二、高等植物基因(Yin)結構及表達調控1、真核基因組結構特征2、植物的基因組3、植物基因的結構4、植物基因的表達調控第一頁，共一百一十一頁。啟(Qi)動子上游調節(jié)區(qū)起點外顯子1外顯子2外顯子3RNA-5′DNA一個結構基因終點單順反子

①真核基因是單順反子（cistron），一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈。原核生物是多基因操縱子。1、真核細胞基因結構的特征例外：C.elegans有13500個基因，約25%是多順反子。第二頁，共一百一十一頁。啟(Qi)動子上游調節(jié)區(qū)起點基因1基因2基因3RNA-5′DNA三個結構基因終點多順反子大腸桿菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈，色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈第三頁，共一百一十一頁。真核生物rRNA基因結(Jie)構ETSITS不轉錄間隔18S5.8S28S45SrNA前體rRNA基因真核rRNA基因是多考貝（中度重復序列）；三種rRNA基因總是按18S、5.8S、28S順序排列；此基因簇是串聯(lián)重復的，簇與簇之間由不轉錄間隔分開；間期核中rDNA濃縮成核仁，在核仁中被轉錄、加工。18S5.8S28S第四頁，共一百一十一頁。核小(Xiao)體DNA核小體螺線管超螺線管染色單體

②真核基因組是以染色體（質）形式存在，小部分DNA是裸露的。第五頁，共一百一十一頁。DNA(基(Ji)因)mRNA編碼區(qū)尾部區(qū)起始密碼終止密碼extronintron前導區(qū)

③真核基因組中存在著重復序列。高度重復序列；中度重復序列；單一序列。

④真核基因屬于斷裂基因，編碼序列中存在有內含子。第六頁，共一百一十一頁。

⑤真核基因轉錄調控區(qū)很大，可遠離啟動子上千個堿基。

⑥真核基因的表達——轉錄和翻譯存在著時間(Jian)和空間(Jian)間(Jian)隔。

⑦真核基因表達的調控可從染色體結構至翻譯后加工多個層次（水平）上進行。第七頁，共一百一十一頁。原核(He)生物基因表達第八頁，共一百一十一頁。真核細胞基(Ji)因表達第九頁，共一百一十一頁。

2、植(Zhi)物的基因組基因（gene）？基因組（genome）？基因組學（genomics）？

遺傳物質單元，在染色體上占據(jù)特定位置、具有某種特定遺傳功能的DNA序列。編碼一個完整mRNA的一段DNA序列。第十頁，共一百一十一頁?；蛴袃蓚€(Ge)特點：一、忠實復制自己：以保持生物的基本特征；二、基因能夠突變：為自然選擇貯備了材料；

基因是遺傳的物質基礎，是DNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段?；蛲ㄟ^復制把遺傳信息傳遞給下一代，使后代出現(xiàn)與親代相似的性狀。突變絕大多數(shù)會導致疾病，另外的一小部分是非致病突變。非致病突變給自然選擇帶來了原始材料，使生物可以在自然選擇中被選擇出最適合自然的個體。第十一頁，共一百一十一頁。

基因可分為：

①結構基因：編碼蛋白質的基因。包括編碼酶和結構蛋白的基因；

②調節(jié)基因：編碼作用于結構基因的阻遏蛋白或激活蛋白的基因；

③沒有翻譯產(chǎn)物的基因：RNA基因，轉錄成(Cheng)為tRNA和rRNA基因；

④不轉錄的DNA區(qū)段：調控序列，如啟動子、操縱子、增強子等等。

（順式作用元件）基因的屬性：結構單位，功能單位，突變單位。第十二頁，共一百一十一頁。基因組：一個生物遺傳物質(Zhi)的總和。細胞中的全部DNA。植物的基因組：細胞核基因組+細胞質基因組葉綠體基因組+線粒體基因組基因組學：研究基因組的結構、功能和進化的科學。第十三頁，共一百一十一頁。

基因組研究包括兩方面的內容：以全基因組測(Ce)序為目標的結構基因組學（structuralgenomics）以基因功能鑒定為目標的功能基因組學（functionalgenomics)第十四頁，共一百一十一頁。

2.1植(Zhi)物基因組的復雜性

（3）植物基因組中重復序列變化極大;

擬南芥和一些多倍體植物中:20%;小麥、豌豆中，80%以上基因是重復序列；（1）植物除了細胞核基因組外，還有細胞質基因組；（2）植物基因組的長度差異是整個生物界最大的；

擬南芥單倍體基因組：6.3×107bp；百合單倍體基因組：1.0×1011bp；第十五頁，共一百一十一頁。物種堿基對數(shù)目/物理長度/cm（×108bp/細胞）擬南芥(Arabidopsisthaliana)1.253.8栽培稻(Oryzasativm)4.313.1普通小麥(TriticumAestivum)160493一粒小麥(Triticum

Monococcum)57173玉米(Zeamays)2370貝母（Fritillariaassyriaca）10003039人類(Hemosapiens)31102大腸桿菌(E.coli)0.0420.14玉米葉綠體0.00160.006玉米線粒體0.00570.02一些物種(Zhong)細胞核基因組(二倍體)大小第十六頁，共一百一十一頁。

基因組的復雜性是指基因組中不同序列的總(Zong)和，用DNA變性和復性實驗檢測；可用參數(shù)：Co

t1/2表示；Co：復性時相同（單鏈）DNA的濃度；t：復性的時間

Co

t1/2：一半DNA復原成雙鏈所用的時間；基因組越復雜，Co

t1/2

值越大。

基因組的序列可分為單一序列（singlecopysequence）和重復序列（repetitivesequence）第十七頁，共一百一十一頁。植物基(Ji)因組中的重復序列：高度重復序列：重復幾百萬次，一般是少于10bp的片段；

中度重復序列：幾十到上千次，約300~500bp相近順序；

單一序列：在基因組中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次的序列。串聯(lián)重復序列（tandemlyrepeatedsequences）：重復序列以各自的核心序列（重復單元）首尾相連多次重復，重復序列間被間隔序列分開。散布重復序列（dispersedRepeatedSequence）：主要是一些可移位的遺傳因子：轉座子和逆轉錄轉座子。第十八頁，共一百一十一頁。rRNA基(Ji)因：ETSITS不轉錄間隔18S5.8S28S45SrNA前體rRNA基因串聯(lián)重復，簇之間由不轉錄間隔分開；18S5.8S28S衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）：動物的衛(wèi)星DNA富含AT；植物衛(wèi)星DNA富含GC；端粒重復序列：真核生物間高度保守；人和椎蟲：TTAGGG；擬南芥和小麥：TTTAGGG第十九頁，共一百一十一頁。葉綠體(Ti)基因組（chloroplastgenome）：

多數(shù)被子植物cpDNA在120~160kb之間；含有87~183個已知基因；煙草86684253391848225339LSCSSCIRAIRBrRNArRNA

4rRNA基因、30tRNA基因、4RNA聚合酶基因、21核糖體蛋白質基因、31光合作用相關基因、40其它蛋白質基因。擬南芥84170262641778026264第二十頁，共一百一十一頁。植物長度/bpP基因數(shù)R基因數(shù)GenBank編號擬南芥1544788845NC-000932煙C-001897月見草16395311846NC-002693水C-001320菠C-002202小麥1345458450NC-002762玉C-001666已知DNA序(Xu)列的植物質體基因組

cpDNA存在于“類核體（nucleoid）”中，葉綠體中可有10~20個類核體（每個可有2~20個DNA分子）。第二十一頁，共一百一十一頁。線(Xian)粒體基因組（mitochondrialgenome）

植物mtDNA長度變異很大，195~2600kb；動物mtDNA為15~18kb；真菌在18~78kb；基因組的大小并不表示基因數(shù)量的多少：

擬南芥mtDNA376kb，人mtDNA為16.6kb，前者比后者RNA基因多1個，蛋白質基因27:13。在同一細胞中可有不同長度的mtDNA。第二十二頁，共一百一十一頁。

mtDNA有分子內、分子間重組，也可與核、葉綠體基因組DNA重組。因此mtDNA的重排、序列加倍、與外源DNA整合的幾率很(Hen)高，由此產(chǎn)生新的嵌合基因。細胞質雄性不育就是由于新的嵌合基因導致的。

植物細胞內的三類基因組存在著廣泛的相互作用。葉綠體和線粒體的結構蛋白多數(shù)由核基因組編碼：細胞器基因轉移至核基因組；

也有基因從核基因組轉移至細胞器基因組:核糖體L23蛋白質基因。第二十三頁，共一百一十一頁。

葉綠體、線粒(Li)起源：馬古利斯的內共生理論

分子生物學證據(jù)：1、線粒體和葉綠體僅能來自已有的線粒體和葉綠體；2、基因組結構與原核生物相似；3、有自已的蛋白質合成體系，且與原核生物相似；4、能抑制細菌RNA聚合酶的抗生素也能 抑制線粒體和葉綠體RNA聚合酶。5、葉綠體基因結構中有象細菌那的啟動子、操縱子結構。第二十四頁，共一百一十一頁。

2.2基(Ji)因組學簡介

1995，第一個細胞生物，流感嗜血菌基因組1.8Mb測序完成；1996，第一個真核生物，啤酒酵母基因組12Mb測序完成；1998，第一個動物，美麗線蟲基因組（97Mb）測序完成；2000，第一個昆蟲，果蠅基因組（120Mb）測序完成；2000，第一個植物，擬南芥基因組（125Mb）測序完成；2001，第一個哺乳動物，人的基因組（3100Mb）測序完成；2002，第一個重要作物，水稻基因組（430Mb）測序完成；599病毒，205種自然質粒，185種細胞質基因組，31種細菌；第二十五頁，共一百一十一頁。擬南芥：十(Shi)字花科，擬南芥屬；基因組較簡單：染色體n=5核基因組=1億bp。生命周期短，種子產(chǎn)量大：一代的時間為3～5周單株可產(chǎn)無數(shù)粒種子；之稱為植物中的“果蠅”模式植物

基因組分析中包含的內容較多，主要分為三個緊密相連的部分，即作圖、通過突變體研究基因功能和基因克隆及測序。

第二十六頁，共一百一十一頁。突變體的研究擬南芥基因組研究的目標之一，是利用基因突變的方法研究基因功能?；蛲蛔兊姆椒òɑ瘜W誘變，放(Fang)射性照射，T-DNA或轉座子插入等。若按擬南芥菜的基因組中有25000個單拷貝的轉錄單位來算，現(xiàn)在已鑒定了的基因位點約為這些轉錄單位的六分之一。通過對胚胎及幼苗致死突變體的研究，發(fā)現(xiàn)大約有4000多個基因位點與胚胎及幼苗致死有關；對葉綠素缺陷型植物的研究又鑒定了500多個新的基因位點。第二十七頁，共一百一十一頁。

基因組學研究的具體內容有：（1）建立以互聯(lián)網(wǎng)為平臺的數(shù)據(jù)庫；（2）組建基因組的物理圖譜和遺傳圖譜；（3）確定基因及基因組的序列；（4）分析(Xi)基因組的結構特點；（5）鑒定基因組中所有基因，并確定其功能；（6）建立基因表達數(shù)據(jù)庫；（7）建立基因及表型之間的關系（功能基因組學）；（8）確定DNA的復雜性；（9）為比較不同生物的基因組提供資料；第二十八頁，共一百一十一頁。

世(Shi)界上有三大基因序列數(shù)據(jù)庫：美國“國家生物技術信息中心”（NCBI）主持的GeneBank：

“歐洲生物信息學研究所”(EBI)主持的EMBL數(shù)據(jù)庫；

日本“國家遺傳學研究所”(NIG)主持的日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ)

第二十九頁，共一百一十一頁?；?Yin)的命名：

植物基因命名委員會：

CommissiononPlantGeneNomenclature，CPGN

根據(jù)基因序列，把植物基因分成不同的家族；CPGN規(guī)定：基因符號最多8個：

XyzN，核基因組基因；

xyzN，細胞質基因組基因第三十頁，共一百一十一頁。

根據(jù)突變型的表型命名：基因(Yin)名稱與正常功能相反；

矮化基因——高生長基因

基因符號用三個斜體字母表示，基因產(chǎn)物用正體大寫：

突變型基因用小寫：abc野生型基因用大寫：ABCABC是該基因的產(chǎn)物

Abc+指ABC基因的表型（野生型）；

Abc-指abc基因的表型（突變型）；

ABC1和ABC2是不同的基因；abc4-1和

abc4-2為相同基因的不同等位基因；第三十一頁，共一百一十一頁。

3植物基因(Yin)的結構某種生物全部基因的克隆總體——基因組文庫

克隆植物中編碼蛋白質基因的方法：

①根據(jù)蛋白質測序結果，合成一段寡聚探針，從該植物的基因組文庫與cDNA(complementaryDNA)文庫中分別釣出編碼該蛋白質的基因與cDNA克隆。第三十二頁，共一百一十一頁?？寺∨c基因(Yin)組文庫的構建第三十三頁，共一百一十一頁。文庫的構(Gou)建cDNA第三十四頁，共一百一十一頁。

探針是(Shi)一段與目的基因有互補序列的用放射性同位素（32P）標記的DNA或RNA分子。利用“探針”分子釣取目的基因

構建基因文庫的目的主要是為了直接從基因組中分離目的基因，有了基因文庫后，目的基因的制備可以理解為從基因文庫中“釣出”目的基因。

兩條來源不同的具有一定同源性（即具有堿基互補關系）的DNA單鏈分子或DNA單鏈與RNA分子經(jīng)退火形成雙鏈DNA分子或DNA-RNA異質雙鏈分子的過程稱為核酸分子雜交。第三十五頁，共一百一十一頁。核酸(Suan)分子雜交電泳分離轉膜探針雜交放射顯影第三十六頁，共一百一十一頁。核酸(Suan)分子雜交操作程序第三十七頁，共一百一十一頁。第三十八頁，共一百一十一頁。

②根據(jù)蛋白質測序結果，合成一對或數(shù)對PCR引(Yin)物，以植物總DNA為模板，擴增出目標基因片段。

以此片段為探針，從基因組文庫與cDNA文庫中分別釣出編碼該蛋白質的基因與cDNA克隆。第三十九頁，共一百一十一頁。

③基因產(chǎn)物不明，但知道(Dao)基因突變后的表型，可用轉座子標簽法分離基因。

×顯性純合子隱性純合子

雜合子顯性表型

雜合子突變表型隱性突變株正常未突變株基因組文庫I基因組文庫II轉座子探針帶轉座子DNA片段完整目的基因亞克隆探針第四十頁，共一百一十一頁。

④利用RFLP圖譜(Pu)，找出與所要克隆基因緊密連鎖的分子標記，用染色體步行法找到所要克隆的基因。

AB已知基因未知基因步行探針間隔100Kb第四十一頁，共一百一十一頁。

⑥核DNA減法克隆。利用缺失突變體與同源親本1~2DNA片段的差異克隆目(Mu)的基因。

⑤如果該基因受某種因素誘導表達，可用mRNA差異顯示法找到所要克隆的基因。第四十二頁，共一百一十一頁。

克(Ke)隆到基因與cDNA后，測序，對比基因全序列與cDNA序列，了解基因結構：如轉錄起始位點，內含子數(shù)量、位置及長度，終止密碼與加尾信號的位置等。通過對比研究，表明植物基因結構與其它真核基因結構相似，主要由4個結構區(qū)域組成。

5’上游區(qū)、5’非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、3’非翻譯區(qū)第四十三頁，共一百一十一頁。5’上游(You)區(qū)5’非翻譯區(qū)編碼區(qū)3’非翻譯區(qū)高等植物基因結構增強子啟動子CAATTATACapATG信號肽內含子AATAAA外顯子1外顯子2多聚腺苷酸終止序列+1第四十四頁，共一百一十一頁。

3.15’上(Shang)游區(qū):

轉錄起點5’端上游一段很長的區(qū)域，包含啟動子在內的與基因表達起始和表達調控有關的許多元件。

NNNNNNCTCATCANNN+1+7

8該區(qū)域結構特點是：①基因啟動區(qū)序列中，在轉錄起點附近有一一致序列（consensussequence）：CTCATCA，其中的一個A為轉錄起始核苷酸，此A編為+1，轉錄本中為正數(shù)，此A的上游用負數(shù)表示。第四十五頁，共一百一十一頁。

在–75附近處常有GC（T/C）CAATCT一致序列，簡(Jian)稱CAATbox，確定RNA聚合酶結合部位，具有增強基因轉錄的作用。

②在上游–327有一段TCACTATATAG一致順序：簡稱：TATAbox。

該序列是RNA聚合酶II準確起始轉錄所必需的。增強子啟動子CAATTATACapATG信號肽內含子AATAAA外顯子1外顯子2多聚腺苷酸終止序列第四十六頁，共一百一十一頁。

③在5’遠上游區(qū)，存在對基因表達有增強或抑制作用、決(Jue)定基因表達特定時空順序以及對激素和外界脅迫起應答作用的序列——順式作用元件（cis-actingelement）

轉錄起點到CAATbox附近這一區(qū)段稱為啟動子。

GCbox：–110附近的GGGCGG保守序列，確定RNA聚合酶結合部位。第四十七頁，共一百一十一頁。

3.25’非(Fei)翻譯區(qū):5’非翻譯區(qū)增強子啟動子CAATTATACapATG信號肽內含子AATAAA外顯子1外顯子2多聚腺苷酸終止序列

轉錄起點到翻譯起始密碼子之間的序列。該序列5’端是前體mRNA加帽位點。第四十八頁，共一百一十一頁。

3.3編碼(Ma)區(qū):

起始密碼到終止密碼之間的序列。有時專指外顯子（extron）部分。

①多數(shù)植物基因轉錄本5’有一個起始密碼AUG，少數(shù)植物5’有4個AUG，但真正起始密碼是第四個。

翻譯起點的共有序列：植物：C（G）AANNATGG動物：A（G）----NNATGG

第四十九頁，共一百一十一頁。轉(Zhuan)錄的基本原則——堿基互補：A=TG=CA=U第五十頁，共一百一十一頁。

也稱“GT-AG法(Fa)則”

③編碼區(qū)中常有數(shù)目不等的內含子（intron）。外顯子與內含子交界處共有序列是：外顯子···AG

GTAAGT

···內含子···

TCNAG

G···外顯子

②外顯子中4種堿基比例：

單子葉植物：AT含量43%；雙子葉植物：AT含量54%；CapATG信號肽內含子AATAAA外顯子1外顯子2多聚腺苷酸AGGTAAGTNCAGG第五十一頁，共一百一十一頁。

內含子共有4種，具有核酶性質：

I類內含子：主要存(Cun)在于rRNA和質體tRNA基因中，中間部分高度保守；II類內含子：主要存在于線粒體和質體mRNA基因中，拼接點的序列高度保守；III類內含子：主要存在于核mRNA基因中；IV類內含子：存在于核tRNA基因中；第五十二頁，共一百一十一頁。

3.43’非(Fei)翻譯區(qū):3’末端有轉錄本mRNA的加尾信號：AATAAAA98A86T98A98A95A96

終止密碼后的序列，也有一些調控序列，對mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率起調節(jié)作用。

3種終止密碼使用的頻率為：

單子葉植物：TGA46%，TAA28%，TAG26%雙子葉植物：TAA46%，TGA36%，TAG18%第五十三頁，共一百一十一頁。前(Qian)導區(qū)編碼區(qū)尾部區(qū)DNA+1起始密碼終止密碼信號肽序列加尾信號mRNA5’端帽子結構m7G5’PPP5’NP3’端polyA尾巴20~200base真核細胞mRNA的結構第五十四頁，共一百一十一頁。

4植物基因的表達調(Diao)控

真核基因表達調控的顯著特征是：

能在特定時間、特定空間的細胞中激活特定基因，從而實現(xiàn)“預定”的、有序的、不可逆的分化、發(fā)育過程;

并使生物的組織、器官在一定的環(huán)境條件范圍內保持正常功能。

第五十五頁，共一百一十一頁。大腸(Chang)桿菌乳糖操縱子結構

根據(jù)調控的性質可分：

①瞬間調控——可逆調控。相當于原核細胞對環(huán)境條件變化做出的反應。包括某種底物或激素水平升降時，對細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調節(jié)。第五十六頁，共一百一十一頁。

②生長發(fā)育調控——不可逆調控。真核基(Ji)因調控的精髓部分，基(Ji)因按“預定”的時、空順序表達，從而實現(xiàn)生長、分化、發(fā)育的全過程。

在植物的生命周期中，基因表達具有時空專一性（生長發(fā)育進程專一性和細胞、組織、器官特異性），同時受環(huán)境因素的影響。持家基因（管家基因）；時、空專一性表達基因；環(huán)境因素誘導表達基因；第五十七頁，共一百一十一頁。持家基因表達水平受環(huán)境因素影響較小，在個體各個生長階段幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小，因此常存(Cun)在于生物細胞核的常染色質中。

持家基因(house-keepinggenes)：又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的。持家基因是一類始終保持著低水平甲基化并且一直處于活性轉錄狀態(tài)的基因。第五十八頁，共一百一十一頁。

持家基因的表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調節(jié)。在組成型啟動子調控下，不同組織器官(Guan)和發(fā)育階段的基因表達沒有明顯差異。目前使用最廣泛的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、來自根癌農(nóng)桿菌Ti質粒T-DNA區(qū)域的冠癭堿合成酶基因啟動子（Nos、Ocs啟動子），后者雖來自細菌，但具有植物啟動子的特性。第五十九頁，共一百一十一頁。

由于組成型啟動子驅動的基因在各組織中均有一定程度表達，應用中存在一定問題。如外源基因在整株植物中表達，產(chǎn)生大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內積累，打破植物原有代謝平衡(Heng)，有些產(chǎn)物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡。另外，重復使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。因此，人們尋找更為有效的組織、器官特異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調控植物基因表達。第六十頁，共一百一十一頁。時、空專一性表達基因：

這類基因的表達往往只限于生長發(fā)育的特定時期，以及某些特定的器(Qi)官組織中，并表現(xiàn)出生長發(fā)育的調節(jié)特性?；蚪M織特異性表達通常是以組織細胞的結構和化學、物理信號為基礎，通過組織特異性啟動子活動實現(xiàn)的。組織特異性啟動子能使目的基因的表達產(chǎn)物在一定器官或組織積累，執(zhí)行特定的功能，同時避免了植物營養(yǎng)的不必要浪費。作為植物基因工程最有前景的調控元件，組織特異性啟動子成為近年研究的熱點。第六十一頁，共一百一十一頁。環(huán)境因素誘導表達基因：在長期適應和進化過(Guo)程中，植物形成了感知環(huán)境并能做出適應性反應的特性。主要是通過(Guo)啟動不同基因的表達可在一定范圍內適應光、溫、水等環(huán)境的變化。環(huán)境因素誘導表達基因是在某些特定的物理或化學信號的刺激下，通過誘導型啟動子活動實現(xiàn)的。天然誘導型啟動子包括光、溫度、激素應答啟動子等。目前已經(jīng)分離了光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。

第六十二頁，共一百一十一頁。確(Que)定某種基因在何種組織專一表達的方法：

①以基因編碼區(qū)中一段序列為探針，從不同組織或器官中提取總mRNA，進行Northern雜交。

Northern雜交技術用于檢測特異性mRNA的存在。mRNA樣品經(jīng)電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，與DNA探針進行雜交，即可檢測特異性mRNA分子在樣品中存在與否，量的多少。第六十三頁，共一百一十一頁。

限制性酶切

電泳

同位素探針雜交

放射自顯影

轉膜mRNA

第六十四頁，共一百一十一頁。mRNA電(Dian)泳DNAprobe

轉膜

Northern雜交技術廣泛用于研究特異性mRNA分子在細胞處于不同條件下發(fā)生量和質的變化，或不同組織器官中基因表達的差異。第六十五頁，共一百一十一頁。

②Northern原(Yuan)位雜交

指在細胞、組織切片上直接進行分子雜交，通過檢測細胞內特異mRNA的存在與否來了解哪些細胞中有特異基因的表達。

整個過程包括材料的預處理、細胞固定、細胞的DNase酶解（降解DNA，減少非特異性雜交）雜交、檢出。第六十六頁，共一百一十一頁。

③將待測基因的啟動子序列與一報告基因的編碼區(qū)及3’端終止區(qū)連接，建成融合基因，經(jīng)轉化植物細胞得到再生植株后(Hou)，檢測報告基因在何種組織與細胞中表達。常用的報告基因有：GUS基因、Nos、Ocs基因等。

葡萄糖苷酸酶；X-Glucuionicacid（5-bromo-4-chloro-3-indoyl—glucuronicacid）第六十七頁，共一百一十一頁。GFP蕎麥細胞色素(Su)的可溶區(qū)段（紅色）第六十八頁，共一百一十一頁。

④用基因編碼的(De)蛋白質制備出抗體，對植物不同組織切片進行免疫原位雜交。（

Western蛋白質雜交技術)第六十九頁，共一百一十一頁。4.1器官、組織專一性表(Biao)達的基因②HRGP基因：

編碼富含羥脯氨酸糖蛋白(Hydroxyproline-richglycoproteinHRGP)，主要在莖柵狀細胞、表皮細胞中表達。①rbcS基因：

編碼Rubisco小亞基，在葉肉細胞、保衛(wèi)細胞、中脈與綠色組織細胞中表達。

第七十頁，共一百一十一頁。

③P2基因：編碼一種參與花粉管萌發(fā)生長的(De)蛋白質，只在雄蕊成熟花粉與花粉管中表達。

④PAL2基因：編碼PAL，參與花色素形成，只在花瓣中表達。

⑤Gy4基因：

編碼大豆貯藏蛋白，只在胚乳組織中表達。

⑥

Amyl基因：

編碼-淀粉酶，種子萌發(fā)時，在糊粉層表達。第七十一頁，共一百一十一頁。4.2受環(huán)境影響而表達(Da)的基因①HSP基因：

編碼80~90、65~75、15~30kD幾種熱激蛋白。熱脅迫時，HSF單體在核內組裝成三聚體，與DNA的HSE（熱激元件）結合，刺激HSP-mRNA轉錄，翻譯成HSP。HSP參與生物體內新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復性和降解。

HSP功能：維持變性蛋白質的可溶性，使變性蛋白重新折疊成有活性的構象，提高蛋白質（酶）熱穩(wěn)定性。第七十二頁，共一百一十一頁。熱激(Ji)因子（HSF）循環(huán)激(Ji)發(fā)熱激(Ji)蛋白（HSP）mRNA的合成第七十三頁，共一百一十一頁。雙(Shuang)子葉：20單子葉：11低溫誘導基因低溫超量表達基因；不包括低量、瞬時表達基因。同工蛋白（isoform）抗凍蛋白（antifreezeproteinAFP）類脂轉移蛋白（lipidtransferproteinLTP）胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）②低溫誘導基因：

植物經(jīng)低溫誘導能使某些特定的基因活化，表達合成一組新蛋白(Coldacclimationprotein)。

第七十四頁，共一百一十一頁。

低溫誘導基(Ji)因品種基因編碼蛋白其他逆境擬南芥

cor

6.6AFP干旱，ABAcor

78NK干旱

cor47D-11LEA干旱，ABAlti

30D-11LEA干旱，ABA油菜

rab18D-11LEA干旱，ABA

Bn115NK

Bn

28AFP大麥

blt4LTP干旱，ABA

blt63EF-laNK

HVA1D-7LEAABA小麥cor39D-11LEA干旱，ABAWcor410D-11LEA干旱，ABA第七十五頁，共一百一十一頁。

擬南芥中的冷調節(jié)蛋白COR6.6、油菜的BN28蛋白與魚類抗凍蛋白有同源性，體外實驗表明冷調節(jié)蛋白能減少凍融過程對類囊(Nang)體膜傷害。擬南芥葉綠體的CORl5蛋白在體外能有效地防止乳酸脫氫酶因冰凍而失活，其效率較蔗糖高出106倍，較其它蛋白高102倍～103倍。

抗凍蛋白（AFP）:

一種能降低細胞間隙體液冰點的糖蛋白。第七十六頁，共一百一十一頁。

③水分逆境誘導(Dao)的基因：

水分脅迫會誘導一些特定的基因表達，合成新蛋白質——水分脅迫蛋白(waterstressprotein)。這類蛋白質多數(shù)是高度親水的，能增強原生質的水合度，起到抗脫水的作用。

水分脅迫蛋白的功能可能還包括對膜結構的保護、恢復一些蛋白質的活性和形成特定的水、離子通道(如水孔蛋白)，改變或調節(jié)液泡和細胞質中的ψs等。第七十七頁，共一百一十一頁。

⑤病菌感染誘導的基因：

病原物侵(Qin)染能刺激植物致病相關基因表達，合成與正常組織不同的新蛋白，稱為“病程相關蛋白”（PR）。幾丁質酶基因、葡聚糖酶基因、PAL基因、CHS基因等。

④創(chuàng)傷誘導的基因：

植物受傷后一些基因往往被誘導表達，如土豆中的蛋白酶抑制劑II基因，其表達產(chǎn)物抑制多種微生物和昆蟲蛋白酶活性。第七十八頁，共一百一十一頁。4.3植物基(Ji)因表達調控機理

（1）調控的特點（方式）：染色質水平的調控；以正調節(jié)為主，具有多個調控序列；調控區(qū)很大，遠離啟動子幾百至上千個bp；存在多種轉錄后的調控機制；具有細胞特異性或組織特異性表達；第七十九頁，共一百一十一頁。第八十頁，共一百一十一頁。（2）順式作用元件(Jian)與基因表達調控

植物基因的調控主要在轉錄水平上進行，受特定順式作用元件（cis-actingelement）和反式作用因子（trans-actingfactor）影響。

基因轉錄所需的順式作用元件主要是：啟動子（promoter）和增強子（enhancer）；第八十一頁，共一百一十一頁。啟動(Dong)子：

核心啟動子(corepromoter)：

是決定轉錄起始位置的關鍵序列，也是普通轉錄因子TFⅡD的結合位點。①TATAbox：位于轉錄起始點上游

25～

30bp。②起始子(initiator，Inr)：是與轉錄起始位點重疊的短的較保守序列．

與基因轉錄啟動有關的一組DNA序列，位于轉錄起始點上游

100~

200bp以內，其功能是決定轉錄的起始位點和調控轉錄頻率。第八十二頁，共一百一十一頁。上游啟動子元件：（UpstreamPromoterelement，UPE）位于較上游(

30~

110bp)，能較強影響轉錄起始的頻率，如(Ru)CAATbox和GCbox。其中GC盒是轉錄因子SPl的結合位點。

組成型啟動子(constitutivepromoter)：是指在該類啟動子控制下，結構基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達水平?jīng)]有明顯差異?；ㄒ嘶ㄈ~病毒（CaMV）35S啟動子；胭脂堿合成酶基因Nos啟動子（具有植物啟動子特性）啟動子的分類：第八十三頁，共一百一十一頁。

組織特異啟動子(tissue-specificpromoter)：又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部(Bu)位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調節(jié)的特性。

例如煙草的花粉絨氈層細胞中特異表達基因啟動子TA29，豌豆的豆清蛋白（leguimin）基因啟動子可在轉化植物種子中特異性表達，馬鈴薯塊莖儲藏蛋白（patatin）基因啟動子在塊莖中優(yōu)勢表達。

第八十四頁，共一百一十一頁。

根特異啟動子：根特異表達系統(tǒng)可用于研究轉基因植物的高滲脅迫耐受、植物修復和根際(Ji)分泌等問題。

莖特異啟動子：莖中特異表達基因的啟動子，不僅可從分子水平了解莖的發(fā)生、分化過程，更重要的是利用這些啟動子調節(jié)植物代謝可滿足人類需求，如人們對木質素生物合成及其調控的研究。葉特異啟動子：花特異啟動子：果實、種子特異性啟動子：第八十五頁，共一百一十一頁。

誘導型啟動子(induciblepromoter)：是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以(Yi)大幅度地提高基因的轉錄水平。如、熱、創(chuàng)傷、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。

天然誘導型啟動子

包括光、溫度、激素應答啟動子等。在進化過程中，植物通過啟動不同基因的表達可在一定范圍內適應光、溫、水等環(huán)境的變化。利用這些環(huán)境應答基因的啟動子與抗逆基因融合，從而使轉基因植物更好地適應逆境。第八十六頁，共一百一十一頁。人工構建的誘導型啟動子(Zi)

目前研究最多的是化學誘導表達系統(tǒng)。一個理想的化學誘導表達系統(tǒng)應具備以下特點：（1）外源基因在植物體自身不表達或低水平表達，當添加誘導物后，高效誘導基因表達；（2）誘導物需要有較強的專一性；（3）誘導物可快速啟動基因表達的“開”與“關”；而且誘導物對植物無毒或低毒。第八十七頁，共一百一十一頁。①增強效應十分明顯；可使基因轉錄頻率增加10~100倍，有的可達上(Shang)千倍；

②增強效應與其位置和取向無關；

增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離起作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增強子的作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。

增強子（enhancer）：

能顯著提高基因轉錄效率的一類順式調控元件（其核心序列常為8~12bp)，其作用特點：

第八十八頁，共一百一十一頁。

③增強子沒有(You)基因專一性；

增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現(xiàn)活性。但增強子對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。

當增強子移位時，能提高新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。

第八十九頁，共一百一十一頁。

第九十頁，共一百一十一頁。

④增強效應有組織和細胞專一性；

增強子必須與特定的蛋(Dan)白質因子結合后才能發(fā)揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細胞或組織中具有特異性蛋(Dan)白質因子所決定的。

⑤許多增強子還受外部信號的調控；

如熱激蛋白基因的表達。金屬硫蛋白基因上游增強子能對環(huán)境中的鋅濃度做出反應。第九十一頁，共一百一十一頁。應答元件(responsiveelements)

真核細胞中對某些特定的環(huán)境作出應答的基因(Yin)，常具有相同的順式元件—應答元件。RNAPolⅡ的誘導型轉錄因(Yin)子結合部位。沉寂子(silencer)：負調控元件——是能抑制基因表達的序列，使基因沉默。第九十二頁，共一百一十一頁。（3）反式作用因子與(Yu)基因調控反式作用因子(trans-actingfactor)

是通過識別和結合順式調控元件的核心序列而調控靶基因轉