jié)合的酶，即得到共固定化葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶。2.4酶活測定方法GOD酶活測定采用鄰聯(lián)甲苯胺法，在一定條件下，GOD催化葡萄糖生成的過氧化氫與鄰聯(lián)甲苯胺反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，通過測定其在特定波長下的吸光度，計(jì)算GOD酶活。CAT酶活測定采用紫外分光光度法，利用CAT分解過氧化氫，使過氧化氫在240nm處的吸光度下降，根據(jù)吸光度變化速率計(jì)算CAT酶活。2.5葡萄糖酸鈉制備工藝將共固定化酶裝入酶反應(yīng)器中，加入一定濃度的葡萄糖溶液，在適宜的溫度、pH、通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使反應(yīng)體系維持在合適的酸堿度，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)離心、過濾等處理，得到葡萄糖酸鈉溶液，采用高效液相色譜法測定葡萄糖酸鈉的含量及底物轉(zhuǎn)化率。三、結(jié)果與討論3.1固定化條件對(duì)酶活回收率的影響3.1.1加酶量的影響在其他條件固定時(shí)，考察加酶量對(duì)GOD和CAT酶活回收率的作用。隨著加酶量增加，酶活回收率先上升后下降。這是因?yàn)榧用噶枯^低時(shí)，載體表面活性位點(diǎn)未被充分占據(jù)，酶與載體結(jié)合不充分；加酶量過高，酶分子間相互聚集，影響與載體結(jié)合，且過多未結(jié)合酶在洗滌過程中損失，導(dǎo)致酶活回收率降低。確定GOD最佳加酶量為0.5mL，CAT最佳加酶量為1.0mL。3.1.2pH的影響緩沖液pH對(duì)酶活回收率影響顯著。不同酶有其最適pH環(huán)境，在此pH下，酶分子活性中心的解離狀態(tài)及空間構(gòu)象最利于與底物結(jié)合及催化反應(yīng)。對(duì)于GOD和CAT共固定化體系，在pH為6.5時(shí)，二者酶活回收率均較高。當(dāng)pH偏離此值時(shí)，酶分子帶電狀態(tài)改變，影響與載體結(jié)合及酶活性，導(dǎo)致酶活回收率下降。3.1.3磷酸鈉緩沖液離子濃度的影響離子濃度對(duì)酶活回收率有重要影響。離子強(qiáng)度過低，不利于酶分子與載體間的相互作用；離子強(qiáng)度過高，會(huì)產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，使酶分子聚集，同樣影響酶與載體結(jié)合及酶活性。實(shí)驗(yàn)表明，磷酸鈉緩沖液濃度為1.0mol/L時(shí)，共固定化酶活回收率最佳。3.2固定化酶的穩(wěn)定性研究對(duì)固定化酶進(jìn)行連續(xù)操作穩(wěn)定性測試，結(jié)果顯示，連續(xù)操作15批次后，酶活力仍能保持初始酶活的73%。這表明該共固定化方法制備的固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性，其原因在于載體與酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，使酶分子牢固地固定在載體表面，減少了酶在反應(yīng)過程中的流失，且載體對(duì)酶分子有一定的保護(hù)作用，減緩了酶的失活速度。同時(shí)，對(duì)固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行考察，在4℃冰箱中儲(chǔ)存7周后，固定化GOD的殘留酶活保留了90.4%，固定化CAT的剩余酶活為88.5%，說明固定化酶在儲(chǔ)存過程中也能較好地保持酶活性。3.3葡萄糖酸鈉制備工藝條件優(yōu)化3.3.1固定化酶質(zhì)量比的影響考察固定化GOD和固定化CAT的質(zhì)量比對(duì)葡萄糖酸鈉制備的影響。結(jié)果表明，當(dāng)二者質(zhì)量比（濕重）為1∶3時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率最高。這是因?yàn)樵诖吮壤?，GOD催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫的速率與CAT分解過氧化氫的速率達(dá)到較好的匹配，使得反應(yīng)體系中過氧化氫濃度維持在合適水平，既避免了過氧化氫積累對(duì)酶活性的抑制，又保證了葡萄糖氧化反應(yīng)的順利進(jìn)行。3.3.2葡萄糖濃度的影響隨著葡萄糖濃度增加，底物轉(zhuǎn)化率先上升后趨于平緩。當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)，底物濃度是反應(yīng)速率的限制因素，增加葡萄糖濃度，反應(yīng)速率加快，底物轉(zhuǎn)化率提高；但當(dāng)葡萄糖濃度過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生底物抑制作用，同時(shí)反應(yīng)體系的滲透壓增大，影響酶的活性和穩(wěn)定性，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率不再明顯提高。確定最佳葡萄糖濃度為250g/L。3.3.3轉(zhuǎn)化溫度的影響溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率有雙重影響，一方面適當(dāng)升高溫度可加快反應(yīng)速率，另一方面溫度過高會(huì)使酶變性失活。在36℃時(shí)，葡萄糖酸鈉的底物轉(zhuǎn)化率最高。低于此溫度，酶活性較低，反應(yīng)速率慢；高于此溫度，酶分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性下降，底物轉(zhuǎn)化率降低。3.3.4pH的影響反應(yīng)體系的pH對(duì)酶活性和底物轉(zhuǎn)化率影響較大。在pH為6.8時(shí)，固定化酶表現(xiàn)出最佳的催化活性，底物轉(zhuǎn)化率最高。這是因?yàn)樵損H值接近GOD和CAT的最適pH范圍，能使酶分子活性中心的基團(tuán)處于最佳解離狀態(tài)，有利于酶與底物的結(jié)合及催化反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)pH偏離此值時(shí)，酶活性受到抑制，底物轉(zhuǎn)化率下降。3.3.5通氣量的影響通氣量為0.8vvm時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率較高。GOD催化葡萄糖氧化反應(yīng)需要氧氣參與，通氣量不足會(huì)導(dǎo)致氧氣供應(yīng)受限，影響反應(yīng)速率和底物轉(zhuǎn)化率；通氣量過大，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切力，對(duì)固定化酶結(jié)構(gòu)造成破壞，同樣不利于反應(yīng)進(jìn)行。3.3.6轉(zhuǎn)化時(shí)間的影響隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間延長，底物轉(zhuǎn)化率逐漸提高，在14h時(shí)底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%，之后繼續(xù)延長時(shí)間，底物轉(zhuǎn)化率提高不明顯。因此，確定最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間為14h。3.4固定化酶的重復(fù)使用性能對(duì)固定化酶進(jìn)行重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，重復(fù)使用12次以后，固定化GOD與CAT殘留酶活分別為70%和62%。這表明該共固定化酶具有較好的重復(fù)使用性能，在多次使用過程中，雖然酶活會(huì)逐漸下降，但仍能保持較高的催化活性，這對(duì)于降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。固定化酶重復(fù)使用過程中酶活下降的原因主要包括：酶分子從載體表面的脫落、反應(yīng)過程中酶分子的部分失活以及載體結(jié)構(gòu)的逐漸破壞等。四、結(jié)論本研究成功實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的共固定化，并優(yōu)化了葡萄糖酸鈉的制備工藝。通過對(duì)固定化條件的研究，確定了最佳的加酶量、pH及磷酸鈉緩沖液離子濃度，在此條件下，固定化GOD酶活回收率為35%，CAT酶活回收率為43%，且固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。在葡萄糖酸鈉制備工藝方面，通過單因素及正交試驗(yàn)，得到了最佳工藝條件，即固定化GOD和固定化CAT質(zhì)量比（濕重）為1∶3、葡萄糖濃度250g/L、轉(zhuǎn)化溫度3