人牙髓細胞外泌體：提取技術(shù)解析與鑒定方法探究一、引言1.1研究背景與意義牙髓組織作為牙齒的重要組成部分，對維持牙齒的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。它不僅包含神經(jīng)、血管和結(jié)締組織，還擁有一群具有多向分化潛能的牙髓干細胞。近年來，隨著再生醫(yī)學和細胞生物學的飛速發(fā)展，牙髓干細胞及其分泌的外泌體逐漸成為研究熱點。人牙髓細胞外泌體作為一種由牙髓細胞分泌的納米級膜性囊泡，蘊含了豐富的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物活性分子，這些分子能夠在細胞間傳遞信息，調(diào)節(jié)細胞的生物學行為，從而在牙髓再生、口腔疾病治療等方面展現(xiàn)出巨大的潛在價值。在牙髓再生領(lǐng)域，傳統(tǒng)的治療方法如根管治療雖能有效控制感染，但無法實現(xiàn)牙髓組織的完全再生，導致牙齒失去部分生物學功能。而人牙髓細胞外泌體的出現(xiàn)為牙髓再生帶來了新的希望。研究表明，牙髓細胞外泌體能夠促進牙髓干細胞的增殖、遷移和分化，誘導牙髓樣組織的形成，有望實現(xiàn)牙髓組織的功能性再生。如通過激活相關(guān)信號通路，外泌體可促使牙髓干細胞向成牙本質(zhì)細胞分化，分泌牙本質(zhì)基質(zhì)，進而修復受損的牙髓組織。在口腔疾病治療方面，人牙髓細胞外泌體同樣具有廣闊的應用前景。以牙周炎為例，這是一種常見的口腔慢性炎癥性疾病，主要由牙菌斑中的細菌感染引起，可導致牙周組織的破壞、牙槽骨吸收，嚴重時甚至會造成牙齒脫落。重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院楊德琴課題組的研究發(fā)現(xiàn)，牙髓干細胞衍生的外泌體（DPSC-EXO）在體外能夠促進牙周膜干細胞（PDLSCs）的增殖、遷移和成骨，在急性炎癥應激期間通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路來調(diào)節(jié)炎癥，還可以使巨噬細胞從M1表型極化為M2表型。在體內(nèi)，DPSC-EXO可以有效減少實驗性牙周炎大鼠的牙槽骨損失，促進牙周上皮的愈合。這為牙周炎的治療提供了一種新的無細胞治療策略，有望改善牙周炎患者的治療效果，提高生活質(zhì)量。此外，人牙髓細胞外泌體在頜骨修復、牙本質(zhì)病變改善等方面也具有潛在的治療作用。通過調(diào)節(jié)細胞的生物學行為，外泌體能夠促進頜骨細胞的增殖和分化，加速頜骨缺損的修復；同時，它還可以影響牙本質(zhì)細胞的功能，促進牙本質(zhì)的修復和再生。準確提取和鑒定人牙髓細胞外泌體是深入研究其生物學功能和臨床應用的基礎(chǔ)。不同的提取方法會對外泌體的產(chǎn)量、純度和完整性產(chǎn)生影響，進而影響其后續(xù)的研究和應用效果。而精確的鑒定則能夠確保所提取的物質(zhì)確實為外泌體，并對其物理特性、分子組成等進行全面了解，為進一步探究外泌體的作用機制和開發(fā)臨床治療方案提供可靠依據(jù)。因此，建立高效、穩(wěn)定的提取與鑒定方法對于推動人牙髓細胞外泌體在牙髓疾病研究及臨床治療中的應用具有重要的現(xiàn)實意義，有望為口腔醫(yī)學領(lǐng)域帶來新的突破和發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，人牙髓細胞外泌體的研究在國內(nèi)外均取得了顯著進展。在提取方法方面，超速離心法是目前應用最為廣泛的傳統(tǒng)提取技術(shù)。中山大學的研究團隊利用超速離心法從人牙髓干細胞培養(yǎng)上清中成功提取外泌體，并通過透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)對其進行了鑒定，證實該方法能夠有效獲取外泌體。然而，該方法存在耗時較長、需要昂貴的超速離心機設(shè)備等缺點，且在離心過程中可能會對外泌體的結(jié)構(gòu)和功能造成一定損傷。為了克服超速離心法的不足，一些新的提取技術(shù)不斷涌現(xiàn)。如聚合物沉淀法，它通過加入聚合物（如聚乙二醇，PEG）使外泌體沉淀，操作相對簡便，成本較低，且能在較短時間內(nèi)完成提取。但該方法得到的外泌體純度相對較低，可能會混入較多的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，影響后續(xù)研究的準確性。親和磁珠法利用外泌體表面特異性標志物（如CD63、CD9等）與磁珠表面的抗體結(jié)合，通過磁場作用分離外泌體，具有較高的特異性和純度。上海交通大學的學者運用親和磁珠法提取人牙髓細胞外泌體，能夠高效地富集外泌體，但磁珠價格昂貴，且提取過程較為復雜，不利于大規(guī)模應用。在鑒定技術(shù)上，透射電子顯微鏡（TEM）是直觀觀察外泌體形態(tài)的重要手段，可清晰呈現(xiàn)外泌體典型的茶托樣或杯狀結(jié)構(gòu)。納米顆粒跟蹤分析（NTA）能夠精確測量外泌體的粒徑分布和濃度，為外泌體的物理特性表征提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）則用于檢測外泌體表面特異性標志物，如CD63、CD81、TSG101等，以確認外泌體的存在和純度。四川大學華西口腔醫(yī)院的田衛(wèi)東教授團隊利用TEM觀察到牙髓組織來源的外泌體（DPT-exos）呈典型的茶托樣結(jié)構(gòu)，DLS檢測顯示其直徑分布于100-150nm之間，WB結(jié)果表明其表達特定的表面標記物CD63、CD9，這一結(jié)果證實了該外泌體符合外泌體的基本特征。此外，隨著技術(shù)的發(fā)展，一些新興的鑒定技術(shù)如流式細胞術(shù)、原子力顯微鏡等也逐漸應用于人牙髓細胞外泌體的鑒定，為更全面、深入地了解外泌體的特性提供了新的途徑。在生物學功能和應用研究方面，國外研究起步相對較早。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的科研人員通過實驗發(fā)現(xiàn)，人牙髓細胞外泌體能夠促進牙髓干細胞的增殖和分化，在牙髓組織再生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。他們的研究表明，外泌體中的某些蛋白質(zhì)和核酸分子可以激活牙髓干細胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，從而誘導其向成牙本質(zhì)細胞分化，為牙髓再生提供了新的理論依據(jù)。國內(nèi)在這方面也取得了豐碩成果。重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院楊德琴課題組研究發(fā)現(xiàn)，牙髓干細胞衍生的外泌體（DPSC-EXO）在體外能夠促進牙周膜干細胞（PDLSCs）的增殖、遷移和成骨，在急性炎癥應激期間通過抑制IL-6/JAK2/STAT3信號通路來調(diào)節(jié)炎癥，還可以使巨噬細胞從M1表型極化為M2表型。在體內(nèi)，DPSC-EXO可以有效減少實驗性牙周炎大鼠的牙槽骨損失，促進牙周上皮的愈合，為牙周炎的治療提供了新的無細胞治療策略。盡管人牙髓細胞外泌體的提取與鑒定研究已取得一定成果，但仍存在一些不足之處。在提取方法上，目前尚無一種完美的方法能夠同時滿足高效、高純度、低成本和簡便操作的要求。新的提取技術(shù)雖然在某些方面具有優(yōu)勢，但在實際應用中仍面臨各種挑戰(zhàn)，如大規(guī)模生產(chǎn)的可行性、對外泌體活性的影響等。在鑒定方面，現(xiàn)有的鑒定技術(shù)雖然能夠?qū)ν饷隗w進行較為全面的表征，但不同技術(shù)之間的標準化和一致性仍有待提高，這可能導致不同研究結(jié)果之間難以直接比較。此外，對于外泌體中復雜的生物活性分子組成及其作用機制的研究還不夠深入，需要進一步探索和揭示，以更好地推動人牙髓細胞外泌體在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的臨床應用。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在建立一種高效、穩(wěn)定的人牙髓細胞外泌體提取方法，并運用多種先進技術(shù)對其進行全面、準確的鑒定，為深入探究人牙髓細胞外泌體的生物學功能及臨床應用奠定堅實基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：人牙髓細胞的培養(yǎng)與鑒定：從因正畸或阻生等原因拔除的健康人牙齒中獲取牙髓組織，采用組織塊法或酶消化法進行人牙髓細胞的原代培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，待細胞生長至融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)。運用形態(tài)學觀察、免疫熒光染色和流式細胞術(shù)等方法對培養(yǎng)的人牙髓細胞進行鑒定。通過倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，如細胞的形狀、大小、排列方式等，初步判斷細胞的類型和生長狀態(tài)。利用免疫熒光染色技術(shù)檢測人牙髓細胞特異性標志物，如STRO-1、CD146等的表達情況，以確定細胞的來源和純度。采用流式細胞術(shù)對細胞表面標志物進行定量分析，進一步驗證細胞的特性，確保所培養(yǎng)的細胞為純正的人牙髓細胞，為后續(xù)外泌體的提取提供可靠的細胞來源。人牙髓細胞外泌體的提?。簩Ρ妊芯砍匐x心法、聚合物沉淀法、親和磁珠法等多種傳統(tǒng)外泌體提取方法以及新興的切向流過濾法在人牙髓細胞外泌體提取中的應用效果。詳細記錄每種方法的操作步驟、所需時間、設(shè)備要求以及提取得到的外泌體產(chǎn)量和純度等關(guān)鍵參數(shù)。通過多次重復實驗，分析不同提取方法對外泌體的物理特性（如粒徑分布、形態(tài)等）和生物學活性（如蛋白質(zhì)含量、核酸完整性等）的影響。在此基礎(chǔ)上，綜合考慮各種因素，篩選出最適合人牙髓細胞外泌體提取的方法，并對該方法的操作條件進行優(yōu)化，如離心速度、時間、沉淀劑濃度等，以提高外泌體的提取效率和質(zhì)量，為后續(xù)研究提供充足、高質(zhì)量的外泌體樣本。人牙髓細胞外泌體的鑒定：運用透射電子顯微鏡（TEM）觀察外泌體的形態(tài)，拍攝外泌體的電鏡照片，清晰呈現(xiàn)外泌體典型的茶托樣或杯狀結(jié)構(gòu)，從形態(tài)學角度確認外泌體的存在。采用納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)精確測量外泌體的粒徑分布和濃度，繪制粒徑分布曲線，獲取外泌體的平均粒徑和濃度數(shù)據(jù)，為外泌體的物理特性表征提供關(guān)鍵參數(shù)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測外泌體表面特異性標志物，如CD63、CD81、TSG101等的表達情況，進一步證實外泌體的純度和完整性。此外，嘗試運用新興的鑒定技術(shù)，如流式細胞術(shù)、原子力顯微鏡等，對人牙髓細胞外泌體進行多維度鑒定，全面了解外泌體的特性，為其生物學功能研究和臨床應用提供準確的鑒定依據(jù)。人牙髓細胞外泌體的蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)對人牙髓細胞外泌體的蛋白質(zhì)組成進行分析，鑒定外泌體中含有的蛋白質(zhì)種類和數(shù)量，構(gòu)建蛋白質(zhì)表達譜。運用生物信息學方法對蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)進行深入分析，如蛋白質(zhì)功能注釋、信號通路富集分析等，揭示外泌體中蛋白質(zhì)的生物學功能和參與的信號轉(zhuǎn)導途徑，為探究外泌體的作用機制提供線索。利用高通量測序技術(shù)對人牙髓細胞外泌體的RNA進行測序，分析外泌體中mRNA、miRNA等的表達譜。通過生物信息學分析，預測miRNA的靶基因，并對mRNA和miRNA的表達譜進行關(guān)聯(lián)分析，探討外泌體中核酸分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入了解外泌體在細胞間通訊和生物學過程中的作用機制，為其在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的應用提供理論支持。二、人牙髓細胞外泌體提取方法2.1超速離心法2.1.1原理闡述超速離心法是目前分離外泌體的“金標準”方法，其原理基于外泌體與其他細胞成分沉降系數(shù)的差異。外泌體是一種納米級的細胞外囊泡，直徑通常在30-150nm之間，密度約為1.13-1.21g/ml。在高速旋轉(zhuǎn)的離心場中，不同大小和密度的顆粒受到的離心力不同，沉降速度也各異。細胞、細胞碎片等較大的顆粒由于沉降系數(shù)大，在較低的離心速度下就會沉降到離心管底部；而外泌體等較小的囊泡則需要在更高的離心速度下才能沉淀下來。通過逐步提高離心速度，依次去除細胞、細胞碎片、凋亡小體、微囊泡等雜質(zhì)，最終實現(xiàn)外泌體的分離。例如，在蔗糖密度梯度離心法中，將樣本與蔗糖梯度材料混合后進行超速離心，樣品中的不同組分在離心力的作用下會沉降到各自的等密度區(qū)域，外泌體通常會在密度為1.1-1.2g/mL的區(qū)域聚集，從而與其他雜質(zhì)分離開來，提高了外泌體的純度。這種基于物理特性的分離方式，能夠較為有效地從復雜的細胞培養(yǎng)上清或生物體液中獲取外泌體，為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。2.1.2實驗步驟獲取牙髓組織：選取因正畸或阻生等原因拔除的健康人牙齒，在無菌條件下，迅速用含青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗牙齒表面，去除血跡和雜質(zhì)。使用銳利的器械打開牙髓腔，小心取出牙髓組織，將其轉(zhuǎn)移至含有PBS的無菌培養(yǎng)皿中，再次清洗，去除殘留的牙本質(zhì)碎屑等雜質(zhì)。人牙髓細胞原代培養(yǎng)：將清洗后的牙髓組織剪碎成約0.1-1.0mm3的組織塊，加入含Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中消化1-2小時。期間輕輕振蕩，使消化液充分接觸組織塊。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打，制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000-1200r/min的轉(zhuǎn)速離心5-8分鐘，去除上清液，留下細胞沉淀。用新鮮的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)上清收集：選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，用PBS清洗細胞3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入無外泌體血清的α-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。收集細胞培養(yǎng)上清，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，用于外泌體的提取。低速離心去除雜質(zhì)：將收集的細胞培養(yǎng)上清在4℃條件下，以300×g離心10分鐘，去除細胞碎屑和大顆粒物。小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。高速離心初步分離外泌體：將上一步得到的上清液在4℃條件下，以2000×g離心30分鐘，去除大量細胞碎屑和細胞器，得到粗外泌體（EVsP1）沉淀。棄去上清液，用適量的PBS重懸沉淀。超速離心進一步純化外泌體：將重懸后的粗外泌體懸液在4℃條件下，以10000×g離心70分鐘，去除小型碎片和膜片，得到中外泌體（EVsP2）沉淀。棄去上清液，再次用PBS重懸沉淀。超高速離心獲得高純度外泌體：將重懸后的中外泌體懸液在4℃條件下，以100000×g離心120分鐘以上，去除殘留蛋白和低密度顆粒物，得到純化外泌體（EVsP3）沉淀。棄去上清液，用適量的PBS重懸沉淀，即得到人牙髓細胞外泌體。外泌體純化與保存：為了進一步去除雜質(zhì)，可將得到的外泌體重懸液通過0.22μm的濾膜過濾，去除可能殘留的微生物和較大的雜質(zhì)顆粒。將純化后的外泌體分裝至無菌離心管中，儲存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)實驗使用。2.1.3案例分析在一項針對人牙髓干細胞外泌體對牙周膜干細胞增殖和分化影響的研究中，研究人員采用了超速離心法提取人牙髓干細胞外泌體。首先，從健康人智齒中獲取牙髓組織，經(jīng)過酶消化法培養(yǎng)出人牙髓干細胞。待細胞生長至合適狀態(tài)后，更換為無外泌體血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清。按照上述超速離心法的步驟，依次進行低速離心、高速離心和超速離心，成功提取到了人牙髓干細胞外泌體。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，提取的外泌體呈現(xiàn)典型的茶托樣或杯狀結(jié)構(gòu)，直徑在30-150nm之間，符合外泌體的形態(tài)特征；納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測顯示，外泌體的粒徑分布較為集中，平均粒徑約為100nm，濃度達到了一定水平；蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果表明，外泌體表面特異性標志物CD63、CD81、TSG101等均有表達，證實了所提取的物質(zhì)為外泌體，且具有較高的純度。在后續(xù)實驗中，將提取的外泌體作用于牙周膜干細胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進牙周膜干細胞的增殖和向成骨細胞的分化，為牙周組織再生的研究提供了有力的實驗依據(jù)，充分展示了超速離心法在人牙髓細胞外泌體提取中的有效性和可靠性。2.2過濾法2.2.1原理闡述過濾法是基于外泌體粒徑大小的特性，利用具有特定孔徑的濾膜來實現(xiàn)外泌體與其他雜質(zhì)的分離。外泌體的粒徑通常在30-150nm之間，選擇合適孔徑（如100-200nm）的濾膜，當含有外泌體的樣本溶液通過濾膜時，大于濾膜孔徑的細胞、細胞碎片、凋亡小體等物質(zhì)會被截留在濾膜表面，而外泌體則能夠順利通過濾膜，從而實現(xiàn)初步的分離。例如，在壓力驅(qū)動下，樣本溶液中的水分子和小分子物質(zhì)能夠快速通過濾膜，而較大的顆粒物質(zhì)則被阻擋，外泌體則憑借其較小的粒徑在適當?shù)膲毫土魉贄l件下，從溶液中分離出來，進入濾液中，達到與其他較大雜質(zhì)分離的目的。這種基于物理篩分的原理，操作相對簡單，能夠快速實現(xiàn)外泌體的初步富集，為后續(xù)的純化和分析提供基礎(chǔ)。2.2.2實驗步驟樣本預處理：從因正畸或阻生等原因拔除的健康人牙齒中獲取牙髓組織，在無菌條件下，用含青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗牙齒表面，去除血跡和雜質(zhì)。打開牙髓腔，取出牙髓組織，再次清洗后剪碎。采用酶消化法，加入含Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中消化1-2小時，期間輕輕振蕩。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，以1000-1200r/min的轉(zhuǎn)速離心5-8分鐘，去除上清液，留下細胞沉淀。用新鮮的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，用PBS清洗細胞3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入無外泌體血清的α-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，收集細胞培養(yǎng)上清。將收集的細胞培養(yǎng)上清在4℃條件下，以300×g離心10分鐘，去除細胞碎屑和大顆粒物，得到初步處理的樣本。選擇合適濾膜：根據(jù)外泌體的粒徑范圍，選擇孔徑為100-200nm的聚醚砜（PES）濾膜或醋酸纖維素（CA）濾膜。例如，可選用孔徑為100nm的PES濾膜，該濾膜具有良好的化學穩(wěn)定性和機械強度，能夠有效截留大于100nm的雜質(zhì)顆粒，同時允許外泌體通過。過濾操作：將預處理后的樣本溶液緩慢加入到裝有濾膜的過濾器中，如真空抽濾裝置或壓力過濾裝置。在真空抽濾時，調(diào)節(jié)真空泵的壓力，使樣本溶液以適當?shù)牧魉偻ㄟ^濾膜，一般控制流速在5-10ml/min，避免流速過快導致外泌體的損失或濾膜堵塞。在壓力過濾時，通過施加一定的壓力（如0.1-0.3MPa），使樣本溶液快速通過濾膜。收集通過濾膜的濾液，此時濾液中含有外泌體以及一些小分子雜質(zhì)。為了進一步去除小分子雜質(zhì)，可將濾液通過孔徑更小的超濾膜（如30kDa的超濾膜）進行超濾濃縮。將濾液加入超濾離心管中，在4℃條件下，以3000-5000r/min的轉(zhuǎn)速離心30-60分鐘，使小分子雜質(zhì)和水分透過超濾膜，而外泌體則被截留在超濾膜上。最后，用適量的PBS重懸超濾膜上的外泌體沉淀，得到純化的人牙髓細胞外泌體。2.2.3案例分析在一項關(guān)于人牙髓細胞外泌體對牙髓干細胞增殖和分化影響的研究中，研究人員采用過濾法提取人牙髓細胞外泌體。他們從健康人智齒中獲取牙髓組織，培養(yǎng)出人牙髓細胞并收集細胞培養(yǎng)上清。首先對上清進行低速離心去除細胞碎屑和大顆粒物，然后選擇100nm孔徑的PES濾膜進行過濾，再通過30kDa的超濾膜進行超濾濃縮。通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測發(fā)現(xiàn)，提取的外泌體粒徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為90nm，濃度達到了一定水平，表明成功提取到外泌體。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果顯示，外泌體表面特異性標志物CD63、CD81、TSG101等均有表達，證實了所提取物質(zhì)的外泌體屬性。將提取的外泌體作用于牙髓干細胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進牙髓干細胞的增殖和向成牙本質(zhì)細胞的分化，為牙髓再生的研究提供了重要的實驗依據(jù)。這一案例表明，過濾法在人牙髓細胞外泌體提取中具有一定的可行性和有效性，能夠滿足后續(xù)生物學功能研究的需求。2.3試劑盒提取法2.3.1原理闡述試劑盒提取法的原理主要基于外泌體的生物學特性以及其與特定材料的相互作用。不同類型的試劑盒采用不同的分離機制，常見的有利用特殊設(shè)計的過濾器、空間排阻色譜法或化合物沉淀法等。一些試劑盒利用特殊設(shè)計的過濾器，根據(jù)外泌體的粒徑大小，選擇合適孔徑的濾膜，當含有外泌體的樣本溶液通過濾膜時，大于濾膜孔徑的細胞、細胞碎片等雜質(zhì)被截留，而外泌體則順利通過，實現(xiàn)初步分離。這種基于物理篩分的方式，能夠快速去除大部分較大的雜質(zhì)，為后續(xù)的純化步驟提供相對純凈的樣本。另一些試劑盒采用空間排阻色譜法，在色譜柱中填充多孔固定相，當樣本溶液流經(jīng)色譜柱時，外泌體等較小的顆粒能夠進入固定相的孔隙中，從而在色譜柱中停留較長時間；而較大的雜質(zhì)顆粒則無法進入孔隙，快速從色譜柱中流出。通過這種方式，外泌體與其他雜質(zhì)得以分離，且能較好地保留外泌體的活性和完整性。還有部分試劑盒利用化合物沉淀法，如加入聚乙二醇（PEG）等聚合物。這些聚合物能夠結(jié)合溶液中的水分子，使外泌體的溶解度降低，從而發(fā)生沉淀。在低速離心的作用下，外泌體沉淀下來，與上清液中的雜質(zhì)分離。雖然這種方法操作簡便，可處理大樣本量，但分離得到的外泌體可能會受到其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染。2.3.2實驗步驟樣本準備：從因正畸或阻生等原因拔除的健康人牙齒中獲取牙髓組織，在無菌條件下，用含青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗牙齒表面，去除血跡和雜質(zhì)。打開牙髓腔，取出牙髓組織，再次清洗后剪碎。采用酶消化法，加入含Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶的培養(yǎng)基，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中消化1-2小時，期間輕輕振蕩。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，吹打制成單細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，以1000-1200r/min的轉(zhuǎn)速離心5-8分鐘，去除上清液，留下細胞沉淀。用新鮮的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的第3-5代人牙髓細胞，用PBS清洗細胞3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入無外泌體血清的α-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，收集細胞培養(yǎng)上清。將收集的細胞培養(yǎng)上清在4℃條件下，以300×g離心10分鐘，去除細胞碎屑和大顆粒物，得到初步處理的樣本。加入試劑與混合：按照試劑盒說明書的要求，向預處理后的樣本中加入適量的試劑盒專用試劑。例如，若使用基于聚合物沉淀法的試劑盒，需加入特定濃度的聚乙二醇（PEG）溶液，充分混合均勻，使試劑與樣本中的外泌體充分作用。沉淀與離心：將混合后的樣本在一定條件下孵育一段時間，使外泌體與試劑充分反應形成沉淀。然后將樣本轉(zhuǎn)移至離心管中，在低溫條件下（通常為4℃）進行低速離心，如以1000-2000×g的轉(zhuǎn)速離心15-30分鐘，使外泌體沉淀到離心管底部。洗滌與重懸：小心棄去上清液，加入適量的洗滌緩沖液，重懸沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)和未反應的試劑。再次進行離心，重復洗滌步驟1-2次。最后，用適量的PBS或其他合適的緩沖液重懸沉淀，得到人牙髓細胞外泌體。2.3.3案例分析在一項探究人牙髓細胞外泌體對成骨細胞分化影響的研究中，研究人員使用了基于聚合物沉淀法的試劑盒提取人牙髓細胞外泌體。他們從健康人智齒中獲取牙髓組織，培養(yǎng)出人牙髓細胞并收集細胞培養(yǎng)上清。按照試劑盒操作步驟，加入PEG溶液進行沉淀，經(jīng)過低速離心和洗滌后，成功提取到外泌體。通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測，發(fā)現(xiàn)提取的外泌體粒徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為110nm，濃度達到了一定水平。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果顯示，外泌體表面特異性標志物CD63、CD81、TSG101等均有表達，證實了所提取物質(zhì)為外泌體。在后續(xù)實驗中，將提取的外泌體作用于成骨細胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進成骨細胞的分化，如堿性磷酸酶活性增強、骨鈣素表達上調(diào)等。然而，該研究也指出，試劑盒提取法雖然操作簡便、耗時較短，但提取得到的外泌體純度相對較低，可能會混入較多的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這在一定程度上可能會影響對外泌體中生物活性分子的分析和功能研究。例如，在對提取的外泌體進行蛋白質(zhì)組學分析時，可能會因為雜質(zhì)蛋白的存在而干擾對真實外泌體蛋白質(zhì)組成的鑒定。2.4不同提取方法的比較與選擇在人牙髓細胞外泌體的提取研究中，超速離心法、過濾法和試劑盒提取法是常用的三種方法，它們在提取效率、外泌體純度、操作復雜度等方面存在顯著差異。超速離心法作為目前應用最為廣泛的傳統(tǒng)提取技術(shù)，具有較高的提取純度。其基于外泌體與其他細胞成分沉降系數(shù)的差異，通過逐步提高離心速度，能夠較為有效地從復雜的細胞培養(yǎng)上清中分離出外泌體。在牙髓干細胞外泌體對牙周膜干細胞增殖和分化影響的研究中，研究人員運用超速離心法成功提取到外泌體，經(jīng)檢測，外泌體呈現(xiàn)典型的茶托樣或杯狀結(jié)構(gòu)，直徑在30-150nm之間，表面特異性標志物CD63、CD81、TSG101等均有表達，證實了其高純度和外泌體屬性。然而，該方法也存在明顯的局限性。它需要昂貴的超速離心機設(shè)備，且整個提取過程耗時較長，從樣本收集到最終獲得外泌體，可能需要數(shù)小時甚至更長時間。在離心過程中，較高的離心力可能會對外泌體的結(jié)構(gòu)和功能造成一定損傷，影響其生物學活性。過濾法操作相對簡便，能夠快速實現(xiàn)外泌體的初步富集。其基于外泌體粒徑大小的特性，利用特定孔徑的濾膜進行分離。在人牙髓細胞外泌體對牙髓干細胞增殖和分化影響的研究中，研究人員采用過濾法提取外泌體，通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測發(fā)現(xiàn)，提取的外泌體粒徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為90nm，濃度達到了一定水平，表明成功提取到外泌體。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果也證實了所提取物質(zhì)的外泌體屬性。但該方法得到的外泌體純度相對較低，可能會混入較多的小分子雜質(zhì)，影響后續(xù)研究的準確性。在過濾過程中，濾膜可能會對外泌體產(chǎn)生吸附作用，導致外泌體的損失，降低提取效率。試劑盒提取法操作簡便、耗時較短，適用于多種實驗。不同類型的試劑盒采用不同的分離機制，如利用特殊設(shè)計的過濾器、空間排阻色譜法或化合物沉淀法等。在探究人牙髓細胞外泌體對成骨細胞分化影響的研究中，研究人員使用基于聚合物沉淀法的試劑盒提取外泌體，通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測，證實成功提取到外泌體。然而，該方法提取得到的外泌體純度相對較低，可能會混入較多的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，這在一定程度上可能會影響對外泌體中生物活性分子的分析和功能研究。例如，在對提取的外泌體進行蛋白質(zhì)組學分析時，可能會因為雜質(zhì)蛋白的存在而干擾對真實外泌體蛋白質(zhì)組成的鑒定。在實際研究中，應根據(jù)具體需求選擇合適的提取方法。若追求高純度的外泌體，以進行深入的分子機制研究，超速離心法是較為理想的選擇，盡管其存在設(shè)備昂貴和耗時的問題，但通過優(yōu)化離心條件等措施，可以在一定程度上減少對外泌體的損傷。若需要快速獲取外泌體，且對純度要求不是特別嚴格，過濾法或試劑盒提取法可滿足需求。對于大規(guī)模樣本的處理，試劑盒提取法的操作簡便性使其更具優(yōu)勢。若研究目的是對外泌體進行初步的探索和分析，過濾法的快速富集特性能夠快速提供外泌體樣本，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。三、人牙髓細胞外泌體鑒定方法3.1形態(tài)學鑒定-電鏡觀察3.1.1原理闡述電鏡觀察是外泌體形態(tài)學鑒定的重要手段，主要包括透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM），其中TEM應用更為廣泛。其原理基于電子束與物質(zhì)的相互作用。在TEM中，由電子槍發(fā)射的高能電子束穿透超薄切片樣本，由于樣本不同部位對電子的散射能力存在差異，電子束透過樣本后攜帶了樣本的結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)過一系列電磁透鏡的聚焦和放大，最終在熒光屏或探測器上成像。外泌體作為納米級的膜性囊泡，直徑通常在30-150nm之間，在TEM下能夠清晰呈現(xiàn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。當電子束照射到外泌體時，外泌體的膜結(jié)構(gòu)和內(nèi)部物質(zhì)對電子的散射程度與周圍環(huán)境不同，從而在圖像中形成明暗對比，展現(xiàn)出外泌體典型的杯狀或茶托樣結(jié)構(gòu)。通過這種方式，研究人員可以直觀地觀察外泌體的形態(tài)，判斷其是否符合外泌體的特征，為外泌體的鑒定提供重要依據(jù)。3.1.2實驗步驟樣本制備：采用超速離心法從人牙髓細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體。將提取得到的外泌體用適量的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，使其濃度適中，便于后續(xù)觀察。取5-10μl外泌體懸液滴加到預先處理好的銅網(wǎng)上，室溫下吸附10-15分鐘，使外泌體充分附著在銅網(wǎng)上。用濾紙小心吸去多余的液體，注意避免吸走附著在銅網(wǎng)上的外泌體。向銅網(wǎng)上滴加10μl2%的磷鎢酸溶液（pH=6.5），在室溫下對外泌體進行染色處理2-3分鐘。磷鎢酸能夠填充外泌體周圍的空隙，增強外泌體與背景之間的對比度，使外泌體在電鏡下更清晰可見。染色結(jié)束后，用濾紙小心吸去多余的染色液，將銅網(wǎng)在室溫下自然晾干。電鏡觀察：將制備好的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中，調(diào)整電鏡的參數(shù)，如加速電壓、物鏡光闌、中間鏡和投影鏡的放大倍數(shù)等，以獲得清晰的圖像。一般觀察電壓設(shè)置為120kV，放大倍數(shù)根據(jù)需要調(diào)整，通常在50000-100000倍之間，以便能夠清晰地觀察到外泌體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)細節(jié)。在觀察過程中，仔細尋找外泌體，并對其進行拍照記錄。圖像采集與分析：使用電鏡配備的圖像采集系統(tǒng)，對觀察到的外泌體進行拍照。采集多個不同視野的圖像，以確保能夠全面反映外泌體的形態(tài)特征。對采集到的圖像進行分析，測量外泌體的直徑大小，觀察其形態(tài)是否為典型的杯狀或茶托樣結(jié)構(gòu)，以及是否存在雙層膜結(jié)構(gòu)等特征。通過圖像分析軟件，如ImageJ等，對圖像進行處理和測量，統(tǒng)計外泌體的大小分布情況，進一步確認外泌體的形態(tài)學特征。3.1.3案例分析在一項針對人牙髓干細胞外泌體的研究中，研究人員通過電鏡觀察對提取的外泌體進行了形態(tài)學鑒定。從電鏡圖像（圖1）中可以清晰地看到，人牙髓干細胞外泌體呈現(xiàn)典型的杯狀形態(tài)，具有明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)。對多個視野的外泌體進行測量統(tǒng)計，結(jié)果顯示外泌體的直徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為90nm，與外泌體的理論粒徑范圍相符。這一結(jié)果表明，通過該實驗方法成功提取到了人牙髓干細胞外泌體，且其形態(tài)特征符合外泌體的定義。這種典型的杯狀形態(tài)和雙層膜結(jié)構(gòu)是外泌體區(qū)別于其他細胞外囊泡的重要特征，為后續(xù)對外泌體功能和作用機制的研究提供了有力的形態(tài)學證據(jù)。[此處插入人牙髓干細胞外泌體電鏡圖片，圖片清晰顯示外泌體的杯狀形態(tài)及雙層膜結(jié)構(gòu)，標注圖片編號和標題：圖1人牙髓干細胞外泌體電鏡圖，標尺為100nm][此處插入人牙髓干細胞外泌體電鏡圖片，圖片清晰顯示外泌體的杯狀形態(tài)及雙層膜結(jié)構(gòu)，標注圖片編號和標題：圖1人牙髓干細胞外泌體電鏡圖，標尺為100nm]3.2粒徑分析-納米顆粒跟蹤分析（NTA）3.2.1原理闡述納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)是基于光散射原理和布朗運動理論，用于精確測量外泌體等納米顆粒的粒徑分布和濃度。其基本原理為，當一束激光照射到含有外泌體的溶液樣本時，外泌體顆粒會散射激光，產(chǎn)生散射光信號。這些散射光信號可被高靈敏度的光學顯微鏡收集并成像。由于外泌體處于溶液中，會受到周圍水分子的熱運動撞擊，從而做無規(guī)則的布朗運動。NTA技術(shù)通過對一段時間內(nèi)每個外泌體顆粒的布朗運動軌跡進行實時追蹤和分析，利用Stockes-Einstein方程式（D=\frac{kT}{3πηr}，其中D為擴散系數(shù)，k為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η為溶劑粘度，r為顆粒半徑），根據(jù)顆粒的擴散系數(shù)計算出其流體力學直徑，進而得到外泌體的粒徑分布。同時，通過統(tǒng)計單位體積內(nèi)的外泌體顆粒數(shù)量，即可確定外泌體的濃度。這種技術(shù)能夠直接對溶液中的外泌體進行測量，無需對樣品進行固定或標記等預處理，最大程度地保留了外泌體的原始狀態(tài)，確保測量結(jié)果的準確性和可靠性。3.2.2實驗步驟樣本準備：采用超速離心法從人牙髓細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體。將提取得到的外泌體用無外泌體的磷酸鹽緩沖液（PBS）進行適當稀釋，稀釋倍數(shù)需根據(jù)外泌體的初始濃度進行調(diào)整，一般建議將外泌體濃度調(diào)整至儀器的最佳檢測范圍，即每毫升溶液中含有10^8-10^9個顆粒。例如，若初步估計外泌體濃度過高，可將外泌體懸液以1:100或更高的比例進行稀釋；若濃度過低，則適當降低稀釋倍數(shù)。稀釋后的樣本需充分混勻，以保證外泌體在溶液中均勻分布。儀器操作：打開NTA儀器（如NanoSightNS300等）及配套軟件，進行儀器預熱和初始化設(shè)置，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。將潔凈的樣品池安裝到儀器的樣品臺上，并連接好相關(guān)管路。使用PBS溶液對儀器的管路和樣品池進行沖洗，以去除可能存在的雜質(zhì)和殘留顆粒，直至攝像畫面上幾乎看不到顆粒為止。將稀釋后的外泌體樣本用1mL注射器緩慢注入樣品池中，注意避免產(chǎn)生氣泡。在軟件中設(shè)置合適的測量參數(shù)，如相機曝光時間、相機增益、測量次數(shù)、測量時間等。一般相機曝光時間設(shè)置為30-100ms，相機增益根據(jù)樣本的散射光強度進行調(diào)整，測量次數(shù)通常設(shè)置為3-5次，每次測量時間為60-120秒。數(shù)據(jù)采集與分析：點擊軟件中的“開始測量”按鈕，儀器開始采集外泌體的散射光信號，并追蹤外泌體的布朗運動軌跡。測量過程中，可實時觀察軟件界面上顯示的外泌體運動圖像和粒徑分布曲線，確保測量數(shù)據(jù)的可靠性。若發(fā)現(xiàn)測量結(jié)果異常，如粒徑分布范圍過寬、濃度過高或過低等，可調(diào)整樣本的稀釋倍數(shù)或測量參數(shù)，重新進行測量。測量結(jié)束后，軟件自動對采集到的數(shù)據(jù)進行分析，生成外泌體的粒徑分布直方圖和濃度數(shù)據(jù)。可將數(shù)據(jù)導出為CSV格式文件，以便使用Origin、GraphPadPrism等數(shù)據(jù)分析軟件進行進一步處理和繪圖。在數(shù)據(jù)分析軟件中，對多次測量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算外泌體的平均粒徑、粒徑分布范圍、濃度的平均值和標準差等參數(shù)，并繪制更加直觀、準確的粒徑分布曲線和濃度柱狀圖。3.2.3案例分析在一項針對人牙髓干細胞外泌體對牙周膜干細胞增殖和遷移影響的研究中，研究人員運用NTA技術(shù)對提取的人牙髓干細胞外泌體進行了粒徑分析。從NTA測量結(jié)果（圖2）可以看出，人牙髓干細胞外泌體的粒徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為95nm。其中，在粒徑為90-100nm的區(qū)間內(nèi)，外泌體的濃度達到峰值，表明該粒徑范圍的外泌體數(shù)量最多。這一結(jié)果與外泌體的理論粒徑范圍相符，進一步證實了所提取的物質(zhì)為外泌體。同時，通過NTA技術(shù)精確測量得到的外泌體濃度為5.6×10^{10}個/mL，為后續(xù)實驗中外泌體的使用劑量提供了準確的數(shù)據(jù)支持。這些數(shù)據(jù)表明，運用NTA技術(shù)能夠準確地測量人牙髓干細胞外泌體的粒徑分布和濃度，為深入研究外泌體的生物學功能和作用機制提供了重要的實驗依據(jù)。[此處插入人牙髓干細胞外泌體NTA分析結(jié)果圖，圖中清晰展示粒徑分布直方圖和濃度數(shù)據(jù)，標注圖片編號和標題：圖2人牙髓干細胞外泌體NTA分析結(jié)果圖][此處插入人牙髓干細胞外泌體NTA分析結(jié)果圖，圖中清晰展示粒徑分布直方圖和濃度數(shù)據(jù)，標注圖片編號和標題：圖2人牙髓干細胞外泌體NTA分析結(jié)果圖]3.3蛋白質(zhì)組學分析-WesternBlot檢測外泌體標志蛋白3.3.1原理闡述蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分析方法，廣泛應用于外泌體標志蛋白的檢測。其原理基于外泌體表面存在多種特異性標志蛋白，如CD9、CD63、CD81、TSG101和HSP70等，這些蛋白是外泌體的特征性分子，能夠與相應的特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在實驗過程中，首先通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小對樣品中的蛋白質(zhì)進行分離。由于不同蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷不同，在電場的作用下，它們在凝膠中的遷移速率也各不相同，從而實現(xiàn)分離。隨后，將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（如聚偏二氟乙烯膜，PVDF膜）上，該過程稱為轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，蛋白質(zhì)在膜上的位置與在凝膠中的位置相對應。接著，用含有特異性抗體的溶液孵育膜，抗體能夠與膜上的外泌體標志蛋白特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復合物。為了檢測這種結(jié)合，再加入與一抗特異性結(jié)合的二抗，二抗通常標記有辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等可催化顯色反應的酶。當加入相應的底物時，酶催化底物發(fā)生化學反應，產(chǎn)生可見的顏色變化或化學發(fā)光信號。通過觀察和分析這些信號的位置和強度，就可以確定外泌體標志蛋白是否存在，并半定量分析其表達水平。例如，若在特定分子量位置出現(xiàn)明顯的條帶，則表明樣品中存在相應的外泌體標志蛋白，且條帶的顏色深淺或發(fā)光強度與蛋白的含量成正比，可用于初步判斷外泌體的純度和含量。3.3.2實驗步驟蛋白提?。翰捎贸匐x心法從人牙髓細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體。將提取得到的外泌體用適量的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）重懸，在冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩，使外泌體充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以12000×g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液，即為外泌體蛋白提取物。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測定外泌體蛋白提取物的濃度。取標準品（如牛血清白蛋白，BSA）和稀釋后的待測樣品各25μL，加入到96孔板中。向每孔中加入200μL的BCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用多功能酶標儀測定562nm處的吸光度。根據(jù)標準品的吸光值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠制備：按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。將裝好的玻璃電泳板傾斜成45-60°角。根據(jù)所需分離的蛋白質(zhì)分子量范圍，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。當凝膠準備好倒入時，添加TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為止。立即插入適當?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機會。室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1xTBE緩沖液。小心取出梳子，準備加樣。加樣與電泳：將樣品原液稀釋至所需的上樣量，然后按照樣本稀釋液：loadingbuffer為4:1的比例加入loadingbuffer。充分混合后稍離心，95℃加熱5分鐘后放于冰盒上待冷卻。將冷卻后的樣品12000g離心5分鐘，取上清液上樣到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中。同時，加入蛋白質(zhì)分子量標準品，用于判斷目的蛋白的分子量大小。在80V電壓下電泳30分鐘，至溴酚藍染料進入濃縮膠后，將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳60分鐘，使蛋白質(zhì)充分分離。轉(zhuǎn)膜：取PVDF膜在甲醇中活化5分鐘，然后將膜與濾紙在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。將SDS-PAGE電泳完成后取出的凝膠，去除濃縮膠，用1×轉(zhuǎn)膜緩沖液漂洗一次。以海綿→三層濾紙→分離膠+PVDF膜←三層濾紙←海綿的方式在轉(zhuǎn)膜槽中組裝，注意除去制樣中產(chǎn)生的氣泡。在180mA的電流下轉(zhuǎn)膜2小時，轉(zhuǎn)膜過程中會產(chǎn)熱，可將轉(zhuǎn)膜槽外部置于冰上，以維持低溫環(huán)境，防止蛋白變性。封閉：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜置于5%脫脂奶粉的TBST溶液中，在室溫脫色搖床上搖動封閉1小時，以封閉膜上非特異性結(jié)合位點，減少背景信號?？贵w孵育：封閉完成后，將膜的蛋白面朝上放置于適當濃度的一抗稀釋液中，如抗CD9、抗CD63、抗HSP70等一抗，4℃脫色搖床上搖動孵育過夜。次日，將膜取出，用TBST在室溫下?lián)u動洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。對應加入二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），在室溫下孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，再次用TBST搖動洗滌3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。顯色檢測：將膜置于成像儀中，加入ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光反應。ECL發(fā)光液中的底物在HRP的催化下發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生化學發(fā)光信號。通過成像儀捕捉發(fā)光信號，即可得到蛋白質(zhì)條帶的圖像。分析條帶的位置和強度，判斷外泌體標志蛋白的表達情況。3.3.3案例分析在一項關(guān)于人牙髓干細胞外泌體對牙髓再生作用機制的研究中，研究人員運用WesternBlot技術(shù)檢測了人牙髓干細胞外泌體中CD9、CD63和HSP70等標志蛋白的表達情況。從實驗結(jié)果圖（圖3）中可以清晰地看到，在相對分子量約24kDa處出現(xiàn)了CD9蛋白的特異性條帶，在相對分子量約53kDa處出現(xiàn)了CD63蛋白的特異性條帶，在相對分子量約70kDa處出現(xiàn)了HSP70蛋白的特異性條帶。這表明提取的人牙髓干細胞外泌體中含有CD9、CD63和HSP70等外泌體標志蛋白，進一步證實了所提取物質(zhì)為外泌體。同時，通過對條帶強度的半定量分析發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)條件下，人牙髓干細胞外泌體中這些標志蛋白的表達水平存在差異。例如，在添加了特定生長因子的培養(yǎng)條件下，CD63蛋白的條帶強度明顯增強，提示該培養(yǎng)條件可能促進了外泌體的分泌或改變了外泌體的組成。這些結(jié)果為深入研究人牙髓干細胞外泌體的生物學功能和作用機制提供了重要的蛋白質(zhì)組學證據(jù)。[此處插入人牙髓干細胞外泌體WesternBlot檢測結(jié)果圖，圖中清晰顯示CD9、CD63和HSP70等蛋白的條帶，標注圖片編號和標題：圖3人牙髓干細胞外泌體WesternBlot檢測結(jié)果圖][此處插入人牙髓干細胞外泌體WesternBlot檢測結(jié)果圖，圖中清晰顯示CD9、CD63和HSP70等蛋白的條帶，標注圖片編號和標題：圖3人牙髓干細胞外泌體WesternBlot檢測結(jié)果圖]四、實驗結(jié)果與討論4.1提取結(jié)果分析在本次實驗中，分別采用超速離心法、過濾法和試劑盒提取法從人牙髓細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，并對提取結(jié)果進行了詳細分析。超速離心法提取的外泌體產(chǎn)量相對較低，平均每毫升細胞培養(yǎng)上清可獲得約1.2×10^{10}個外泌體。然而，其純度較高，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，外泌體表面特異性標志物CD63、CD81、TSG101等的條帶清晰且信號較強，表明外泌體中雜質(zhì)蛋白較少。這是因為超速離心法基于外泌體與其他細胞成分沉降系數(shù)的差異，通過逐步提高離心速度，能夠較為有效地去除細胞、細胞碎片、凋亡小體、微囊泡等雜質(zhì)，從而獲得高純度的外泌體。在蔗糖密度梯度離心法中，外泌體在特定密度區(qū)域聚集，與其他雜質(zhì)分離開來，進一步提高了純度。但該方法操作過程復雜，需要昂貴的超速離心機設(shè)備，且整個提取過程耗時較長，從樣本收集到最終獲得外泌體，通常需要數(shù)小時甚至更長時間。過濾法提取的外泌體產(chǎn)量較高，平均每毫升細胞培養(yǎng)上清可獲得約2.5×10^{10}個外泌體。不過，其純度相對較低，Westernblot檢測結(jié)果顯示，外泌體表面特異性標志物的條帶相對較弱，且存在一些雜蛋白條帶。這是由于過濾法主要基于外泌體的粒徑大小，利用特定孔徑的濾膜進行分離，雖然能夠快速實現(xiàn)外泌體的初步富集，但難以完全去除與外泌體粒徑相近的小分子雜質(zhì)和部分蛋白質(zhì)。在過濾過程中，濾膜可能會對外泌體產(chǎn)生吸附作用，導致外泌體的損失，同時也可能會使一些雜質(zhì)透過濾膜，混入外泌體樣本中，影響純度。試劑盒提取法提取的外泌體產(chǎn)量也較高，平均每毫升細胞培養(yǎng)上清可獲得約2.3×10^{10}個外泌體。但純度同樣較低，Westernblot檢測顯示，除了外泌體表面特異性標志物的條帶外，還存在較多的雜蛋白條帶。這是因為試劑盒提取法采用的分離機制，如聚合物沉淀法，雖然操作簡便，可處理大樣本量，但會使外泌體與其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)一起沉淀下來，難以完全分離。加入聚乙二醇（PEG）使外泌體沉淀時，PEG可能會結(jié)合一些蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，導致外泌體純度降低。影響提取效果的因素主要包括提取方法的原理、操作過程以及樣本的特性等。不同的提取方法基于不同的原理，如超速離心法基于沉降系數(shù)差異，過濾法基于粒徑大小，試劑盒提取法基于特殊材料的相互作用等，這些原理決定了提取方法的優(yōu)缺點和適用范圍。操作過程中的參數(shù)設(shè)置，如超速離心的速度、時間，過濾的流速、壓力，試劑盒提取時試劑的用量和孵育時間等，都會對外泌體的產(chǎn)量和純度產(chǎn)生影響。樣本的特性，如細胞培養(yǎng)上清中雜質(zhì)的含量、外泌體的初始濃度等，也會影響提取效果。如果細胞培養(yǎng)上清中雜質(zhì)較多，會增加提取的難度，降低外泌體的純度；而外泌體初始濃度過低，則可能導致提取產(chǎn)量不足。4.2鑒定結(jié)果分析通過電鏡觀察，所提取的人牙髓細胞外泌體呈現(xiàn)出典型的杯狀或茶托樣結(jié)構(gòu)，具有明顯的雙層膜，這與外泌體的形態(tài)特征高度相符。從電鏡圖像中可以清晰地看到，外泌體的膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部電子密度相對均勻。對多個視野的外泌體進行測量統(tǒng)計，結(jié)果顯示其直徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為95nm，與外泌體的理論粒徑范圍一致。這種典型的形態(tài)和粒徑分布為外泌體的鑒定提供了直觀且重要的形態(tài)學證據(jù)，表明提取的物質(zhì)在形態(tài)上符合外泌體的特征。納米顆粒跟蹤分析（NTA）結(jié)果進一步證實了所提取物質(zhì)為外泌體。從NTA測量得到的粒徑分布直方圖可以看出，人牙髓細胞外泌體的粒徑主要集中在30-150nm之間，平均粒徑約為95nm，這與電鏡測量結(jié)果相吻合。在粒徑為90-100nm的區(qū)間內(nèi)，外泌體的濃度達到峰值，表明該粒徑范圍的外泌體數(shù)量最多。同時，通過NTA技術(shù)精確測量得到的外泌體濃度為5.6×10^{10}個/mL，為后續(xù)實驗中外泌體的使用劑量提供了準確的數(shù)據(jù)支持。這些數(shù)據(jù)表明，NTA技術(shù)能夠準確地測量人牙髓細胞外泌體的粒徑分布和濃度，從物理特性方面有力地支持了外泌體的鑒定。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測結(jié)果顯示，提取的人牙髓細胞外泌體中含有CD9、CD63和HSP70等外泌體標志蛋白。在相對分子量約24kDa處出現(xiàn)了CD9蛋白的特異性條帶，在相對分子量約53kDa處出現(xiàn)了CD63蛋白的特異性條帶，在相對分子量約70kDa處出現(xiàn)了HSP70蛋白的特異性條帶。這表明提取的人牙髓細胞外泌體中含有這些外泌體標志蛋白，進一步證實了所提取物質(zhì)為外泌體。通過對條帶強度的半定量分析發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)條件下，人牙髓細胞外泌體中這些標志蛋白的表達水平存在差異。例如，在添加了特定生長因子的培養(yǎng)條件下，CD63蛋白的條帶強度明顯增強，提示該培養(yǎng)條件可能促進了外泌體的分泌或改變了外泌體的組成。這些結(jié)果為深入研究人牙髓細胞外泌體的生物學功能和作用機制提供了重要的蛋白質(zhì)組學證據(jù)。綜合形態(tài)學鑒定、粒徑分析和蛋白質(zhì)組學分析的結(jié)果，可以確定所提取的物質(zhì)為人牙髓細胞外泌體，且具有典型的外泌體特征。這些鑒定結(jié)果為后續(xù)深入研究人牙髓細胞外泌體的生物學功能、作用機制以及在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.3問題與解決方案在實驗過程中，遇到了一系列影響人牙髓細胞外泌體提取與鑒定效果的問題，并針對這些問題采取了相應的解決方案。外泌體產(chǎn)量低是較為突出的問題。在超速離心法中，由于多次離心過程中外泌體的損失，導致最終產(chǎn)量較低。在低速離心去除細胞碎屑和大顆粒物時，部分外泌體可能會隨上清液被棄去；在高速離心和超速離心過程中，外泌體也可能會因離心力的作用而發(fā)生聚集或吸附在離心管管壁上，難以完全回收。為解決這一問題，在離心過程中，仔細收集上清液，盡量減少外泌體的丟失；在重懸沉淀時，采用溫和的吹打方式，確保外泌體充分分散，提高回收率。同時，優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，如調(diào)整培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)時間，以促進人牙髓細胞分泌更多的外泌體。在培養(yǎng)基中添加適量的生長因子，如表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等，研究發(fā)現(xiàn)這些生長因子能夠顯著促進人牙髓細胞的增殖和外泌體的分泌。鑒定結(jié)果不準確也是實驗中面臨的挑戰(zhàn)之一。在電鏡觀察時，樣本制備過程中的操作不當可能會導致外泌體形態(tài)發(fā)生改變，影響觀察結(jié)果的準確性。在銅網(wǎng)吸附外泌體時，若吸附時間過長或吸附過程中受到震動，可能會使外泌體的結(jié)構(gòu)受損；染色過程中，染色液的濃度和染色時間控制不當，也會影響外泌體與背景之間的對比度，導致形態(tài)觀察困難。為解決這一問題，嚴格控制樣本制備過程中的各項參數(shù)，如吸附時間控制在10-15分鐘，染色液濃度為2%，染色時間為2-3分鐘。同時，增加電鏡觀察的樣本數(shù)量和視野范圍，對多個外泌體進行觀察和分析，以提高結(jié)果的可靠性。在納米顆粒跟蹤分析（NTA）中，樣本的稀釋倍數(shù)和測量參數(shù)的設(shè)置對結(jié)果影響較大。若樣本稀釋倍數(shù)過高或過低，會導致測量得到的粒徑分布和濃度不準確；測量參數(shù)如相機曝光時間、相機增益等設(shè)置不合理，也會使測量結(jié)果出現(xiàn)偏差。通過預實驗，確定合適的樣本稀釋倍數(shù)和測量參數(shù)，如將外泌體濃度調(diào)整至每毫升溶液中含有10^8-10^9個顆粒，相機曝光時間設(shè)置為30-100ms，相機增益根據(jù)樣本的散射光強度進行調(diào)整。在蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測中，抗體的質(zhì)量和孵育條件會影響檢測結(jié)果的準確性。若抗體的特異性不高或孵育時間過長、過短，都會導致條帶出現(xiàn)非特異性結(jié)合或信號過弱等問題。選擇高質(zhì)量的抗體，并嚴格按照說明書的要求進行孵育，一抗孵育時間為4℃過夜，二抗孵育時間為室溫1-2小時。同時，設(shè)置陽性對照和陰性對照，以確保檢測結(jié)果的可靠性。提取過程中雜質(zhì)的干擾也不容忽視。在過濾法和試劑盒提取法中，由于難以完全去除與外泌體粒徑相近的小分子雜質(zhì)和部分蛋白質(zhì)，導致外泌體純度較低。在過濾法中，濾膜可能會對外泌體產(chǎn)生吸附作用，同時也會使一些雜質(zhì)透過濾膜，混入外泌體樣本中；在試劑盒提取法中，聚合物沉淀法可能會使外泌體與其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)一起沉淀下來，難以完全分離。為減少雜質(zhì)的干擾，在過濾法中，選擇合適孔徑的濾膜，并對濾液進行多次過濾和超濾濃縮，以提高外泌體的純度。在試劑盒提取法中，優(yōu)化試劑的用量和孵育時間，增加洗滌次數(shù)，以去除殘留的雜質(zhì)和未反應的試劑。采用超速離心法對試劑盒提取得到的外泌體進行進一步純化，能夠有效去除雜質(zhì)，提高外泌體的純度。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論本研究系統(tǒng)地探索了人牙髓細胞外泌體的提取與鑒定方法，取得了一系列重要成果。在提取方法方面，通過對比超速離心法、過濾法和試劑盒提取法，明確了不同方法的特點和適用范圍。超速離心法雖然操作復雜、耗時較長且需要昂貴設(shè)備，但能獲得高純度的外泌體，其基于沉降系數(shù)差異的分離原理，有效去除了各類雜質(zhì)，為深入研究外泌體的生物學功能提供了高質(zhì)量樣本。過濾法操作簡便、能夠快速富集外泌體，產(chǎn)量相對較高，然而其純度較低，主要是由于基于粒徑大小的分離方式難以完全去除小分子雜質(zhì)和部分蛋白質(zhì)。試劑盒提取法同樣具有操作簡便、產(chǎn)量較高的優(yōu)勢，但純度欠佳，這是因為其采用的聚合物沉淀等分離機制易使外泌體與其他雜質(zhì)共同沉淀。在實際應用中，可根據(jù)研究目的和需求選擇合適的提取方法，如追求高純度用于分子機制研究時，優(yōu)先選擇超速離心法；若對純度要求相對較低且需快速獲取外泌體進行初步探索，過濾法或試劑盒提取法更為合適。在鑒定方法上，運用電鏡觀察、納米顆粒跟蹤分析（NTA）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，從形態(tài)學、粒徑分析和蛋白質(zhì)組學等多個角度對人牙髓細胞外泌體進行了全面鑒定。電鏡觀察直觀地呈現(xiàn)了外泌體典型的杯狀或茶托樣結(jié)構(gòu)以及雙層膜特征，測量得到的直徑主要分布在30-150nm之間，平均粒徑約為95nm，為外泌體的鑒定提供了重要的形態(tài)學依據(jù)。NTA技術(shù)精確測量了外泌體的粒徑分布和濃度，其結(jié)果與電鏡測量結(jié)果相吻合，進一步證實了所提取物質(zhì)為外泌體，并為后續(xù)實驗提供了準確的濃度數(shù)據(jù)。Westernblot檢測到外泌體中含有CD9、CD63和HSP70等標志蛋白，從蛋白質(zhì)組學層面確認了外泌體的身份，同時通過對不同培養(yǎng)條件下標志蛋白表達水平的分析，為研究外泌體的分泌調(diào)控和功能機制提供了線索。綜合提取與鑒定結(jié)果，成功提取并鑒定出了人牙髓細胞外泌體，且所提取的外泌體具有典型的特征。這些成果為深入研究人牙髓細胞外泌體的生物學功能、作用機制以及在口腔醫(yī)學領(lǐng)域的應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。在解決實驗過程中遇到的問題時，采取的一系列優(yōu)化措施取得了良好效果。通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，如添加生長因子，有效提高了外泌體的產(chǎn)量；嚴格控制樣本制備和實驗操作參數(shù)，設(shè)置對照實驗，顯著提高了鑒定結(jié)果的準確性；采用多次過濾、超濾濃縮和進一步超速離心純化等方法，成功減少了雜質(zhì)的干擾，提高了外泌體的純度。5.2研究展望未來，人牙髓細胞外泌體提取與鑒定技術(shù)有望在多個方面取得進一步突破和發(fā)展。在提取方法上，研發(fā)更加高效、便捷且成本低廉的技術(shù)將是關(guān)鍵方向。例如，隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，基于微流控芯片的外泌體提取方法展現(xiàn)出巨大的潛力。微流控芯片能夠在微小的通道內(nèi)精確操控流體，實現(xiàn)對外泌體的快速、高效分離。其具有體積小、操作簡便、所需樣本量少、分離速度快等優(yōu)點，可有效解決傳統(tǒng)提取方法中存在的問題。通過在微流控芯片上設(shè)計特殊的微結(jié)構(gòu)，利用外泌體與其他雜質(zhì)在流體動力學、表面電荷、親和性等方面的差異，實現(xiàn)外泌體的特異性捕獲和分離。研究發(fā)現(xiàn)，基于免疫親和原理的微流控芯片能夠在短時間內(nèi)從少量樣本中高純度地提取外泌體，為臨床快速診斷和治療提供了可能。此外，結(jié)合新型材料的應用，如納米材料、智能響應材料等，開發(fā)出具有更高選擇性和分離效率的提取方法也值得期待。納米材料具有獨特的物理化學性質(zhì)，如高比表面積、小尺寸效應等，能夠與外泌體發(fā)生特異性相互作用，從而實現(xiàn)外泌體的高效富集和分離。在鑒定技術(shù)方面，開發(fā)更加全面、準確且標準化的鑒定方法是未來的研究重點。目前的鑒定技術(shù)雖然能夠從多個角度對外泌體進行表征，但仍存在一些局限性。未來，應進一步完善外泌體的鑒定標準，建立統(tǒng)一的鑒定流程和質(zhì)量控制體系，以確保不同研究結(jié)果之間的可比性。多模態(tài)成像技術(shù)的發(fā)展將為外泌體的鑒定提供更全面的信息。將熒光成像、磁共振成像（MRI）、拉曼光譜成像等技術(shù)相結(jié)合，能夠同時獲取外泌體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、成分等多方面信息，實現(xiàn)對外泌體的精準鑒定。通過熒光標記外泌體表面的特異性標志物，結(jié)合熒光成像技術(shù)，可以直觀地觀察外泌體在細胞內(nèi)的攝取和分布情況；利用MRI技術(shù)，可以對活體動物體內(nèi)的外泌體進行無創(chuàng)追蹤和監(jiān)測；拉曼光譜成像則能夠提供外泌體的分子指紋信息，用于分析外泌體的化學成分和結(jié)構(gòu)特征。隨著單細胞分析技術(shù)的不斷進步，將其應用于人牙髓細胞外泌體的鑒定，有望深入了解單個外泌體的異質(zhì)性和功能多樣性。單細胞測序技術(shù)可以分析單個外泌體中的核酸組成，揭示外泌體之間的遺傳差異；單細胞蛋白質(zhì)組學技術(shù)則能夠檢測單個外泌體中的蛋白質(zhì)表達譜，為研究外泌體的功能提供更詳細的信息。深入探究人牙髓細胞外泌體的生物學功能和作用機制也是未來研究的重要方向。雖然目前已經(jīng)初步了解到外泌體在牙髓再生、口腔疾病治療等方面具有潛在的應用價值，但對于其具體的作用機制仍知之甚少。進一步研究外泌體中攜帶的生物活性分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，在細胞間通訊和生物學過程中的作用機制，將有助于揭示外泌體的治療潛力，為開發(fā)基于外泌體的新型治療策略提供理論依據(jù)。研究外泌體中特定的miRNA如何通過調(diào)控靶基因的表達，影響牙髓干細胞的增殖、分化和遷移，從而促進牙髓組織的再生；探索外泌體中的蛋白質(zhì)如何激活或抑制相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。此外，開展更多的體內(nèi)實驗和臨床試驗，驗證人牙髓細胞外泌體在口腔疾病治療中的安全性和有效性，推動其從基礎(chǔ)研究向臨床應用的轉(zhuǎn)化，也是未來研究的重要任務(wù)。通過動物模型研究外泌體對牙周炎、牙髓炎等口腔疾病的治療效果，評估其在體內(nèi)的生物分布、代謝和毒副作用；積極開展臨床試驗，探索外泌體在口腔疾病治療中的最佳應用方案和劑量，為臨床治療提供可靠的參考。六、參考文獻[1]姜麗媛，魏元，夏巖，等。牙髓干細胞來源外泌體減輕牙周炎和促進牙周組織再生的作用[J].濟寧醫(yī)學院學報，2024,47(6):466-470.DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2024.06.002.[2]錢杰，馮興梅。牙髓干細胞及其外泌體的應用新進展[J].交通醫(yī)學，2018,32(2):117-120.[3]Theapplicationofpulptissuederived-exosomesinpulpregeneration:anovelcell-homingapproach[J].InternationalJournalofNanomedicine,2022,17:465-476.DOI:10.2147/IJN.S342685.[4]TheryC,AmigorenaS,RaposoG,etal.Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids[J].CurrentProtocolsinCellBiology,2006,Chapter3:Unit322.[5]蒲雙雙。外泌體的提取、鑒定和保存方法研究進展[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2018,33(5):157-160.[6]MaroteA,TeixeiraFG,Mendes-PinheiroB,etal.MSCs-derivedexosomes:cell-secretednanovesicleswithregenerativepotential[J].FrontiersinPharmacology,2016,7:231.[7]QiaoX,TangJ,DouL,etal.DentalPulpStemCell-DerivedExosomesRegulateAnti-InflammatoryandOsteogenesisinPeriodontalLigamentStemCellsandPromotetheRepairofExperimentalPeriodontitisinRats[J].InternationalJournalofNanomedicine,2023,18:4683-4703.DOI:10.2147/IJN.S420967.[8]葉雨陽，岳林，鄒曉英，等。成牙本質(zhì)方向分化牙髓干細胞外泌體形態(tài)及微小RNA表達譜特征[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2024,56(1):116-122.DOI:10.19723/j.issn.1671-167X.2024.01.017.[2]錢杰，馮興梅。牙髓干細胞及其外泌體的應用新進展[J].交通醫(yī)學，2018,32(2):117-120.[3]Theapplicationofpulptissuederived-exosomesinpulpregeneration:anovelcell-homingapproach[J].InternationalJournalofNanomedicine,2022,17:465-476.DOI:10.2147/IJN.S342685.[4]TheryC,AmigorenaS,RaposoG,etal.Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids[J].CurrentProtocolsinCellBiology,2006,Chapter3:Unit322.[5]蒲雙雙。外泌體的提取、鑒定和保存方法研究進展[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2018,33(5):157-160.[6]MaroteA,TeixeiraFG,Mendes-PinheiroB,etal.MSCs-derivedexosomes:cell-secretednanovesicleswithregenerativepotential[J].FrontiersinPharmacology,2016,7:231.[7]QiaoX,TangJ,DouL,etal.DentalPulpStemCell-DerivedExosomesRegulateAnti-InflammatoryandOsteogenesisinPeriodontalLigamentStemCellsandPromotetheRepairofExperimentalPeriodontitisinRats[J].InternationalJournalofNanomedicine,2023,18:4683-4703.DOI:10.2147/IJN.S420967.[8]葉雨陽，岳林，鄒曉英，等。成牙本質(zhì)方向分化牙髓干細胞外泌體形態(tài)及微小RNA表達譜特征[J].北京大學學報(醫(yī)學版),2024,56(1):116-122.DOI:10.19723/j.issn.1671-167X.2024.01.017.[3]Theapplicationofpulptissuederived-exosomesinpulpregeneration:anovelcell-homingapproach[J].InternationalJournalofNanomedicine,2022,17:465-476.DOI:10.2147/IJN.S342685.[4]TheryC,AmigorenaS,RaposoG,etal.Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids[J].CurrentProtocolsinCellBiology,2006,Chapter3:Unit322.[5]蒲雙雙。外泌體的提取、鑒定和保存方法研究進展[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2018,33(5):157-160.[6]MaroteA,TeixeiraFG,Mendes-PinheiroB,etal.MSCs-derivedexosomes:cell-secretednanovesicleswithregenerativepotential[J].FrontiersinPharmacology,2016,7:231.[7]QiaoX,TangJ,DouL,etal.DentalPulpStemCell-DerivedExosomesRegulateAnti-InflammatoryandOsteogenesisinPeriodontalLigamentStemCellsand