CCSB41中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布IT/CVMA229—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提出。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會歸口。本文件起草單位：廣東省醫(yī)學實驗動物中心、五邑大學。本文件主要起草人：陳傍柱、黎桂玲、譚巧燕、劉科、嚴家榮、饒子亮、樓彩霞、黎雄才、黃小紅、趙偉健、謝素麗、鄭佳琳、寧東杰、吳賢生、黃甘泉、楊嘉俊、劉天平、顧為望、鄺少松、王剛。T/CVMA229—20251兔胚胎移植技術操作規(guī)程本文件規(guī)定了兔胚胎移植的方法，包括供體兔的選擇和超數(shù)排卵處理、受體兔的選擇和同步發(fā)情處理、沖胚、撿胚、胚胎鑒定、胚胎移植。本文件適用于兔胚胎移植的各環(huán)節(jié)，以及稀有兔種、基因工程兔等種類的保存。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB14922實驗動物微生物、寄生蟲學等級及監(jiān)測GB14923實驗動物遺傳質量控制GB14924.1實驗動物配合飼料通用質量標準GB/T14924.2實驗動物配合飼料衛(wèi)生標準GB14924.3實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分GB14925實驗動物環(huán)境及設施GB18596畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標準GB/T39760-2021實驗動物安樂死指南NY/T388畜禽場環(huán)境質量標準NY5027無公害食品畜禽飲用水水質NY5131無公害食品肉兔飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準則NY/T5133無公害食品肉兔飼養(yǎng)管理準則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1兔胚胎移植rabbitembryotransplantation將供體兔的胚胎利用技術措施移植給受體兔，以實現(xiàn)兔的代繁育為目的的輔助生殖技術。3.2兔超數(shù)排卵rabbitsuperovulation利用促性腺激素提高供體兔同期卵泡發(fā)育數(shù)量和卵子數(shù)量的技術。3.32T/CVMA229—2025供體兔donorrabbit提供成熟胚胎的健康母兔。3.4接受（移植）胚胎的健康經(jīng)產(chǎn)母兔。3.5檢胚embryoassessment對胚胎進行質量鑒定、分級、清洗和保存的過程。注：通常包括使用顯微鏡觀察胚胎的形態(tài)、結構完整性、細胞4縮略語下列縮略語適用于本文件。FSH：卵泡刺激素（Folliclestimulatinghormone）GnRH：促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasinghormone）HCG：人絨毛膜促性腺激素（Humanchorionicgonadotrophin）PMSG：孕馬血清促性腺激素（PregnantMareSerumGonadotropin）5主要試劑、藥品和設備、材料5.1試劑和藥品5.1.1除非另有說明，所用試劑均為分析純，試驗用水符合GB/T6682的要求。環(huán)境及設施應符合兔的生物學特性并滿足其健康、福利、質量控制和生物安全等要求。5.1.2孕馬血清促性腺激素：市售。5.1.3人絨毛膜促性腺激素：市售。5.1.4促性腺激素釋放激素：市售。5.1.5卵泡刺激素：市售。5.1.6199培養(yǎng)基干粉：市售。5.1.7礦物油：市售。5.1.8麻醉劑、消毒劑、抗菌藥：市售。5.1.9沖胚液和胚胎操作液，配制方法見附錄A。5.2設備與材料所需設備和材料見附錄B。6兔胚胎移植程序3T/CVMA229—2025有兩種常用方案可選擇，即PMSG超數(shù)排卵方案和FSH超數(shù)排卵方案，分別見表1和表2。表1兔胚胎移植程序表（PMSG超數(shù)排卵方案）表2兔胚胎移植程序表（FSH超數(shù)排卵方案）7供體兔的選擇和超數(shù)排卵7.1供體兔的選擇供體兔的選擇遺傳背景明確，符合GB14923所規(guī)定對兔的要求，外觀健康、發(fā)育正常，微生物與寄生蟲的質量控制符合GB14922對兔的要求。供體兔應發(fā)育至性成熟，一般選擇4月齡以上母兔。7.2供體兔的飼養(yǎng)管理供體兔飼喂合格飼料，適當補充蛋白質、維生素、礦物質，并供給清潔的飲水，做到合理飼養(yǎng)，科學管理。其飼料質量按GB14924.1所規(guī)定的要求，飼料衛(wèi)生按GB/T14924.2所規(guī)定的要求，飼料營養(yǎng)按GB14924.3所規(guī)定的要求，飲水按NY5027所規(guī)定的要求，兔養(yǎng)殖環(huán)境質量按NY/T388所規(guī)定的要求，兔實驗環(huán)境則按GB14925所規(guī)定的要求，飼養(yǎng)管理按NY/T5133所規(guī)定的要求，動物微生物質量監(jiān)測安裝按GB14922所規(guī)定的要求，獸醫(yī)防疫按照NY5131所規(guī)定的要求，糞便污物和尸體處理符合GB18596所規(guī)定的要求。供體兔在采胚前后應保證良好的飼養(yǎng)條件，不應隨意變換飼料和管理程序。7.3供體兔的超數(shù)排卵處理和配種在供體兔發(fā)情間期（外陰顏色為淺粉紅色或白色），皮下注射PMSG150IU，72h后與公兔配種或人工授精，并靜脈注射HCG150IU。或每隔12h肌肉注射FSH50IU，72h后與公兔配種或人工授精，并靜脈注射HCG150IU。超排藥品的劑量根據(jù)不同廠家和批號可稍作調整。8受體兔的選擇和同期發(fā)情8.1受體兔的選擇4T/CVMA229—2025受體兔的選擇同7.1，發(fā)育應到達性成熟階段。建議使用母性良好的經(jīng)產(chǎn)母兔。8.2受體兔的飼養(yǎng)管理受體兔的飼養(yǎng)管理同7.2。受體兔在胚胎移植前應保持中等體膘。受體兔在胚胎移植術后應保證良好的飼養(yǎng)條件，按照母兔妊娠后的繁殖育種程序管理。8.3受體兔的同期發(fā)情處理挑選處于發(fā)情期（外陰紅腫，呈深紅色）的受體兔靜脈注射HCG100IU或肌肉注射GnRH15μg。9沖胚9.1沖胚時間以皮下注射PMSG為第1天（0h）。在注射PMSG70h~72h后用手術法或安樂死后從輸卵管回收胚胎（在人工輸精或配種后20h~25h內(nèi)沖卵，可沖出發(fā)育至1細胞期~4細胞期的胚胎）。9.2手術室要求采胚及胚胎移植應在干凈、光線充足、無塵的環(huán)境下進行。室內(nèi)溫度保持約25℃。定期用新潔爾滅等溫和型消毒劑噴霧消毒，手術前用紫外燈照射0.5h~1h。9.3器械、沖胚液等準備9.3.1金屬手術器械應提前進行高溫高壓滅菌處理。9.3.2培養(yǎng)皿、注射器、紗布、縫合線和手術貼膜均采用一次性無菌用品。9.3.3經(jīng)過濾除菌的沖胚液提前30min~60min置于38.5℃水浴預熱。培養(yǎng)皿置于恒溫熱臺或培養(yǎng)箱9.3.4備齊麻醉藥、消毒藥、抗菌素及酒精棉和碘酒棉等物品。9.4供體兔術前準備供體兔術前一天晚上適量減少飲食，但避免完全禁食。9.5采胚方法按照GB/T39760-2021對供體兔安樂死，分離子宮角、輸卵管和卵巢。用平針頭注射器抽取5mL預熱的沖胚液。將針頭從子宮角朝輸卵管方向進入，穿入輸卵管峽部。一人操作，一只手在針頭后方捏緊子宮角，另一只手推注射器。沖胚液由宮管結合部流入輸卵管，液體將胚胎從輸卵管傘部沖出，收集沖胚液于60mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿及時置于38.5℃的恒溫熱臺或培養(yǎng)箱。吸取適量胚胎操作液，在60mm培養(yǎng)皿底部作數(shù)個規(guī)則排列的培養(yǎng)微滴（120μL/滴），并用礦物油完全覆蓋每個微滴，置于38.5℃恒溫熱臺上提前加熱備用。檢胚操作室溫應為25℃~30℃。待檢的胚胎保持在38.5℃沖胚液中，置于體式顯微鏡下，用口吸管或手控管檢胚。將胚胎吸至不同胚胎操作液微5T/CVMA229—2025滴中洗3次~5次，每轉移一個胚胎操作液微滴計為洗一次，然后把全部胚胎移至新的胚胎操作液微滴中，置于38.5℃恒溫熱臺上0.5h~2h。11胚胎鑒定凡單細胞期胚胎內(nèi)部未見兩個極體和原核，或胚胎的卵黃未形成分裂球及細胞團，均列為未受精卵。未受精胚胎或非正常發(fā)育胚胎，不能用于胚胎移植。12胚胎移植12.1受體母兔術前準備受體兔術前一天晚上應適量減少飲食，但避免完全禁食12.2受體母兔胚胎移植手術12.2.1受體兔麻醉鹽酸賽拉嗪等麻醉劑進行誘導麻醉，劑量為0.15mL/kg，接著用4%~5%異氟烷誘導麻醉，再用1%~2%異氟烷維持呼吸麻醉。受體兔麻醉后側臥位置于手術臺上。麻醉過程中應時刻注意母兔呼吸是否正常。12.2.2手術部位及其消毒手術部位下腹側部。用剃毛刀剃毛，然后涂以5%的碘酒消毒3次，待干后再用75%的酒精棉脫碘。將無菌手術貼膜貼在手術部位。12.2.3術者的準備術者應將指甲剪短滑光，用指刷、肥皂清洗，再進行消毒。術者需穿無菌手術服，戴工作帽和口罩。12.2.4手術操作12.2.4.1組織分離和止血后側腹部開2cm~3cm切口，逐層切開皮膚、肌肉層和腹膜，暴露輸卵管和卵巢。作切口時應盡量避開較大血管和神經(jīng)，依皮膚、筋膜、肌肉、腹膜逐層切開，切口邊緣與切面要整齊，切口方向與組織走向盡量一致，切開肌肉時采用鈍性分離法。切開后暴露輸卵管和卵巢。手術中出血應及時止血。對常見的毛細管出血或滲血，用紗布敷料輕壓出血處即可。小血管出血可用止血鉗止血，較大血管出血除用止血鉗夾住暫時止血外，必要時結扎止血。12.2.4.2移植胚胎無菌吸取細胞培養(yǎng)上清液放入5mL滅菌離心管中。不可用力牽拉卵巢和輸卵管。將經(jīng)培養(yǎng)后的胚胎（1細胞期~4細胞期）吸入移植管。從輸卵管漏斗處插入移植管，使用無損傷的鑷子輔助移植管，插入輸卵管更深的位置，最好為輸卵管第2個~3個彎曲之后，將胚胎移入輸卵管。通常雙側輸卵管均移植，每側輸卵管移植胚胎4枚~10枚（經(jīng)顯微注射后的胚胎，可增加至每側移植30枚）。移植后，將卵巢、輸卵管和子宮角復位，按常規(guī)手術逐層縫合、消毒。6T/CVMA229—202512.2.4.3胚胎移植術后術后3d予以抗生素預防感染。母兔術后自由采食，自由飲水。術后13d