ICSCCSC T/CRHA052—Evaluationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhumanliver

中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)發(fā)布目 T/CRHA052—前GB/T1.1—20201部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)引言的巨大挑戰(zhàn)。藥源性肝損傷（drug—inducedliverinjury，DILI）是臨床上最常見的藥DILI，評(píng)價(jià)模型和技術(shù)的缺T/CSCB0008—2021humanliverdrug-inducedliverT/CRHAT/CRHA057—controlALT——谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alaninetransaminase）AOP——有害結(jié)局路徑（Adverseoutcomepathway）AST——谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartatetransaminase）CMFDA——5-氯甲基熒光素醋酸酯（5-chloromethylfluoresceindiacetate）CYPs——細(xì)胞色素酶P450（CytochromeP450enzymesystem）DMOS——二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）FBS——胎牛血清(Fetalbovineserum)MMP——線粒體膜電位（Mitochondrialmembranepotential）41。1HCSDetectionFluorescentExcitationwavelength/emissionwavelength495/515nm(green)495/635nm(red)502/530nmNile543/598nm492/517nm注：通常選用幾個(gè)終點(diǎn)組合以獲得最準(zhǔn)確的DILI待測(cè)藥物的準(zhǔn)備應(yīng)按《人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)ICH三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則》，其工作時(shí)的%（5%（95%2000——1,000~10,000rcf應(yīng)具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、4060倍物鏡），能夠顯示微小組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞；0.1mg~200g1mg1)-202)PBS2μMCalceinAM4μMEthD-DMSO2mMDMSO1mMDMSO10mMμM41所示。1T/CSCB0008-20215.2要求，肝細(xì)胞的基礎(chǔ)形態(tài)與功能屬性，比如白蛋白分泌≥800ng/(10624HCMV、TP等均為陰性。96200μl2所示，在板①的第二列中，只加入培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的待測(cè)藥物，不加入細(xì)胞。同樣注：其中板①中涉及到的無(wú)肝毒性藥物（陰性藥物）主要包括：阿司匹林(AspirinASP)、安倍生(AmbrisentanAMB)、普萘洛爾(PropranololPRO)、華法林(WarfarinWAR)、羅格列酮(Rosiglitazone,45200μl的待測(cè)藥物，第二行為對(duì)照組，只加不含454）24h后，用顯微鏡或高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)在明場(chǎng)下檢查人源肝臟類器官，觀察并記錄吸取待測(cè)藥物加樣板（板①）100μl含有人源肝將板及其內(nèi)容物平衡至室溫（22–25）305minALTAST0、2、4、6、8、10μmol/L。每個(gè)濃度配20ml。——2μmol/mL2μl、4μl、6μl、8μl、10——18μl、16μl、14μl、12μl、1030min20μL5μL待測(cè)藥物加樣板（板①）第六列至第37°C20min。100μlPBS。加入探針染料，按下列步驟進(jìn)行染色:Live/dead在藥物加樣板（見圖5，板②）的第二列至第四列加入100μl含2×的CalceinAM探針（2μM）和EthD-1探針（4μM）37℃(避光)30min；每孔加入100μl2×的Hoechst（10μg/ml）的無(wú)血清培養(yǎng)基37避光)10min。b）Caspase-3/7NileRed染色在藥物加樣板（見圖5，肝臟毒性檢測(cè)板）的第五列至第七列加入100μl含2×的3/7探針（200nM）和NileRed探針（5μM）37避光)30每孔加入100μl2×的Hoechst（10μg/ml）的無(wú)血清培養(yǎng)基37避光)10min。c）CMFDA染色探針（30μM）37避光)30℃(3/7的激發(fā)波長(zhǎng)/502/530nm、NileRed的激發(fā)波長(zhǎng)/543/598nm，CMFDA的激發(fā)波長(zhǎng)/492/517nm，Hoechst的激發(fā)波長(zhǎng)/346/460nm。（1：RCV=(FI加藥組-FI空白)/(FI對(duì)照組-FI空白]× ImageJ軟件定量每個(gè)視野下各通道（CalceinAM、EthD-1、NileRed、Caspase-3/7、CMFDAHoechst）陽(yáng)性（染色）25個(gè)視（2：X=NCalceinAM_PC/(NEthD-1_PC) NCalceinAM_PC：活細(xì)胞數(shù)量；NEthD-1_PC（3：FICaspase-3/7+=FICaspase-3/7總/S× （4：FINileRed+=FINileRed總/ FINileRed+：NileRed陽(yáng)性（染色）FINileRed總：NileRed（5：FICMFDA+=FICMFDA總/ 計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（以為x?s表示）Excel或GraphPadPrism本實(shí)驗(yàn)以HepaG細(xì)胞三維培養(yǎng)形成的人源肝臟類器官為例，針對(duì)藥物S進(jìn)行肝臟毒性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)需求，擬定如下具體操作方案。通過此評(píng)價(jià)，旨在充分了解S藥物對(duì)人體肝臟的潛在毒性，并為相CellTiter-Glo?LuminescentCellViabilityAssayCellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，簡(jiǎn)稱CTG)DetectionExcitationwavelengthemissionwavelength495/515nm（green）495/635nm（red）502/530Nile543/598492/517c）WilliamsEMedium培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺)——10胎牛血清——90%——100IU/mL——100μg/mL鏈霉素——2mM谷氨酰胺——5μg/mL胰島素——0.5mM用5ml培養(yǎng)基(10FBS)重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到10cm的培養(yǎng)皿中，放置在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)FBS的培養(yǎng)基以終止消化。進(jìn)行輕柔的離心，一般建議采用400rcf2min的程序。過程中應(yīng)盡量避免離心速度太高，選擇1:4或1:5的比例來進(jìn)行傳代，以確保細(xì)胞在新的培養(yǎng)條件下能夠獲得更好的生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量

生長(zhǎng)天數(shù)根據(jù)藥物說明書用合適的溶劑充分溶解待測(cè)藥物和無(wú)肝毒性藥物阿司匹林(AspirinASP)到儲(chǔ)存濃度。5個(gè)濃度梯度分別為：1.92μM,9.6μM,100μM,440μM,1500μM。利用瓊脂糖制作超低吸附96孔板。具體方法如下：將加熱的0.8%瓊脂糖膠以每孔50μL-100ul的體積分配到9637℃、5CO2培養(yǎng)箱中至少20min，使瓊脂糖膠聚合，在所有孔的底部形成凹面的聚合層。HepaG4096（9..1），補(bǔ)充200l3100μl100μl143D培養(yǎng)按照9.2章的步驟用不同濃度的待測(cè)S藥物處理人源肝臟類器官24h。用顯微鏡或高內(nèi)涵在明場(chǎng)下按照9.6章使用CalceinAMEthD-1探針、Caspase-3/7NileRed探針，以及CMFDA探

根據(jù)藥物說明書用培養(yǎng)基充分溶解S藥物到儲(chǔ)存濃度10mM。本試驗(yàn)中的使用濃度分別為：1.92μM,9.6μM,100μM,440μM,1500μM。%白蛋白分泌：1000ng/（10624藥物代謝酶功能，內(nèi)在清除率：280μL106本試驗(yàn)中檢測(cè)用到的主要儀器是：高內(nèi)涵圖像采集分析工作站，T7820。使用OperattaHigh-ContentImagingSystem獲取細(xì)胞球圖像，harmonysoftware分析數(shù)據(jù)。eTer-GoS藥物和AP）.1SSIC0值為2.65M。

為了探索S藥物相關(guān)的肝毒性的潛在損傷途徑，將人源肝臟類器官暴露于6種不同濃度的S藥物24h3D層掃圖像多層疊加后計(jì)acenAM探針和hD-1SCaspase-3/7探針和NileRed探針孵育不同濃度的S藥物處理的人源肝臟類器官，使用高內(nèi)涵成CMFDA探針孵育不同濃度的S藥物處理的人源肝臟類器官，使用高內(nèi)涵成像并使用高內(nèi)涵分從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，S藥物對(duì)人源肝臟類器官具有顯著毒性，且肝臟損傷呈劑量響應(yīng)關(guān)系，SAT和AT釋放量增加、活細(xì)胞與死細(xì)胞的比例變化、凋亡細(xì)胞和脂肪變性細(xì)胞數(shù)量的增加以及膽汁淤積增加等肝肝臟在體內(nèi)扮演著非常重要的角色，參與了多種代謝過程，包括藥物代謝和解毒。然而，隨著S藥物濃度的增加，肝臟遭受到破壞，并引發(fā)了肝臟減毒反應(yīng)。降低細(xì)胞活性和活細(xì)胞與死細(xì)胞比例的變化，可能是因?yàn)镾藥物干擾了肝臟細(xì)胞的正常代謝功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死和功能喪失。凋亡細(xì)胞和脂質(zhì)變性細(xì)胞數(shù)量的增加表明，S藥物會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致肝細(xì)胞逐漸失去完AT和AT釋放量的增加也表明S成了直接的損害。總的來說，這些結(jié)果表明S藥物對(duì)肝臟表現(xiàn)出劑量依賴的毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于S[1]GB/T16886.5—20175部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（ISO10993-5:2009）[2]ICH三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則，人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析S2（R1，201S.Russmann,A.Jetter,G.A.Kullak-Ublick,Pharmacogeneticsofdrug-inducedliverinjury.Hepatology52,748-761(2010).N.Chalasanietal.,FeaturesandOutcomesof899PatientsWithDrug-InducedLiverInjury:TheDILINProspectiveStudy.Gastroenterology148,1340-1352e1347(2015).E.S.Bjornsson,O.M.Bergmann,H.K.Bjornsson,R.B.Kvaran,S.Olafsson,Incidence,presentation,andoutcomesinpatientswithdrug-inducedliverinjuryinthegeneralpopulationofIceland.Gastroenterology144,1419-1425,1425e1411-1413;quize1419-1420(2013).R.J.Andradeetal.,Drug-inducedliverinjury:ananalysisof461incidencessubmittedtotheSpanishregistryovera10-yearperiod.Gastroenterology129,512-521(2005).T.Shenetal.,IncidenceandEtiologyofDrug-InducedLiverInjuryinMainlandChina.Gastroenterology156,2230-2241e2211(2019).E.S.Bjornsson,J.H.Hoofnagle,Categorizationofdrugsimplicatedincausingliverinjury:Criticalassessmentbasedonpublishedcasereports.Hepatology63,590-603(2016).I.Ayvaz,D.Sunay,E.Sariyar,E.Erdal,Z.F.Karagonlar,Three-DimensionalCellCultureModelsofHepatocellularCarcinoma-aReview.JGastrointestCancer52,1294-1308(2021).E.Goulartetal.,3Dbioprintingofliverspheroidsderivedfromhumaninducedpluripotentstemcellssustainliverfunctionandviabilityinvitro.Biofabrication12,015010(2019).R.Sharma,S.Greenhough,C.N.Medine,D.C.Hay,Three-dimensionalcultureofhumanembryonicstemcellderivedhepaticendodermanditsroleinbioartificialliverconstruction.JBiomedBiotechnol2010,236147(2010).S.R.Khetani,S.N.Bhatia,Microscalecultureofhumanlivercellsfordrugdevelopment.NatBiotechnol26,120-126(2008).D.L.Villeneuveetal.,Adverseoutcomepathway(AOP)developmentI:strategiesandprinciples.ToxicolSci142,312-320(2014).R.Lietal.,Fibrinogenimprovesliverfunctionviapromotingcellaggregationandfibronectinassemblyinhepaticspheroids.Biomaterials280,121266(2022).M.Xuetal.,Identificationofsmall-moleculeinhibitorsofZikavirusinfectionandinducedneuralcelldeathviaadrugrepurposingscreen.NatMed22,1101-1107(2016).S.J.Munetal.,Generationofexpandablehumanpluripotentstemcell-derivedhepatocyte-likeliverorganoids.JHepatol71,970-985(2019).M.Manangeeswaranetal.,BindingofhepatitisAvirustoitscellularreceptor1inhibitsT-regulatorycellfunctionsinhumans.Gastroenterology142,1516-1525e1513(2012).J.K.Long,W.Dai,Y.W.Zheng,S.P.Zhao,miR-122promoteshepaticlipogenesisviainhibitingtheLKB1/AMPKpathwaybytargetingSirt1innon-alcoholicfattyliverdisease.MolMed25,26(2019).M.Stamparetal.,Hepatocellularcarcinoma(HepG2/C3A)cell-based3Dmodelforgenotoxicitytesting