時間分辨熒光免疫分析技術(shù)第1頁，共24頁。時間分辨熒光免疫分析技術(shù)第2頁，共24頁。①免疫熒光②放射免疫④化學(xué)發(fā)光⑥電化學(xué)發(fā)光⑤時間分辨熒光③酶聯(lián)免疫第3頁，共24頁。標(biāo)記免疫技術(shù)的理論檢測靈敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶聯(lián)免疫 10-9-10-10mol化學(xué)發(fā)光 10-15mol時間分辨熒光10-18mol電化學(xué)發(fā)光 10-18mol第4頁，共24頁。一、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介紹基本原理技術(shù)特點(diǎn)反應(yīng)模式第5頁，共24頁。背景介紹1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini

和Hemmila首次提出了建立稀土離子標(biāo)記物的“時間分辨熒光免疫分析”理論1983年，Soini和Kojola首先開發(fā)出以鑭系元素為示蹤物的時間分辨熒光測量儀，建立了新的非放射性微量分析檢測技術(shù)。同一年，

Pettersson等人運(yùn)用此儀器首次對人絨膜促性腺激素

(hCG)進(jìn)行了時間分辨熒光免疫分析1984年，Hemmila確定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)這種時間分辨免疫分析技術(shù)方案,從而使DELFIA成為Wallac的專利技術(shù)1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis創(chuàng)立了一種不同于DELFIA

的時間分辨熒光免疫分析，即FIAgen2003年，時間分辨熒光分析技術(shù)獲國家科技進(jìn)步二等獎第6頁，共24頁。基本原理三價稀土離子包括有銪(Eu)，釤（Sm)，鋱

(Tb)，鏑

(Dy)

等，它們的熒光光譜具有特異性強(qiáng)﹑Stokes位移大﹑壽命長的特點(diǎn)DELFIA采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)

為雙功能螯合試劑，其一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質(zhì)的-NH2

連接。在中性或接近中性pH條件下，DTTA與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強(qiáng)液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放出來并與增強(qiáng)液中的配體螯合﹑進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu3+熒光得以成千萬倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA為標(biāo)記物，通過檢測其與過量Eu3+形成的螯合物熒光進(jìn)行定量。由于

BCPDA的可檢測性不夠理想，F(xiàn)IAgen需要利用生物素-

親合素信號放大來彌補(bǔ)BCPDA檢測靈敏度的不足第7頁，共24頁。DELFIA標(biāo)記技術(shù)堿性第8頁，共24頁。時間:(μs）04008001000340nm激發(fā)光第二個循環(huán)熒光短壽命熒光613nm長壽命熒光延遲時間測值時間通過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使理論本底達(dá)到0第9頁，共24頁。300400500600熒光強(qiáng)度激發(fā)光發(fā)射光波長(nm)第10頁，共24頁。TbDyEuSm500發(fā)射光強(qiáng)度2004000延遲時間(μs)600發(fā)射光波長(nm)500發(fā)射光強(qiáng)度0延遲時間(μs)第11頁，共24頁。TRFIA技術(shù)特點(diǎn)極長的熒光衰退時間銪：730000nsStokes位移大銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm狹窄的發(fā)射峰解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍第12頁，共24頁。固相包被抗體銪標(biāo)記抗體孵育Eu待測抗原++EuEu+增強(qiáng)液+Eu雙抗體夾心法示意圖第13頁，共24頁。雙抗原夾心法示意圖Eu++孵育+Eu孵育增強(qiáng)液+Eu固相包被抗原待測抗體銪標(biāo)記抗原第14頁，共24頁。中和法示意圖(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增強(qiáng)液++Eu待測抗體銪標(biāo)記抗體中和抗原第15頁，共24頁。小分子抗原競爭抑制示意圖固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待測抗原銪標(biāo)抗原Eu增強(qiáng)液++Eu一抗第16頁，共24頁。時間分辨技術(shù)重點(diǎn)和難點(diǎn)固定相（96孔板）標(biāo)準(zhǔn)品銪標(biāo)記物第17頁，共24頁。二、時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

測試儀第18頁，共24頁。目前的TRFIA測試儀：國外儀器（Wallac公司<PerkinElmer>）國內(nèi)其他公司生產(chǎn)的儀器(上海新波、廣州豐華等)達(dá)瑞抗體公司自主研發(fā)的儀器及軟件（DR-M6601）第19頁，共24頁。WallacAutoDELFIA1235第20頁，共24頁。半自動VICTOR21420