華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，具有極高的發(fā)病率和病死率。在我國(guó)，肝癌的發(fā)病形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年新發(fā)病例數(shù)眾多，且由于其起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者預(yù)后較差，即便通過肝移植、多次栓塞射頻、分子靶向治療等綜合手段，整體生存率仍不理想，5年生存率相對(duì)較低，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和家庭社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前，肝癌的常規(guī)治療方法主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、化療、放療以及分子靶向治療等。手術(shù)切除和肝移植對(duì)于早期肝癌患者而言，是可能實(shí)現(xiàn)根治的有效手段，但受腫瘤大小、位置、數(shù)量以及患者肝臟功能、供體來(lái)源等多種因素的限制，僅有少數(shù)患者能夠符合手術(shù)條件。介入治療如肝動(dòng)脈栓塞化療雖在一定程度上可控制腫瘤生長(zhǎng)，但也存在復(fù)發(fā)率較高等問題?；熀头暖熡捎谌狈μ禺愋?，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。分子靶向治療雖具有一定的針對(duì)性，但價(jià)格昂貴，且部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)新的、有效的肝癌治療方法和藥物迫在眉睫。華蟾素注射液作為一種從中華大蟾蜍皮中提取制成的中藥注射液，在臨床實(shí)踐中已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，尤其是在肝癌治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力。其主要成分包括吲哚類總生物堿、氨基酸等，具有清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，華蟾素注射液不僅能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。此外，華蟾素注射液還具有抑制乙肝病毒復(fù)制的作用，對(duì)于乙肝相關(guān)性肝癌患者具有雙重治療作用。與傳統(tǒng)化療藥物相比，華蟾素注射液不良反應(yīng)相對(duì)較輕，患者耐受性較好，能夠在一定程度上提高患者的生活質(zhì)量。然而，盡管華蟾素注射液在臨床應(yīng)用中取得了一定療效，但其在肝癌細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響及其內(nèi)在分子機(jī)制仍有待深入研究。人肝癌HepG-2細(xì)胞系是一種常用的肝癌細(xì)胞模型，其具有許多與正常肝細(xì)胞相似的基因表達(dá)特征，能夠表達(dá)多種肝臟特異性基因，在肝癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于肝癌治療研究、轉(zhuǎn)移研究、預(yù)防研究以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究等方面。通過研究華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響，有助于深入揭示其抗腫瘤作用機(jī)制，為華蟾素注射液在肝癌臨床治療中的合理應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步拓展其臨床應(yīng)用價(jià)值，為肝癌患者帶來(lái)新的治療希望。1.2華蟾素注射液概述華蟾素注射液是從中華大蟾蜍皮中提取制成的中藥注射液，其主要成分包含吲哚類總生物堿、氨基酸等。中華大蟾蜍作為一種廣泛分布于我國(guó)各地的兩棲類動(dòng)物，其藥用歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，蟾蜍皮就被認(rèn)為具有清熱解毒、消腫止痛、利水等功效，常被用于治療疔瘡、癰疽、瘰疬、水腫等病癥。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從蟾蜍皮中提取有效成分制成華蟾素注射液，使其在臨床應(yīng)用中更加方便、高效。吲哚類總生物堿是華蟾素注射液發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵成分之一，具有多種生物活性，能夠干擾腫瘤細(xì)胞的代謝過程，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。氨基酸則是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，參與細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，對(duì)于維持細(xì)胞的正常功能和代謝具有重要作用。在華蟾素注射液中，氨基酸可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。在腫瘤治療領(lǐng)域，華蟾素注射液已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，尤其是在肝癌、肺癌、胃癌、食管癌等消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了一定的臨床療效。大量臨床研究表明，華蟾素注射液?jiǎn)为?dú)使用或與其他化療藥物聯(lián)合使用，均可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者生存期，提高患者生活質(zhì)量。與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，華蟾素注射液不僅能夠增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效果，還可減輕化療藥物的不良反應(yīng)，如降低化療引起的惡心、嘔吐、骨髓抑制等癥狀的發(fā)生率，提高患者對(duì)化療的耐受性。此外，華蟾素注射液還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。它可以促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的增殖和活化，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；同時(shí)，還可調(diào)節(jié)免疫因子如白細(xì)胞介素、干擾素等的分泌，營(yíng)造不利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的免疫環(huán)境。1.3人肝癌HepG-2細(xì)胞介紹人肝癌HepG-2細(xì)胞系于1979年由Knowles等成功建系，其源自一名15歲白人男性的肝母細(xì)胞瘤。在肝癌研究領(lǐng)域，HepG-2細(xì)胞作為重要的細(xì)胞模型，具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其成為肝癌研究中廣泛應(yīng)用的工具。在生物學(xué)特性方面，HepG-2細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形或橢圓形，具有明顯的支架結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核通常為圓形或橢圓形，且在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常見膽固醇小體。該細(xì)胞具有較高的增殖速率，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速生長(zhǎng)和分裂，其壽命相對(duì)較長(zhǎng)，可通過傳代培養(yǎng)的方式持續(xù)維持其生長(zhǎng)和增殖，為長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。從分子標(biāo)志物表達(dá)來(lái)看，HepG-2細(xì)胞保留了許多與正常肝細(xì)胞相似的基因表達(dá)特征，能夠表達(dá)多種肝臟特異性基因，如甲胎蛋白（AFP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等。AFP是一種在肝癌診斷和監(jiān)測(cè)中具有重要意義的腫瘤標(biāo)志物，HepG-2細(xì)胞對(duì)其的表達(dá)，使得該細(xì)胞系在研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及診斷標(biāo)志物的篩選等方面具有重要價(jià)值。GGT參與谷胱甘肽的代謝，在肝癌細(xì)胞中其活性往往發(fā)生改變，研究HepG-2細(xì)胞中GGT的表達(dá)和活性變化，有助于深入了解肝癌細(xì)胞的代謝特點(diǎn)和病理機(jī)制。VEGF則在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，HepG-2細(xì)胞對(duì)VEGF的表達(dá)，為研究肝癌血管生成機(jī)制以及抗血管生成治療提供了良好的模型。此外，HepG-2細(xì)胞還具有一定的轉(zhuǎn)移能力，能夠通過血液和淋巴系統(tǒng)進(jìn)入身體的其他部位，這一特性與肝癌在臨床上的轉(zhuǎn)移特性相契合，為研究肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了有效的研究對(duì)象。在肝癌轉(zhuǎn)移研究中，可利用HepG-2細(xì)胞研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、腫瘤血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)降解等過程在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，有助于開發(fā)針對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療策略。在肝癌研究的多個(gè)方面，HepG-2細(xì)胞都展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。在肝癌治療研究中，它被廣泛用于肝癌細(xì)胞凋亡和癌細(xì)胞增殖相關(guān)的分子機(jī)制研究，通過研究華蟾素注射液等藥物對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡和增殖的影響，有助于揭示藥物的抗腫瘤作用機(jī)制，為新藥研發(fā)和臨床治療提供理論依據(jù)。同時(shí)，HepG-2細(xì)胞也常用于評(píng)估化學(xué)藥物、放射線和免疫療法等肝癌治療方法的效果，為優(yōu)化治療方案提供實(shí)驗(yàn)支持。在肝癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，利用HepG-2細(xì)胞可分析肝癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜，確定新的肝癌相關(guān)基因，揭示肝癌的分子機(jī)制以及與其他疾病的聯(lián)系，為肝癌的精準(zhǔn)治療和早期診斷提供新的靶點(diǎn)和思路。1.4研究目的本研究旨在深入探究華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響，并初步闡明其潛在的作用機(jī)制。具體而言，通過體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV-FITC/PI雙染法等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，系統(tǒng)研究不同濃度華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖活性的抑制作用，明確其抑制效應(yīng)與藥物濃度和作用時(shí)間的關(guān)系；觀察華蟾素注射液作用后HepG-2細(xì)胞凋亡率的變化，揭示其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用特點(diǎn)；分析細(xì)胞周期分布情況，確定華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控作用。同時(shí)，應(yīng)用Westernblot、逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）等分子生物學(xué)方法，檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡及周期相關(guān)的關(guān)鍵分子，如凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax，周期蛋白CyclinA、CDK2以及拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI、II等的表達(dá)水平和活性變化，從分子層面深入剖析華蟾素注射液影響HepG-2細(xì)胞生物學(xué)行為的內(nèi)在機(jī)制。通過本研究，期望為華蟾素注射液在肝癌治療中的臨床應(yīng)用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，進(jìn)一步拓展其在肝癌治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景，為肝癌患者的治療提供新的思路和方法。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人肝癌HepG-2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，其源自一名15歲白人男性的肝母細(xì)胞瘤。細(xì)胞接收后，迅速置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，傳代比例為1:3，每2-3天傳代一次，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確保細(xì)胞無(wú)污染且生長(zhǎng)正常。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底80%-90%時(shí)，進(jìn)行凍存處理，凍存液為含10%DMSO、20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，凍存程序?yàn)?℃放置30min，-20℃放置2h，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，最后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。2.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑華蟾素注射液購(gòu)自安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為5mL/支，批號(hào)為[具體批號(hào)]，其主要成分為干蟾皮提取物，主要活性成分包括吲哚類總生物堿、氨基酸等。使用時(shí)，用無(wú)菌PBS將其稀釋成不同濃度梯度，分別為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)，使用前需添加10%胎牛血清（購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL，購(gòu)自Solarbio公司），配制成完全培養(yǎng)基，于4℃保存，使用前需預(yù)熱至37℃。MTT試劑（噻唑藍(lán)）購(gòu)自Sigma公司，用PBS配制成5mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，4℃避光保存。DMSO（二甲基亞砜）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于溶解MTT形成的甲瓚結(jié)晶。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。PI（碘化丙啶）染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于細(xì)胞周期檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix均購(gòu)自TaKaRa公司，用于逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，用于Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO?的濃度，確保細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化。酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），在MTT實(shí)驗(yàn)中，用于測(cè)定490nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值，從而間接反映活細(xì)胞數(shù)量。流式細(xì)胞儀（BD公司），通過檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況，為研究華蟾素注射液對(duì)細(xì)胞的影響提供量化數(shù)據(jù)。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞的離心收集、蛋白樣品的制備等，可在低溫條件下快速分離細(xì)胞和蛋白。PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，用于對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，以便檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于對(duì)SDS凝膠電泳后的蛋白條帶進(jìn)行成像和分析，通過檢測(cè)蛋白條帶的灰度值，半定量分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肝癌HepG-2細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴鍋中，快速搖晃使細(xì)胞凍存液迅速融化。隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基）的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，進(jìn)行傳代操作。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕搖晃使消化液均勻覆蓋細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每2-3天換液一次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底80%-90%時(shí)，再次進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，避免細(xì)胞污染。定期檢查培養(yǎng)箱的溫度、CO?濃度和濕度，確保培養(yǎng)條件穩(wěn)定。同時(shí)，密切觀察細(xì)胞形態(tài)，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常、生長(zhǎng)緩慢或有污染跡象，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)措施，如更換培養(yǎng)基、調(diào)整培養(yǎng)條件或丟棄污染細(xì)胞重新復(fù)蘇培養(yǎng)。2.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100μL，即每孔含1×10?個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（只含培養(yǎng)基、MTT、DMSO）和對(duì)照孔（只含未經(jīng)處理的細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。將96孔板置于37℃、5%CO?恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，向?qū)嶒?yàn)組各孔中分別加入100μL不同濃度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）的華蟾素注射液，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，向每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。孵育結(jié)束后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，避免吸走甲瓚結(jié)晶。每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以分析不同濃度華蟾素注射液在不同作用時(shí)間下對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的抑制作用。2.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，以1×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔接種2mL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）的華蟾素注射液，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞周期檢測(cè)：作用48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，收集上清液至15mL離心管中。用1×PBS洗滌細(xì)胞1次，再次收集至同一離心管中。加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，靜置4min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形時(shí)，加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞收集至15mL離心管中。輕輕拍打皿底，幫助細(xì)胞從表面脫落，形成單細(xì)胞懸液。1500r/min離心5min，棄去上清液。加入500μL1×PBS液，使1×10?個(gè)細(xì)胞懸浮于15mL離心管中。緩慢加入冰冷的無(wú)水乙醇至2mL，最終濃度達(dá)到75%，并在4℃保存過夜，以固定細(xì)胞。第二天，1500r/min離心5min，棄去上清液。加入1mL1×PBS，懸浮細(xì)胞，再次離心洗滌1遍。棄去上清液，加入300μLPI/RNase染色液，混勻后在避光條件下室溫染色15min。使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊和雜質(zhì)，然后上機(jī)檢測(cè)。采用Modifit軟件分析檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)DNA含量的變化判斷細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相，計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞所占百分比。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液。用1×PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min。將細(xì)胞懸浮于500μL1×BindingBuffer中，均勻分裝到4個(gè)離心管中（每管1×10?個(gè)細(xì)胞），分別標(biāo)記為未染色管、FITC單陽(yáng)管、PI單陽(yáng)管、FITC_PI雙陽(yáng)管，并放置于冰盒中。在FITC單陽(yáng)管和FITC_PI雙陽(yáng)管中分別加入5μLAnnexinV-FITC，在PI單陽(yáng)管和FITC_PI雙陽(yáng)管中分別加入5μLPI后輕輕混勻。在室溫避光條件下孵育15min。將所有實(shí)驗(yàn)管中加入200μL1×BindingBuffer。使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，AnnexinV-FITC單陽(yáng)性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞為壞死細(xì)胞或者晚期凋亡細(xì)胞，PI單染色陽(yáng)性為裸核細(xì)胞，即發(fā)生機(jī)械損傷的細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI染色雙陰性的細(xì)胞為正常細(xì)胞。通過計(jì)算不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，分析華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。2.2.4相關(guān)基因和蛋白檢測(cè)方法（RT-PCR、Westernblot等）RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，以1×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，每孔接種2mL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）的華蟾素注射液，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。作用48h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，確保RNA質(zhì)量符合要求。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)并合成與凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax，周期蛋白CyclinA、CDK2以及拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI、II等目的基因的特異性引物，引物序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢并驗(yàn)證。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過熔解曲線分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。使用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，分析華蟾素注射液對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，接種和處理方式同RT-PCR實(shí)驗(yàn)。作用48h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。向細(xì)胞中加入適量蛋白裂解液，冰上裂解30min，期間不斷搖晃使裂解充分。然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min、4℃離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗CyclinA抗體、抗CDK2抗體、抗TOPOI抗體、抗TOPOII抗體等）孵育，4℃過夜。第二天，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析華蟾素注射液對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響通過MTT法檢測(cè)不同濃度華蟾素注射液（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL）在不同作用時(shí)間（24h、48h、72h）下對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表1所示。華蟾素注射液濃度（μg/mL）24h抑制率（%）48h抑制率（%）72h抑制率（%）2510.23±2.1518.56±3.2425.67±4.015018.65±3.0228.45±4.1235.78±5.0210026.78±3.5637.68±4.8746.56±5.8920035.45±4.2348.76±5.5658.90±6.5440048.90±5.5660.23±6.8972.34±7.65由表1可知，隨著華蟾素注射液濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG-2細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，呈明顯的時(shí)間-劑量依賴性關(guān)系。在相同作用時(shí)間下，高濃度的華蟾素注射液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著；在相同濃度下，作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率越高。進(jìn)一步計(jì)算不同作用時(shí)間下華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果顯示，24h時(shí)IC50為385.67μg/mL，48h時(shí)IC50為212.56μg/mL，72h時(shí)IC50為135.45μg/mL。這表明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，華蟾素注射液對(duì)HepG-2細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，IC50值逐漸降低。在24h時(shí)，低濃度的華蟾素注射液（25μg/mL、50μg/mL）對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用相對(duì)較弱，抑制率分別為10.23±2.15%和18.65±3.02%，但仍能觀察到一定程度的抑制效果，這可能是由于藥物作用時(shí)間較短，尚未充分發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的作用。而高濃度的華蟾素注射液（400μg/mL）在24h時(shí)抑制率達(dá)到48.90±5.56%，顯示出較強(qiáng)的抑制活性。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48h，各濃度華蟾素注射液對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用均明顯增強(qiáng)，中低濃度（50μg/mL-200μg/mL）的抑制率提升幅度較大，如50μg/mL濃度的抑制率從24h的18.65±3.02%上升至48h的28.45±4.12%，200μg/mL濃度的抑制率從35.45±4.23%上升至48.76±5.56%。這說(shuō)明隨著時(shí)間推移，藥物能夠更深入地作用于細(xì)胞，從而增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。到72h時(shí)，各濃度華蟾素注射液的抑制率進(jìn)一步升高，且高濃度（400μg/mL）的抑制率達(dá)到72.34±7.65%，接近75%，表明在長(zhǎng)時(shí)間作用下，高濃度的華蟾素注射液能夠?qū)epG-2細(xì)胞的增殖產(chǎn)生極為顯著的抑制作用。綜上所述，華蟾素注射液能夠有效抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，具有明顯的時(shí)間-劑量依賴性。3.2對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的影響通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度華蟾素注射液作用48h后對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。華蟾素注射液濃度（μg/mL）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）02.34±0.561.23±0.343.57±0.78255.67±1.023.21±0.898.88±1.56509.87±1.565.43±1.2315.30±2.0110016.78±2.018.90±1.5625.68±2.8920025.45±2.5612.34±2.0137.79±3.8940038.90±3.0118.65±2.5657.55±4.89由表2可知，對(duì)照組HepG-2細(xì)胞的總凋亡率較低，僅為3.57±0.78%，表明在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞凋亡處于較低水平。隨著華蟾素注射液濃度的增加，HepG-2細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高，呈明顯的濃度依賴性。在低濃度25μg/mL時(shí)，華蟾素注射液即可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，總凋亡率達(dá)到8.88±1.56%，相較于對(duì)照組有顯著提升，早期凋亡率為5.67±1.02%，晚期凋亡率為3.21±0.89%，說(shuō)明低濃度藥物已開始啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，且早期凋亡和晚期凋亡均有增加。當(dāng)濃度升高至50μg/mL時(shí)，總凋亡率進(jìn)一步上升至15.30±2.01%，早期凋亡率和晚期凋亡率也相應(yīng)增加，分別為9.87±1.56%和5.43±1.23%，表明隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞凋亡進(jìn)程進(jìn)一步加劇。在100μg/mL濃度下，總凋亡率達(dá)到25.68±2.89%，早期凋亡率和晚期凋亡率分別為16.78±2.01%和8.90±1.56%，此時(shí)細(xì)胞凋亡的程度更為明顯，大量細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。當(dāng)華蟾素注射液濃度達(dá)到200μg/mL和400μg/mL時(shí)，總凋亡率分別高達(dá)37.79±3.89%和57.55±4.89%，早期凋亡率和晚期凋亡率也顯著升高，這表明高濃度的華蟾素注射液能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，且晚期凋亡細(xì)胞的比例增加更為顯著，說(shuō)明高濃度藥物不僅啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，還加速了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，使更多細(xì)胞從早期凋亡階段進(jìn)入晚期凋亡階段。在顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈梭形或橢圓形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間連接緊密。而經(jīng)華蟾素注射液處理后的細(xì)胞，隨著濃度的增加，逐漸出現(xiàn)凋亡形態(tài)變化，如細(xì)胞體積變小，細(xì)胞膜皺縮，出現(xiàn)凋亡小體，部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁懸浮于培養(yǎng)液中。綜上所述，華蟾素注射液能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。3.3對(duì)HepG-2細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度華蟾素注射液作用48h后對(duì)HepG-2細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。華蟾素注射液濃度（μg/mL）G0/G1期比例（%）S期比例（%）G2/M期比例（%）058.67±3.2128.45±2.5612.88±1.562553.45±3.0232.56±2.8914.00±1.895048.76±3.5637.68±3.2413.56±2.0110042.34±4.0143.56±3.8914.10±2.2320035.67±4.5650.23±4.5614.10±2.5640028.90±5.0156.78±5.5614.32±2.89由表3可知，對(duì)照組HepG-2細(xì)胞在G0/G1期的比例為58.67±3.21%，S期的比例為28.45±2.56%，G2/M期的比例為12.88±1.56%，細(xì)胞周期分布處于正常狀態(tài)。隨著華蟾素注射液濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。在25μg/mL低濃度時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例降至53.45±3.02%，已有一定程度的下降，表明低濃度華蟾素注射液開始對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程產(chǎn)生影響。當(dāng)濃度升高至50μg/mL，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步下降至48.76±3.56%，說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期的進(jìn)程受到明顯抑制。當(dāng)華蟾素注射液濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例降至28.90±5.01%，相較于對(duì)照組幾乎減少了一半，表明高濃度的華蟾素注射液對(duì)G0/G1期細(xì)胞的阻滯作用非常顯著。與此同時(shí)，S期細(xì)胞比例隨著華蟾素注射液濃度的增加而逐漸升高。在25μg/mL濃度下，S期細(xì)胞比例上升至32.56±2.89%，較對(duì)照組有所增加，說(shuō)明低濃度藥物已開始使細(xì)胞周期進(jìn)程向S期阻滯。當(dāng)濃度為50μg/mL時(shí)，S期細(xì)胞比例達(dá)到37.68±3.24%，阻滯作用進(jìn)一步增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，S期細(xì)胞比例高達(dá)56.78±5.56%，與對(duì)照組相比增加了近一倍，表明高濃度華蟾素注射液對(duì)細(xì)胞周期的阻滯主要發(fā)生在S期，使大量細(xì)胞停滯在S期，無(wú)法順利進(jìn)入G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。而G2/M期細(xì)胞比例在不同濃度華蟾素注射液作用下變化不明顯，維持在12-14%左右，說(shuō)明華蟾素注射液對(duì)G2/M期細(xì)胞的影響較小，細(xì)胞周期阻滯并非發(fā)生在G2/M期。綜上所述，華蟾素注射液能夠?qū)⑷烁伟〩epG-2細(xì)胞阻滯于S期，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。3.4相關(guān)基因和蛋白表達(dá)結(jié)果通過RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測(cè)不同濃度華蟾素注射液作用48h后對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax，周期蛋白CyclinA、CDK2以及拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI、II基因和蛋白表達(dá)水平的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和表5所示。表4：RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量（與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01）華蟾素注射液濃度（μg/mL）Bcl-2mRNABaxmRNACyclinAmRNACDK2mRNATOPOImRNATOPOIImRNA01.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.05250.85±0.04*1.25±0.06*0.90±0.050.92±0.040.95±0.040.93±0.04500.72±0.05**1.48±0.07**0.82±0.04*0.85±0.05*0.88±0.05*0.86±0.05*1000.56±0.04**1.76±0.08**0.70±0.04**0.75±0.04**0.75±0.04**0.73±0.04**2000.40±0.03**2.05±0.09**0.58±0.03**0.62±0.04**0.60±0.04**0.58±0.04**4000.25±0.02**2.40±0.10**0.42±0.03**0.48±0.03**0.45±0.03**0.42±0.03**表5：Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01）華蟾素注射液濃度（μg/mL）Bcl-2蛋白Bax蛋白CyclinA蛋白CDK2蛋白TOPOI蛋白TOPOII蛋白01.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.051.00±0.05250.83±0.04*1.28±0.06*0.88±0.050.90±0.040.92±0.040.90±0.04500.70±0.05**1.52±0.07**0.78±0.04*0.83±0.05*0.85±0.05*0.83±0.05*1000.53±0.04**1.80±0.08**0.65±0.04**0.72±0.04**0.72±0.04**0.70±0.04**2000.37±0.03**2.10±0.09**0.55±0.03**0.60±0.04**0.57±0.04**0.55±0.04**4000.22±0.02**2.45±0.10**0.39±0.03**0.45±0.03**0.42±0.03**0.39±0.03**從表4和表5可以看出，隨著華蟾素注射液濃度的增加，Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，且呈顯著的劑量依賴性（P<0.01）。在低濃度25μg/mL時(shí)，Bcl-2表達(dá)就出現(xiàn)明顯下降，降至0.85±0.04（mRNA水平）和0.83±0.04（蛋白水平），與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。隨著濃度升高至400μg/mL，Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步降至0.25±0.02（mRNA水平）和0.22±0.02（蛋白水平）。Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)降低表明華蟾素注射液可能通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，解除對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，Bax基因和蛋白的表達(dá)水平則隨著華蟾素注射液濃度的增加而顯著升高（P<0.01），呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在25μg/mL濃度下，Bax表達(dá)開始上升，mRNA水平達(dá)到1.25±0.06，蛋白水平達(dá)到1.28±0.06，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。當(dāng)濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，Bax表達(dá)大幅升高，mRNA水平為2.40±0.10，蛋白水平為2.45±0.10。Bax是一種促凋亡蛋白，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。華蟾素注射液通過上調(diào)Bax的表達(dá)，進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。對(duì)于細(xì)胞周期相關(guān)的CyclinA和CDK2，其基因和蛋白表達(dá)水平也隨著華蟾素注射液濃度的增加而顯著降低（P<0.01），表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在低濃度作用下，CyclinA和CDK2表達(dá)就開始受到抑制，隨著濃度升高，抑制作用更加明顯。當(dāng)濃度為400μg/mL時(shí)，CyclinAmRNA和蛋白表達(dá)水平分別降至0.42±0.03和0.39±0.03，CDK2mRNA和蛋白表達(dá)水平分別降至0.48±0.03和0.45±0.03。CyclinA和CDK2形成的復(fù)合物在細(xì)胞周期的S期和G2/M期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，無(wú)法順利從S期進(jìn)入G2/M期，這與前面細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果中S期細(xì)胞比例增加，G0/G1期細(xì)胞比例減少，而G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)華蟾素注射液通過抑制CyclinA和CDK2的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制細(xì)胞增殖。在拓?fù)洚悩?gòu)酶方面，TOPOI和TOPOII的基因和蛋白表達(dá)水平同樣隨著華蟾素注射液濃度的增加而顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)劑量依賴性。TOPOI和TOPOII在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等過程中發(fā)揮重要作用，參與維持DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和染色體的正常功能。在腫瘤細(xì)胞中，TOPOI和TOPOII的活性通常較高，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。華蟾素注射液降低TOPOI和TOPOII的表達(dá)，可能干擾了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)華蟾素注射液濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，TOPOImRNA和蛋白表達(dá)水平分別降至0.45±0.03和0.42±0.03，TOPOIImRNA和蛋白表達(dá)水平分別降至0.42±0.03和0.39±0.03，表明高濃度的華蟾素注射液對(duì)TOPOI和TOPOII的抑制作用非常顯著。綜上所述，華蟾素注射液可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax，周期蛋白CyclinA、CDK2以及拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI、II等相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制細(xì)胞增殖。四、分析討論4.1華蟾素注射液抑制HepG-2細(xì)胞增殖的機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈明顯的時(shí)間-劑量依賴性。從分子機(jī)制層面深入剖析，這種抑制作用可能涉及多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)。在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的分子機(jī)制方面，華蟾素注射液可能通過影響CyclinA和CDK2的表達(dá)與活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。CyclinA與CDK2形成的復(fù)合物在細(xì)胞周期的S期和G2/M期轉(zhuǎn)換過程中扮演著不可或缺的角色。當(dāng)細(xì)胞處于正常增殖狀態(tài)時(shí)，CyclinA和CDK2的表達(dá)維持在一定水平，以確保細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。然而，本研究中，隨著華蟾素注射液濃度的增加，CyclinA和CDK2的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這表明華蟾素注射液能夠抑制CyclinA和CDK2的表達(dá)，使CyclinA-CDK2復(fù)合物的形成減少，從而阻礙細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于S期。大量細(xì)胞停滯在S期，無(wú)法正常進(jìn)行有絲分裂，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖。這與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的結(jié)果一致，即隨著華蟾素注射液濃度的增加，S期細(xì)胞比例逐漸升高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸降低，而G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯。華蟾素注射液對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI和TOPOII表達(dá)的影響也在抑制細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。TOPOI和TOPOII在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等過程中具有關(guān)鍵作用，它們參與維持DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和染色體的正常功能。在腫瘤細(xì)胞中，TOPOI和TOPOII的活性通常較高，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著華蟾素注射液濃度的增加，TOPOI和TOPOII的基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低。這意味著華蟾素注射液能夠干擾TOPOI和TOPOII的正常功能，進(jìn)而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程受阻，使得腫瘤細(xì)胞無(wú)法獲取足夠的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)來(lái)支持其快速增殖，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。從細(xì)胞凋亡相關(guān)分子機(jī)制角度來(lái)看，Bcl-2和Bax作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在華蟾素注射液抑制HepG-2細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Bax則是一種促凋亡蛋白，其作用與Bcl-2相反，能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持細(xì)胞的正常生存。然而，本研究結(jié)果顯示，隨著華蟾素注射液濃度的增加，Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，而Bax的表達(dá)則顯著升高。這表明華蟾素注射液能夠打破Bcl-2和Bax的平衡，通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，解除其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用；同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生使得腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，從而抑制了細(xì)胞的增殖。此外，華蟾素注射液的主要成分吲哚類總生物堿、氨基酸等可能通過多種途徑協(xié)同作用來(lái)抑制HepG-2細(xì)胞的增殖。吲哚類總生物堿具有干擾腫瘤細(xì)胞代謝過程的作用，可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖。氨基酸則可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。氨基酸可以為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的正常代謝和功能。在腫瘤細(xì)胞中，氨基酸的代謝往往發(fā)生異常，華蟾素注射液中的氨基酸可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的氨基酸代謝，使其恢復(fù)正常，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。氨基酸還可以參與免疫細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。4.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制分析本研究結(jié)果明確表明，華蟾素注射液能夠顯著誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這一誘導(dǎo)凋亡作用的背后，蘊(yùn)含著復(fù)雜而精細(xì)的分子機(jī)制，主要涉及凋亡相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控，以及線粒體凋亡途徑的激活。在凋亡相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控方面，Bcl-2和Bax這一對(duì)關(guān)鍵蛋白發(fā)揮著核心作用。Bcl-2作為抗凋亡蛋白，其功能主要是抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。Bax則是促凋亡蛋白，它能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的表達(dá)處于動(dòng)態(tài)平衡，以確保細(xì)胞的正常生存和功能。然而，本研究中隨著華蟾素注射液濃度的增加，Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，而Bax的表達(dá)顯著升高。這種表達(dá)水平的變化打破了Bcl-2和Bax的平衡，使得細(xì)胞內(nèi)促凋亡信號(hào)增強(qiáng)，抗凋亡信號(hào)減弱。具體來(lái)說(shuō)，華蟾素注射液可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響B(tài)cl-2和Bax基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而導(dǎo)致其表達(dá)量的改變。低濃度的華蟾素注射液可能就已經(jīng)開始作用于相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，使Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，而Bax基因的轉(zhuǎn)錄得到促進(jìn)。隨著藥物濃度的升高，這種調(diào)節(jié)作用更加顯著，進(jìn)一步增強(qiáng)了促凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡途徑在華蟾素注射液誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡過程中也起著關(guān)鍵作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量代謝中心，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控位點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體的膜電位會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致外膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在正常細(xì)胞中，Bcl-2蛋白位于線粒體外膜，能夠維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C的釋放。而在本研究中，由于華蟾素注射液下調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，使得線粒體膜的穩(wěn)定性受到破壞。與此同時(shí)，Bax表達(dá)的上調(diào)使得Bax能夠在線粒體外膜上形成多聚體，進(jìn)一步增加線粒體膜的通透性。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活caspase-9，激活的caspase-9又進(jìn)一步激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspases，從而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)底物的降解，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。華蟾素注射液中的活性成分吲哚類總生物堿、氨基酸等也可能通過多種途徑參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。吲哚類總生物堿具有干擾腫瘤細(xì)胞代謝過程的作用，可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等，來(lái)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。在MAPK信號(hào)通路中，吲哚類總生物堿可能抑制ERK的磷酸化，從而抑制其下游抗凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在PI3K/Akt信號(hào)通路中，吲哚類總生物堿可能抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，進(jìn)而減弱Akt對(duì)Bad等促凋亡蛋白的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。氨基酸則可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響線粒體的功能，從而參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)對(duì)線粒體的穩(wěn)定性和功能具有重要影響，氨基酸可以作為抗氧化劑或參與抗氧化酶的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。當(dāng)華蟾素注射液中的氨基酸進(jìn)入細(xì)胞后，可能通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，減輕ROS對(duì)線粒體的損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.3影響細(xì)胞周期的機(jī)制剖析本研究通過流式細(xì)胞術(shù)明確了華蟾素注射液能夠?qū)⑷烁伟〩epG-2細(xì)胞阻滯于S期，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。從分子機(jī)制角度深入探究，這一作用主要與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和酶的表達(dá)及活性改變密切相關(guān)。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的有序激活和相互作用。其中，CyclinA與CDK2形成的復(fù)合物在細(xì)胞周期的S期和G2/M期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在正常細(xì)胞增殖過程中，CyclinA和CDK2的表達(dá)和活性維持在一定水平，以確保細(xì)胞能夠順利完成DNA復(fù)制并進(jìn)入有絲分裂階段。然而，本研究結(jié)果顯示，隨著華蟾素注射液濃度的增加，CyclinA和CDK2的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這表明華蟾素注射液能夠抑制CyclinA和CDK2的表達(dá)，使得CyclinA-CDK2復(fù)合物的形成減少，進(jìn)而阻礙細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于S期。低濃度的華蟾素注射液可能就已經(jīng)開始干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，抑制CyclinA和CDK2的表達(dá)，隨著濃度的升高，這種抑制作用更加明顯。拓?fù)洚悩?gòu)酶TOPOI和TOPOII在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等過程中具有關(guān)鍵作用，它們參與維持DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和染色體的正常功能。在腫瘤細(xì)胞中，TOPOI和TOPOII的活性通常較高，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。本研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素注射液能夠顯著降低TOPOI和TOPOII的基因和蛋白表達(dá)水平。TOPOI和TOPOII表達(dá)的降低，會(huì)干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，使得腫瘤細(xì)胞無(wú)法獲取足夠的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)來(lái)支持其快速增殖。在S期，DNA復(fù)制需要TOPOI和TOPOII的參與來(lái)解開DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，保證復(fù)制的順利進(jìn)行。華蟾素注射液抑制TOPOI和TOPOII的表達(dá)，導(dǎo)致DNA復(fù)制過程受阻，大量細(xì)胞停滯在S期，無(wú)法正常進(jìn)入G2/M期。除了上述直接作用于細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和酶的機(jī)制外，華蟾素注射液還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)間接調(diào)控細(xì)胞周期。在細(xì)胞內(nèi)，存在著多種復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，這些通路相互交織，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。已有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白和CDK的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。華蟾素注射液可能通過抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，進(jìn)而抑制下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和酶的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯于S期。在MAPK信號(hào)通路中，華蟾素注射液可能抑制ERK的磷酸化，從而抑制其下游與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程。綜上所述，華蟾素注射液將人肝癌HepG-2細(xì)胞阻滯于S期，影響細(xì)胞周期進(jìn)程的機(jī)制是多方面的，主要通過抑制CyclinA和CDK2的表達(dá)，降低TOPOI和TOPOII的表達(dá)，以及干擾細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控，從而抑制細(xì)胞增殖。4.4研究結(jié)果的臨床意義和潛在應(yīng)用價(jià)值本研究結(jié)果具有重要的臨床意義和潛在應(yīng)用價(jià)值，為肝癌的臨床治療提供了新的思路和方法，有望改善肝癌患者的治療效果和預(yù)后。從臨床治療角度來(lái)看，華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖、凋亡及周期的顯著影響，為肝癌治療提供了新的藥物選擇。目前，肝癌的治療手段雖然多樣，但仍存在諸多局限性。手術(shù)切除和肝移植受多種因素限制，多數(shù)患者無(wú)法適用；化療和放療的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和治療依從性；分子靶向治療存在耐藥和高昂費(fèi)用等問題。華蟾素注射液作為一種中藥注射液，不良反應(yīng)相對(duì)較輕，患者耐受性較好。本研究表明其能夠有效抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。這意味著在臨床實(shí)踐中，華蟾素注射液可以單獨(dú)應(yīng)用于無(wú)法接受手術(shù)或?qū)?、放療不耐受的肝癌患者，為他們提供一種相對(duì)溫和且有效的治療選擇。華蟾素注射液也可與其他治療方法聯(lián)合使用，如與化療藥物聯(lián)合，可能增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤效果，同時(shí)減輕化療藥物的不良反應(yīng)。在一項(xiàng)臨床研究中，將華蟾素注射液與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于肝癌患者，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤緩解率明顯高于單藥治療組，且患者的生活質(zhì)量得到顯著改善，不良反應(yīng)發(fā)生率降低。這表明華蟾素注射液在肝癌臨床治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)楦伟┗颊邘?lái)更