(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN120114562A(71)申請人常州大學(xué)地址213164江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)滈湖中路21號申請人張露露(72)發(fā)明人張露露周曉鷹A61K38/06(2006.01)(54)發(fā)明名稱谷胱甘肽在減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用中的應(yīng)用本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了谷胱甘肽在減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用中的應(yīng)用。本發(fā)明將谷胱甘肽和特瑞普利單抗聯(lián)合對大鼠淋巴細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與未干預(yù)相比，單獨(dú)使用特瑞普利單抗降低大鼠淋巴細(xì)胞活力、減少細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量和阻滯細(xì)胞周期，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗可緩解特瑞普利單抗對大鼠淋巴細(xì)胞的抑制作用。本發(fā)明提供一種減輕PD-1單抗特瑞普利毒副作用的方法，谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利可應(yīng)用于臨床以緩解PD-1單抗特瑞普利在治療中出現(xiàn)的免疫相關(guān)的副作用。本發(fā)明為改善PD-1單21.谷胱甘肽在減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述谷胱甘肽濃度為10mM,PD-1單抗特瑞普利濃3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用是指減緩特瑞普利單抗對大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的抑制作用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述PD-1單抗特瑞普利可降低大鼠淋巴細(xì)胞活力、減少細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量和阻滯細(xì)胞周期。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利可恢復(fù)大鼠淋巴細(xì)胞活力、增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量和促進(jìn)細(xì)胞增殖。6.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的應(yīng)用，其中，本發(fā)明提供一種減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用的方法，谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利可應(yīng)用于臨床以緩解PD-1單抗特瑞普利在治療中出現(xiàn)的免疫相關(guān)的副作用。3谷胱甘肽在減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及谷胱甘肽在減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用中的應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]隨著對腫瘤免疫研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞不被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別和殺傷，腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著非常重要的角色。機(jī)體免疫細(xì)胞的激活或抑制是通過正性信號和負(fù)性信號來調(diào)節(jié)，其中程序性死亡分子1(programmeddeath1,PD-1)和PD-1配體(PD-1ligand,PD-L1)便是負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號，抑制了腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的免疫活性，介導(dǎo)了免疫逃逸。CD8+T細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過分泌細(xì)胞因子等方式調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。[0003]目前，PD-1PD-L1抗體可以通過阻斷負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號，逆轉(zhuǎn)腫瘤逃逸而殺傷腫瘤。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在識別和殺傷腫瘤細(xì)胞中起著重要的作用，T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)與腫瘤細(xì)胞表面的帶有特異性抗原的主要組織相容性復(fù)合體(major到一系列免疫檢查點(diǎn)的控制，其中有共刺激信號和共抑制信號，可以使T細(xì)胞激活或抑制。其中PD-1和其配體PD-L1通路是抑制性免疫檢查點(diǎn)，它們結(jié)合傳達(dá)共抑制性信號，可以使T細(xì)胞的免疫活性受到抑制，在免疫耐受中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要原因。[0004]特瑞普利單抗(Toripalimab)是我國首個(gè)自主研發(fā)并上市的抗程序性細(xì)胞死亡受體1(Programmedcelldeathpro巴細(xì)胞的PD-1,阻斷其與腫瘤細(xì)胞表面程序性死亡配體(PD-L1)結(jié)合，解除腫瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞的免疫抑制，使免疫細(xì)胞重新發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞免疫作用而殺傷腫瘤細(xì)胞。但是增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)，也異常增強(qiáng)自身正常的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出自身免疫樣的炎癥反應(yīng)，稱為免疫相關(guān)不良反應(yīng)。2023年10月，特瑞普利單抗的生物制品許可申請，獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，用于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性鼻咽癌含鉑治療后的二線及以上治療，皮膚等均可引起患者發(fā)生不同程度的免疫相關(guān)不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)超進(jìn)展疾病情況。國內(nèi)外已有關(guān)于特瑞普利單抗可能引發(fā)心臟、內(nèi)分泌系統(tǒng)及皮膚等多個(gè)系統(tǒng)或器官不良反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道。因此，減緩特瑞普利單抗以及其他PD-1單抗的毒副作用，已成為臨床面臨的重大難題。[0005]谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，具有抗氧化和解毒作用，存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物和許多單核細(xì)胞中。谷4胱甘肽存在兩種形式，還原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽是一種必需的非酶抗氧化劑，在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以毫摩爾濃度(1-10mM)存在。谷胱甘肽通過保護(hù)細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，維持細(xì)胞膜完整性，防止血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，維持正常運(yùn)輸氧的能力。谷胱甘肽的代謝與許多疾病有關(guān)，尤其是惡性腫瘤的進(jìn)展。谷胱甘肽可以直接作為抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞免受自由基和促氧化劑的侵害，并作為抗氧化和解毒酶的輔助因子。谷胱甘肽還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等途徑，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。發(fā)明內(nèi)容[0006]本申請發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)研究表明，單獨(dú)使用PD-1單抗特瑞普利會抑制大鼠淋巴細(xì)胞活力、減少細(xì)胞內(nèi)GSH含量和阻滯細(xì)胞周期，與其相比，谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利可以恢復(fù)大鼠淋巴細(xì)胞活力、增加細(xì)胞內(nèi)GSH含量和促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示谷胱甘肽具有減緩PD-1單抗特瑞普利毒副作用的功能。[0007]本發(fā)明以新鮮提取的大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓淋巴細(xì)胞為研究對象，將谷胱甘肽和特瑞普利單抗聯(lián)合進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利能夠減緩PD-1單抗特瑞普利對骨髓細(xì)胞(中樞免疫系統(tǒng))和脾淋巴細(xì)胞(外周免疫系統(tǒng))的抑制作用。[0008]因此，本發(fā)明提供一種減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用的方法，谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利可應(yīng)用于臨床以緩解PD-1單抗特瑞普利治療中出現(xiàn)的免疫相關(guān)的副作用。[0009]在實(shí)施方式中，所述減緩PD-1單抗特瑞普利引起的細(xì)胞毒副作用是指減緩特瑞普利單抗對大鼠淋巴細(xì)胞的抑制作用。[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明結(jié)果表明谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利能夠減緩PD-1單抗特瑞普利對大鼠外周免疫系統(tǒng)和中樞免疫系統(tǒng)的抑制作用，因此，本發(fā)明為改善PD-1單抗的療效提供了新方法和思路，本發(fā)明將谷胱甘肽與腫瘤免疫治療結(jié)合，對緩解臨床存在的嚴(yán)重的免疫相關(guān)副作用和確保藥物使用的安全性提出有效的建議，為谷胱甘肽的臨床應(yīng)用拓展了新思路。附圖說明[0011]圖1展示了藥物干預(yù)大鼠淋巴細(xì)胞24h后MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖1A是大鼠脾淋巴細(xì)胞MTT[0012]圖2展示了藥物干預(yù)大鼠淋巴細(xì)胞24h后細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖2A是大鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從左至右分別代表：(A-a)Untreated,(A-b)4mg/m,(A-d)GSH+4mg/mL,(A-e)GSH+40mg/mL;圖2B是大鼠骨髓細(xì)胞細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從左[0013]圖3展示了藥物干預(yù)大鼠淋巴細(xì)胞24h后細(xì)胞內(nèi)GSH含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖3A是大鼠脾5具體實(shí)施方式[0017]大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的提取與培養(yǎng)。[0018]將大鼠脫頸處死后，取大鼠脾臟和骨髓，在無菌條件下用細(xì)胞篩網(wǎng)篩取細(xì)胞，用Tris-NH?Cl紅細(xì)胞裂解液處理，離心。用含4%青霉素-鏈霉素PBS洗滌細(xì)胞，在含有10%胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過夜，以去除貼壁細(xì)胞獲得較純的淋巴細(xì)胞。[0022]將正常大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分別接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定30min。加藥干預(yù)，藥物干預(yù)條件設(shè)置為無血清條件下：未干預(yù)(Untreated),特瑞普利單抗低濃度(4mg/mL),特瑞普利單抗高濃度(40mg/mL),谷胱甘肽(10mM)+特瑞普利單抗低濃度(4mg/mL),谷胱甘肽(10mM)+特瑞普利單抗高濃度(40mg/mL),將干預(yù)后大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，置于37℃,5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h。PBS洗滌3次后，細(xì)胞在含噻唑藍(lán)(MTT,5mg/ml)的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h,加入二甲基亞砜溶解甲瓚晶體，使用Bio-Rad酶標(biāo)儀570nm波長處檢測其光密度(OpticalDelnsity,OD)值。[0024]如圖1A所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未干預(yù)相比，特瑞普利單抗干預(yù)使脾淋巴細(xì)胞活力顯著性降低；與特瑞普利單抗相比，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗恢復(fù)脾淋巴細(xì)胞活力，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。[0025]如圖1B所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未干預(yù)相比，特瑞普利單抗干預(yù)使骨髓細(xì)胞活力顯著性降低；與特瑞普利單抗高濃度相比，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗高濃度恢復(fù)骨髓細(xì)胞[0029]新鮮提取的脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)(Untreated、4mg/mL、40mg/mL、GSH+4mg/mL、GSH+40mg/mL)處理24h,PBS洗滌，冰70%乙醇固定，50μg/mL碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)染色30min。細(xì)胞周期分析采用流式細(xì)胞儀(BDFACSCaliburTM)[0031]如圖2A所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未干預(yù)相比，特瑞普利單抗干預(yù)使脾淋巴細(xì)胞S期細(xì)胞減少；與特瑞普利單抗相比，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗恢復(fù)脾淋巴細(xì)胞S期細(xì)胞。[0032]如圖2B所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胞減少；與特瑞普利單抗相比，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗恢復(fù)骨髓細(xì)胞G2期細(xì)胞。6[0036]新鮮提取的脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)(Untreated、4mg/mL、40mg/mL、[0038]如圖3A所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未干預(yù)相比，特瑞普利單抗高濃度干預(yù)使脾淋巴細(xì)胞GSH濃度顯著性降低；與特瑞普利單抗相比，GSH聯(lián)合特瑞普利單抗高濃度恢復(fù)脾淋巴細(xì)[0039]如圖3B所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與未干預(yù)相比，特瑞普利單抗高濃度干預(yù)使骨髓細(xì)胞GSH濃度顯著性降低；與特瑞普利單抗相比，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗恢復(fù)骨髓細(xì)胞的[0040]綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，和未干預(yù)相比，特瑞普利單抗降低大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞活力，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗可恢復(fù)大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞細(xì)胞活力，統(tǒng)計(jì)學(xué)存在顯著性差異。和未干預(yù)相比，特瑞普利單抗減少大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞S期和G2期細(xì)胞，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗可增加大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞S期和G2期細(xì)胞。和未干預(yù)相比，特瑞普利單抗降低大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞GSH濃度，谷胱甘肽聯(lián)合特瑞普利單抗可恢復(fù)大鼠脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞GSH濃度，統(tǒng)計(jì)學(xué)存在顯著性差異。說明谷胱甘肽聯(lián)合PD-1單抗特瑞普利能減緩PD-1單抗特瑞普利對外周免疫系統(tǒng)和中樞免疫系統(tǒng)的抑制作用。71/2頁1/2頁l4