冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段原核表達(dá)與鑒定的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1冠狀病毒的研究現(xiàn)狀冠狀病毒（Coronaviruses）是一類具有囊膜（envelope）、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，其形態(tài)結(jié)構(gòu)在電鏡下觀察類似日冕（corona），故而得名。該病毒家族龐大，在自然界廣泛存在，能夠感染包括人類、哺乳動物和鳥類等眾多宿主，引發(fā)從呼吸道、胃腸道到神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)的疾病。已知可感染人的冠狀病毒共有7種，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1這四種在人群中較為常見，通常引起普通感冒等相對溫和的上呼吸道感染癥狀。而另外三種冠狀病毒，即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），則具有更強的致病性，引發(fā)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。如2002-2003年爆發(fā)的SARS疫情，波及全球30多個國家和地區(qū)，造成了7748人感染，829人死亡；2012年發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV，主要在中東地區(qū)傳播，患者死亡率在38%左右；2019年底爆發(fā)的SARS-CoV-2疫情，更是給全球健康和經(jīng)濟帶來了巨大的沖擊，持續(xù)至今仍在深刻影響著人們的生活。HCoV-229E是α冠狀病毒屬和杜維納冠狀病毒屬（Duvinacovirus）的成員，是最早被發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒之一，于1965年首次被鑒定。它是一種有包膜的正義單鏈RNA病毒，病毒粒子多呈圓形或橢圓形，直徑大約100-120nm。其基因組長度約為27kb，主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）、膜蛋白（M）和囊膜蛋白（E）。HCoV-229E在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，人群普遍易感，多項血清學(xué)研究表明，幾乎100%的兒童在幼年早期均感染過HCoV-229E和NL63。它主要感染呼吸道和腸黏膜表面，巨噬細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)樹突狀細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞是其主要靶細(xì)胞，可誘發(fā)自身限制性的急性感染和慢性持續(xù)性感染，諸如急性呼吸道疾病、腸炎肝炎、腦炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性脫髓鞘等疾病。在冠狀病毒的研究中，刺突蛋白（S蛋白）由于其在病毒感染過程中的關(guān)鍵作用，成為了研究的重點。S蛋白不僅是病毒識別和結(jié)合宿主細(xì)胞受體的關(guān)鍵蛋白，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，使得病毒基因組能夠進入宿主細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制，而且是病毒的主要抗原蛋白，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的重要靶點。因此，深入研究冠狀病毒S蛋白，尤其是HCoV-229E的S1蛋白片段，對于理解冠狀病毒的感染機制、宿主防御機制以及開發(fā)有效的防治策略具有重要的意義。1.1.2HCoV-229ES1蛋白的研究意義HCoV-229E的S蛋白是一種I型糖蛋白，在病毒侵入細(xì)胞的過程中發(fā)揮著核心作用。S蛋白由S1和S2兩個亞基組成，其中S1亞基包含受體結(jié)合域（RBD），負(fù)責(zé)識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，是病毒感染宿主細(xì)胞的第一步，也是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的關(guān)鍵因素。HCoV-229E通過其S1蛋白與宿主細(xì)胞表面的氨肽酶N（APN，也稱為ANPEP）受體特異性結(jié)合，從而啟動病毒的感染過程。這種特異性的結(jié)合決定了病毒能夠感染哪些細(xì)胞類型，進而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究HCoV-229ES1蛋白在研發(fā)疫苗和治療方法方面具有重要價值。作為病毒的主要抗原蛋白，S1蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。這些中和抗體可以特異性地結(jié)合S1蛋白，阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而阻止病毒進入細(xì)胞，達(dá)到預(yù)防和治療病毒感染的目的。對S1蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，有助于設(shè)計出更加有效的疫苗和治療藥物。例如，基于S1蛋白的結(jié)構(gòu)，可以通過基因工程技術(shù)制備重組蛋白疫苗，使其能夠更有效地激發(fā)機體的免疫反應(yīng)；或者以S1蛋白與受體的結(jié)合位點為靶點，設(shè)計小分子抑制劑，阻斷病毒的感染途徑。此外，由于不同冠狀病毒的S蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性，研究HCoV-229ES1蛋白也可以為其他冠狀病毒，如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的研究提供參考和借鑒，加速對這些高致病性冠狀病毒的認(rèn)識和防治策略的開發(fā)。1.2國內(nèi)外研究進展在國際上，對于冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段的研究已經(jīng)取得了一定的成果。早期研究主要集中在對HCoV-229E病毒本身的分離、鑒定以及基因組測序等方面，為后續(xù)對其蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員開始深入探究S1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。例如，通過X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡技術(shù)，解析了S1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，明確了其受體結(jié)合域（RBD）的具體結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，揭示了S1蛋白與宿主細(xì)胞受體氨肽酶N（APN）相互作用的分子機制。在S1蛋白的免疫原性研究方面，多項動物實驗表明，重組表達(dá)的S1蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的中和抗體，這些抗體可以有效阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，為疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。在原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)S1蛋白方面，國外也開展了大量研究。一些研究使用大腸桿菌作為表達(dá)宿主，通過優(yōu)化表達(dá)載體、誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)工藝等，成功實現(xiàn)了S1蛋白的高效表達(dá)。例如，有研究將S1蛋白基因克隆到pET系列表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了較高產(chǎn)量的重組S1蛋白。在蛋白純化和鑒定方面，采用了親和層析、離子交換層析等多種技術(shù)，對表達(dá)的S1蛋白進行純化，并通過Westernblot、ELISA、質(zhì)譜分析等方法對其進行鑒定，確保了蛋白的純度和活性。國內(nèi)對冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段的研究也在逐步深入。在病毒的流行病學(xué)調(diào)查方面，國內(nèi)多個地區(qū)開展了相關(guān)研究，明確了HCoV-229E在我國人群中的感染情況和流行特征。例如，對不同地區(qū)急性呼吸道感染病例的監(jiān)測分析，揭示了HCoV-229E的感染率、季節(jié)分布以及與其他病原體的混合感染情況。在S1蛋白的功能研究方面，國內(nèi)研究人員通過構(gòu)建多種表達(dá)系統(tǒng)，對S1蛋白的生物學(xué)活性進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)S1蛋白不僅在病毒感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還可能參與病毒的免疫逃逸機制。在原核表達(dá)及鑒定技術(shù)方面，國內(nèi)也取得了顯著進展。通過優(yōu)化表達(dá)條件，如培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等，提高了S1蛋白的表達(dá)量和可溶性。同時，在蛋白鑒定方面，結(jié)合了多種先進的技術(shù)手段，如表面等離子共振（SPR）技術(shù)，用于檢測S1蛋白與受體的結(jié)合親和力；免疫熒光技術(shù)，用于觀察S1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布。然而，現(xiàn)有的研究仍存在一些不足之處。在S1蛋白的結(jié)構(gòu)研究方面，雖然已經(jīng)解析了其三維結(jié)構(gòu)，但對于其在不同生理狀態(tài)下的構(gòu)象變化以及與其他病毒蛋白或宿主蛋白相互作用時的結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，還缺乏深入的了解。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，S1蛋白的表達(dá)量和可溶性仍然有待提高，部分表達(dá)的蛋白存在包涵體形成的問題，影響了蛋白的后續(xù)應(yīng)用。此外，對于S1蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)機制，尤其是在人體中的免疫應(yīng)答過程和免疫記憶的形成，還需要進一步的研究。本研究正是基于以上背景，旨在通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，提高HCoV-229ES1蛋白片段的表達(dá)量和可溶性，并運用多種先進的鑒定技術(shù)，對表達(dá)的蛋白進行全面的鑒定和分析，為深入研究S1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及開發(fā)基于S1蛋白的診斷試劑、疫苗和治療藥物提供重要的實驗依據(jù)和技術(shù)支持。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在通過原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)具有生物學(xué)活性的冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段，并對其進行全面、準(zhǔn)確的鑒定。具體目標(biāo)包括：優(yōu)化原核表達(dá)條件，提高S1蛋白片段的表達(dá)量和可溶性，解決表達(dá)過程中可能出現(xiàn)的包涵體等問題；運用多種先進的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，如SDS-PAGE、Westernblot、質(zhì)譜分析、ELISA、表面等離子共振（SPR）等，對表達(dá)的S1蛋白片段進行純度、結(jié)構(gòu)和功能等方面的鑒定，確保其與天然S1蛋白具有相似的生物學(xué)特性；為深入研究HCoV-229ES1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及開發(fā)基于S1蛋白的診斷試劑、疫苗和治療藥物提供高質(zhì)量的蛋白樣品和可靠的實驗依據(jù)。1.3.2研究內(nèi)容構(gòu)建表達(dá)載體：提取HCoV-229E的基因序列，通過生物信息學(xué)分析，確定S1蛋白片段的編碼序列。設(shè)計特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增目的基因片段。選擇合適的原核表達(dá)載體，如pET系列（如pET-28a、pET-30a等）、pGEX系列（如pGEX-4T-1等），通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將擴增的S1蛋白片段基因插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體。對構(gòu)建的重組表達(dá)載體進行測序驗證，確保插入基因序列的準(zhǔn)確性和完整性。細(xì)菌轉(zhuǎn)化：將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌宿主菌株中，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。采用熱激轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化等方法，提高轉(zhuǎn)化效率。通過在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上篩選，挑取陽性克隆。對陽性克隆進行菌落PCR、酶切鑒定等，進一步確認(rèn)重組表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)化到宿主菌中。表達(dá)條件優(yōu)化：對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進行培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)基（如LB、TB、2×YT等）、培養(yǎng)溫度（如16℃、25℃、37℃等）、誘導(dǎo)劑（如IPTG）濃度（如0.1mM、0.5mM、1.0mM等）和誘導(dǎo)時間（如2h、4h、6h、8h等）對S1蛋白片段表達(dá)量和可溶性的影響。通過SDS-PAGE分析，確定最佳的表達(dá)條件。針對表達(dá)過程中可能出現(xiàn)的包涵體問題，嘗試優(yōu)化表達(dá)條件（如降低誘導(dǎo)溫度、減少誘導(dǎo)劑濃度、延長誘導(dǎo)時間等），或者采用共表達(dá)分子伴侶（如GroEL-GroES、DnaK-DnaJ-GrpE等）等方法，提高蛋白的可溶性。蛋白鑒定：采用親和層析（如His-tag親和層析、GST-tag親和層析等）、離子交換層析、凝膠過濾層析等技術(shù)，對表達(dá)的S1蛋白片段進行純化，獲得高純度的目標(biāo)蛋白。通過SDS-PAGE電泳，檢測蛋白的純度和分子量，與預(yù)期的S1蛋白片段分子量進行對比。利用Westernblot技術(shù)，使用特異性抗體檢測目的蛋白，驗證其抗原性。采用質(zhì)譜分析技術(shù)，確定蛋白的氨基酸序列和修飾情況，進一步確認(rèn)蛋白的身份。通過ELISA、SPR等技術(shù)，檢測S1蛋白片段與宿主細(xì)胞受體氨肽酶N（APN）的結(jié)合活性，評估其生物學(xué)功能。二、冠狀病毒HCoV-229E與S1蛋白概述2.1HCoV-229E的生物學(xué)特性2.1.1病毒的發(fā)現(xiàn)與分類HCoV-229E是最早被發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒之一。1965年，Tyrrell和Bynoe用人胚氣管培養(yǎng)方法，從普通感冒病人鼻涕中分離出一株病毒，最初命名為B814。隨后，在1966年，Hamre和Procknow從人腎組織中也成功分離到了該病毒，并將其命名為229E。此后，隨著研究的深入，人們逐漸明確了它在冠狀病毒科中的分類地位。冠狀病毒屬于套式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）。根據(jù)病毒的血清學(xué)特點和核苷酸序列的差異，冠狀病毒科又分為α、β、γ、δ四個屬。HCoV-229E屬于α冠狀病毒屬和杜維納冠狀病毒屬（Duvinacovirus）。在α冠狀病毒屬中，還包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等其他重要的動物冠狀病毒，它們雖然宿主不同，但在基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)等方面與HCoV-229E存在一定的相似性，這也為研究HCoV-229E提供了一些參考和比較的依據(jù)。HCoV-229E與其他冠狀病毒在進化樹上的位置相對獨立，其獨特的基因特征和演化歷程，使得它在冠狀病毒家族中具有特殊的地位，也為進一步探究冠狀病毒的進化和傳播規(guī)律提供了重要的研究對象。2.1.2病毒的結(jié)構(gòu)與基因組HCoV-229E病毒粒子多呈圓形或橢圓形，具有典型的冠狀病毒形態(tài)特征，直徑大約100-120nm。病毒粒子由包膜（envelope）、核衣殼（nucleocapsid）等結(jié)構(gòu)組成。包膜是病毒粒子最外層的結(jié)構(gòu)，主要由脂質(zhì)雙層和鑲嵌其中的糖蛋白組成，這些糖蛋白包括刺突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和包膜蛋白（E蛋白）。S蛋白在病毒感染過程中起著關(guān)鍵作用，它是一種I型糖蛋白，以三聚體的形式存在于病毒包膜表面，形成明顯的刺突狀結(jié)構(gòu)，這也是冠狀病毒得名的原因之一。M蛋白是一種跨膜糖蛋白，在包膜中含量最為豐富，它參與了病毒包膜的形成和病毒粒子的組裝過程，對于維持病毒的形態(tài)和穩(wěn)定性具有重要作用。E蛋白是一種小的膜蛋白，雖然含量較少，但在病毒的裝配、出芽和釋放等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。核衣殼位于病毒粒子內(nèi)部，由病毒基因組RNA和核衣殼蛋白（N蛋白）組成。HCoV-229E的基因組為線性單股正鏈RNA，長度約為27kb。其基因組具有正鏈RNA特有的重要結(jié)構(gòu)特征，5'端有一甲基化帽子（MethylatedCAP），3'端有PolyA尾巴。甲基化帽子結(jié)構(gòu)不僅可以保護RNA不被磷酸酶和核酸酶降解，而且在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中起著促進作用，它能夠與宿主細(xì)胞的翻譯起始因子相互作用，啟動mRNA的翻譯過程。PolyA尾巴的存在同樣有助于穩(wěn)定基因組的結(jié)構(gòu)，并且在病毒侵入宿主細(xì)胞后，能夠輔助病毒基因組的翻譯和復(fù)制。HCoV-229E基因組主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、E、N）以及多個非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白由病毒基因組的開放閱讀框1a（ORF1a）和1ab（ORF1ab）編碼，它們在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用。例如，一些非結(jié)構(gòu)蛋白參與了病毒復(fù)制酶復(fù)合物的形成，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；另一些非結(jié)構(gòu)蛋白則具有蛋白酶活性，能夠?qū)Σ《径嗑鄣鞍走M行切割，產(chǎn)生具有功能的成熟蛋白。這些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白相互協(xié)作，共同完成病毒的生命周期。2.1.3病毒的致病機制與臨床癥狀HCoV-229E主要感染呼吸道和腸黏膜表面，巨噬細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)樹突狀細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞是其主要靶細(xì)胞。病毒的致病機制是一個復(fù)雜的過程，首先，HCoV-229E的S1蛋白通過與宿主細(xì)胞表面的氨肽酶N（APN，也稱為ANPEP）受體特異性結(jié)合，使得病毒能夠附著在宿主細(xì)胞表面。這種特異性結(jié)合是病毒感染的起始步驟，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。一旦病毒附著在細(xì)胞表面，S2蛋白介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，將病毒的核衣殼釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)。進入細(xì)胞后，病毒基因組RNA利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，首先翻譯出多聚蛋白，這些多聚蛋白隨后被病毒自身編碼的蛋白酶切割成多個具有功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，形成病毒復(fù)制酶復(fù)合物。病毒復(fù)制酶復(fù)合物以病毒基因組RNA為模板，進行病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的子代病毒基因組RNA和mRNA。mRNA進一步翻譯出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白與子代病毒基因組RNA在細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，通過出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。在這個過程中，病毒的感染會引起宿主細(xì)胞的一系列病理變化。病毒的復(fù)制和組裝可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的代謝紊亂，影響細(xì)胞的正常功能。病毒感染還會激活宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，引發(fā)炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)在一定程度上有助于清除病毒，但過度的炎癥反應(yīng)也可能對宿主組織和器官造成損傷。例如，在呼吸道感染中，炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致呼吸道黏膜充血、水腫，分泌增多，引起咳嗽、流涕、呼吸困難等癥狀。HCoV-229E感染人體后，主要引發(fā)呼吸道疾病，典型的臨床癥狀包括流涕、咽喉腫痛、咳嗽、頭痛、發(fā)熱等普通感冒癥狀。這些癥狀通常相對較輕，具有自限性，一般在1-2周內(nèi)可自行緩解。在一些免疫力較弱的人群，如兒童、老年人和免疫功能低下者中，感染可能會引發(fā)較為嚴(yán)重的癥狀，如支氣管炎、肺炎等，甚至可能導(dǎo)致呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。HCoV-229E還可能引起胃腸道疾病，如急性腸胃炎，但相對較少見，癥狀一般也較輕，表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐等。2.2S1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1S1蛋白的結(jié)構(gòu)組成HCoV-229E的S蛋白是一種I型糖蛋白，由S1和S2兩個亞基組成。S1亞基相對分子質(zhì)量約為69kDa，主要負(fù)責(zé)識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，在病毒感染的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。S1亞基包含多個結(jié)構(gòu)域，其中受體結(jié)合域（RBD）是其最重要的結(jié)構(gòu)特征之一。受體結(jié)合域（RBD）是S1亞基中直接與宿主細(xì)胞受體氨肽酶N（APN）相互作用的區(qū)域。通過X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡等技術(shù)解析發(fā)現(xiàn)，HCoV-229ES1蛋白的RBD具有獨特的三維結(jié)構(gòu)。它由多個β折疊和α螺旋組成，形成一個緊湊的球狀結(jié)構(gòu)。在這個結(jié)構(gòu)中，一些關(guān)鍵的氨基酸殘基對于與APN受體的結(jié)合至關(guān)重要。例如，RBD中的某些氨基酸殘基能夠與APN上的特定氨基酸形成氫鍵、鹽橋等相互作用，從而實現(xiàn)病毒與宿主細(xì)胞的特異性識別和緊密結(jié)合。除了RBD，S1亞基還包含N端結(jié)構(gòu)域（NTD）等其他結(jié)構(gòu)域。NTD在不同冠狀病毒的S1蛋白中具有一定的多樣性，其功能尚未完全明確。在HCoV-229E中，NTD可能參與了病毒與宿主細(xì)胞的初始附著過程，或者在病毒感染過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)S1蛋白構(gòu)象變化的作用。有研究推測，NTD可能通過與宿主細(xì)胞表面的一些輔助分子相互作用，增強病毒與細(xì)胞的親和力，為RBD與APN受體的結(jié)合創(chuàng)造更有利的條件。S1亞基的不同結(jié)構(gòu)域之間通過靈活的連接肽相連，這種結(jié)構(gòu)特點使得S1蛋白在與宿主細(xì)胞受體結(jié)合過程中能夠發(fā)生構(gòu)象變化，從而更好地完成病毒的感染過程。2.2.2S1蛋白在病毒感染中的作用在病毒感染過程中，S1蛋白發(fā)揮著不可或缺的作用，是病毒識別宿主細(xì)胞、結(jié)合受體以及介導(dǎo)病毒進入細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。首先，S1蛋白負(fù)責(zé)識別宿主細(xì)胞表面的特異性受體。HCoV-229E的S1蛋白通過其RBD與宿主細(xì)胞表面的氨肽酶N（APN）受體特異性結(jié)合。這種特異性結(jié)合具有高度的選擇性，是病毒感染宿主細(xì)胞的第一步，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。研究表明，S1蛋白與APN受體的結(jié)合親和力很高，兩者之間的相互作用是由RBD上的關(guān)鍵氨基酸殘基與APN受體的特定結(jié)構(gòu)域相互匹配實現(xiàn)的。一旦S1蛋白的RBD與APN受體結(jié)合，就會引發(fā)S1蛋白的構(gòu)象變化，為后續(xù)的病毒進入過程奠定基礎(chǔ)。S1蛋白在結(jié)合受體后，會誘導(dǎo)S蛋白整體的構(gòu)象變化，從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜的融合。S1蛋白的構(gòu)象變化會導(dǎo)致S2亞基的暴露和激活。S2亞基包含多個保守的結(jié)構(gòu)域，如融合肽（FP）、七肽重復(fù)序列1（HR1）、七肽重復(fù)序列2（HR2）等。在S1蛋白與受體結(jié)合引發(fā)的構(gòu)象變化作用下，S2亞基的融合肽能夠插入宿主細(xì)胞膜，然后通過HR1和HR2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，形成一個穩(wěn)定的六螺旋束結(jié)構(gòu)。這個六螺旋束結(jié)構(gòu)能夠拉近病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的距離，最終促使兩者融合，將病毒的核衣殼釋放到宿主細(xì)胞內(nèi)，完成病毒的感染過程。S1蛋白還可能在病毒的免疫逃逸過程中發(fā)揮作用。由于S1蛋白是病毒表面的主要抗原蛋白，宿主免疫系統(tǒng)會針對它產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而，病毒為了逃避宿主的免疫攻擊，S1蛋白可能會發(fā)生突變，改變其抗原表位。這些突變可能使得宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的中和抗體無法有效識別和結(jié)合S1蛋白，從而導(dǎo)致病毒能夠繼續(xù)感染宿主細(xì)胞。一些研究發(fā)現(xiàn)，HCoV-229E在長期的傳播過程中，S1蛋白的RBD區(qū)域會出現(xiàn)一些氨基酸突變，這些突變可能影響了病毒與中和抗體的結(jié)合能力，使得病毒能夠在宿主群體中持續(xù)傳播。2.2.3S1蛋白作為疫苗和診斷靶點的潛力S1蛋白由于其在病毒感染過程中的關(guān)鍵作用以及獨特的抗原性，具有作為疫苗和診斷靶點的巨大潛力。從疫苗研發(fā)的角度來看，S1蛋白是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的重要靶點。當(dāng)機體接種含有S1蛋白的疫苗后，免疫系統(tǒng)會識別S1蛋白的抗原表位，激活B細(xì)胞產(chǎn)生特異性的中和抗體。這些中和抗體能夠與S1蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而阻止病毒進入細(xì)胞，達(dá)到預(yù)防病毒感染的目的。多項動物實驗已經(jīng)證實了基于S1蛋白的疫苗的有效性。例如，將重組表達(dá)的HCoV-229ES1蛋白免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的中和抗體，這些抗體能夠有效中和HCoV-229E病毒，保護小鼠免受病毒的感染。與其他病毒蛋白相比，S1蛋白作為疫苗靶點具有優(yōu)勢。它位于病毒表面，容易被免疫系統(tǒng)識別，能夠激發(fā)強烈的免疫反應(yīng)。而且，S1蛋白的RBD區(qū)域是病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，針對RBD區(qū)域設(shè)計的疫苗能夠更有效地阻斷病毒的感染途徑。在疾病診斷方面，S1蛋白也具有重要的應(yīng)用價值。由于S1蛋白是病毒的特異性蛋白，感染HCoV-229E的患者體內(nèi)會產(chǎn)生針對S1蛋白的抗體?；谶@一原理，可以開發(fā)基于S1蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）等診斷方法。在ELISA檢測中，將重組S1蛋白包被在微孔板上，加入待檢測的血清樣本，如果樣本中含有針對S1蛋白的抗體，就會與包被的S1蛋白結(jié)合，然后通過加入酶標(biāo)記的二抗和底物顯色，根據(jù)吸光度值判斷樣本是否為陽性。這種檢測方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，能夠快速準(zhǔn)確地診斷HCoV-229E感染。S1蛋白還可以用于開發(fā)即時檢測（POCT）產(chǎn)品，如膠體金免疫層析試紙條等，方便在基層醫(yī)療機構(gòu)或現(xiàn)場進行快速檢測，有助于疫情的早期診斷和防控。三、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇與原理3.1原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢3.1.1高效表達(dá)重組蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)方面具有顯著的高效性。以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為例，它是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)之一。其生長速度極快，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞每20-30分鐘即可分裂一次。這意味著在短時間內(nèi)能夠獲得大量的菌體，為重組蛋白的表達(dá)提供了充足的生物量基礎(chǔ)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，通常選用強啟動子來驅(qū)動重組蛋白的表達(dá)。例如，T7啟動子是原核表達(dá)系統(tǒng)中最高效的啟動子之一，它來源于噬菌體，專一與T7啟動子結(jié)合的T7RNA聚合酶被整合在宿主菌（如BL21(DE3)）的基因組中。當(dāng)受到誘導(dǎo)時，T7RNA聚合酶開始表達(dá)并結(jié)合在T7啟動子上，啟動重組蛋白的表達(dá)。T7RNA聚合酶的活性極高，轉(zhuǎn)錄速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，使得下游的重組蛋白能夠得到高效表達(dá)，其產(chǎn)率可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的50%以上。這種高效的表達(dá)能力，能夠在短時間內(nèi)獲得大量的目的重組蛋白，滿足后續(xù)研究和應(yīng)用對蛋白量的需求。原核表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程緊密耦聯(lián)。在原核生物中，由于沒有核膜的分隔，轉(zhuǎn)錄和翻譯可以同時進行。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA后，核糖體能夠迅速結(jié)合到mRNA上開始翻譯過程，這種高效的轉(zhuǎn)錄-翻譯偶聯(lián)機制，大大提高了重組蛋白的合成效率，減少了中間環(huán)節(jié)的時間損耗，使得原核表達(dá)系統(tǒng)能夠在較短的時間內(nèi)完成大量重組蛋白的表達(dá)。3.1.2操作簡便與成本效益原核表達(dá)系統(tǒng)的操作流程相對簡便，易于掌握和實施。在基因克隆和載體構(gòu)建方面，原核表達(dá)載體已經(jīng)發(fā)展得較為完善，有多種質(zhì)粒可供選擇，如pET系列、pGEX系列、pMAL系列等。這些載體通常具有多個便于外源基因插入的多克隆位點，并且?guī)в泻Y選標(biāo)記（如抗生素抗性基因），便于篩選陽性克隆。以pET系列載體為例，它利用強T7啟動子或T7lac啟動子，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（如大腸桿菌BL21(DE3)）后，在誘導(dǎo)物IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）的誘導(dǎo)下，幾個小時內(nèi)就可以大量表達(dá)外源基因。其構(gòu)建過程相對簡單，只需要通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將目的基因插入到載體的多克隆位點即可。在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時，常用的大腸桿菌等原核細(xì)胞很容易通過熱激轉(zhuǎn)化或電轉(zhuǎn)化等方法導(dǎo)入外源基因。例如，熱激轉(zhuǎn)化法只需將感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒在冰上混合，然后短暫加熱至42℃左右，再迅速放回冰上，即可使質(zhì)粒進入細(xì)胞內(nèi)。這種操作方法簡單易行，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)，即使是初學(xué)者也能夠快速掌握。原核表達(dá)系統(tǒng)的成本效益也非常顯著。從培養(yǎng)基方面來看，原核細(xì)胞通?？梢栽诤唵吻伊畠r的培養(yǎng)基中生長，如LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，其主要成分包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉等，價格相對較低。與真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（如哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)）需要使用富含多種生長因子和營養(yǎng)成分的復(fù)雜培養(yǎng)基相比，原核表達(dá)系統(tǒng)在培養(yǎng)基成本上具有明顯優(yōu)勢。在誘導(dǎo)劑方面，原核表達(dá)系統(tǒng)常用的誘導(dǎo)劑IPTG價格相對便宜，而且使用量較少。例如，在一般的表達(dá)實驗中，IPTG的終濃度通常在0.1-1mM之間，這進一步降低了表達(dá)成本。原核表達(dá)系統(tǒng)不需要昂貴的培養(yǎng)設(shè)備和嚴(yán)格的培養(yǎng)條件。它可以在普通的搖瓶中進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度等要求相對寬松，不需要像哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)那樣需要嚴(yán)格控制CO?濃度等條件。這使得原核表達(dá)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)時，能夠有效降低設(shè)備投入和運行成本。3.1.3適合大規(guī)模生產(chǎn)原核表達(dá)系統(tǒng)非常適合大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，這主要得益于其自身的諸多特點。首先，原核細(xì)胞生長速度快，如前文所述，大腸桿菌在適宜條件下每20-30分鐘即可分裂一次。這使得在大規(guī)模培養(yǎng)時，能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量的菌體，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。通過發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)，可以實現(xiàn)原核細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。在發(fā)酵罐中，可以精確控制培養(yǎng)基的成分、溫度、pH值、溶氧等條件，為細(xì)胞的生長和重組蛋白的表達(dá)提供最適宜的環(huán)境。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，大腸桿菌的細(xì)胞密度可以達(dá)到很高的水平，進而顯著提高重組蛋白的產(chǎn)量。例如，一些工業(yè)生產(chǎn)中，通過連續(xù)發(fā)酵等技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)原核細(xì)胞的持續(xù)高密度培養(yǎng)，不斷產(chǎn)生大量的重組蛋白。原核表達(dá)系統(tǒng)的遺傳背景相對簡單，易于進行遺傳操作和調(diào)控。研究人員可以通過對表達(dá)載體和宿主菌的改造，優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)過程。例如，通過改變啟動子的強度、添加增強子序列、優(yōu)化密碼子等方法，提高重組蛋白的表達(dá)水平和穩(wěn)定性?？梢酝ㄟ^共表達(dá)分子伴侶等方式，解決重組蛋白在表達(dá)過程中可能出現(xiàn)的包涵體和折疊錯誤等問題，提高蛋白的可溶性和活性。這些遺傳操作和調(diào)控手段，使得原核表達(dá)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)時，能夠更加靈活地應(yīng)對各種需求，生產(chǎn)出高質(zhì)量的重組蛋白。原核表達(dá)系統(tǒng)在下游處理過程中也具有優(yōu)勢。原核細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對簡單，易于破碎。通過超聲破碎、高壓勻漿等方法，可以有效地將細(xì)胞破碎，釋放出重組蛋白。而且，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白通常以包涵體或可溶性蛋白的形式存在，這兩種形式都有相對成熟的純化方法。對于包涵體形式的蛋白，可以通過變性-復(fù)性的方法進行純化；對于可溶性蛋白，可以采用親和層析、離子交換層析等多種層析技術(shù)進行純化。這些純化方法操作相對簡便，能夠高效地從復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中分離和純化出高純度的重組蛋白，滿足大規(guī)模生產(chǎn)對蛋白純度的要求。3.2常用的原核表達(dá)菌株與載體3.2.1大腸桿菌表達(dá)菌株的特性在原核表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌是最常用的表達(dá)宿主菌株，其具有多種不同特性的菌株類型，以滿足不同的表達(dá)需求。BL21系列菌株是原核表達(dá)中應(yīng)用極為廣泛的一類菌株。其中，BL21(DE3)基因型為F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）。它的主要特點是用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，IPTG與lacI阻遏蛋白結(jié)合，解除其對T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄的抑制，使得T7RNA聚合酶得以表達(dá)并結(jié)合到T7啟動子上，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于T7RNA聚合酶的活性極高，轉(zhuǎn)錄速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍，因此能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)，適合表達(dá)非毒性蛋白。例如，在表達(dá)一些具有生物活性的酶類時，BL21(DE3)可以在較短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的目的蛋白，滿足后續(xù)的研究和應(yīng)用需求。BL21(DE3)pLysS菌株則含有質(zhì)粒pLysS，具有氯霉素抗性。pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能夠降解T7RNA聚合酶，從而降低目的基因在未誘導(dǎo)時的背景表達(dá)水平，但在IPTG誘導(dǎo)下，又不會干擾目的蛋白的正常表達(dá)。這種菌株特別適合表達(dá)毒性蛋白，因為它可以有效避免在表達(dá)過程中，毒性蛋白對宿主菌生長造成過大的影響，保證宿主菌在表達(dá)前期能夠正常生長和繁殖。DH5α菌株的基因型為F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1。它是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?。在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，其φ80dlacZΔM15基因的表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α-互補。在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，重組菌株由于β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因打斷，無法實現(xiàn)α-互補，菌落呈現(xiàn)白色；而未重組的菌株則可以實現(xiàn)α-互補，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。通過這種藍(lán)白斑篩選方法，可以方便地鑒別重組菌株。recA1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。雖然DH5α主要用于質(zhì)?？寺。谀承┣闆r下也可以用于蛋白表達(dá)，不過其表達(dá)效率和對蛋白表達(dá)的調(diào)控能力相對BL21系列菌株較弱。Rosetta系列菌株是為了解決大腸桿菌在表達(dá)真核基因時，由于密碼子偏愛性導(dǎo)致的表達(dá)問題而開發(fā)的。例如，Rosetta(DE3)菌株補充了大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的tRNA。當(dāng)表達(dá)含有較多稀有密碼子的真核基因時，Rosetta(DE3)能夠提高外源基因的表達(dá)水平。它可以與pET系列等表達(dá)載體配合使用，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白。對于一些真核來源的蛋白，如某些哺乳動物的細(xì)胞因子，在其他菌株中表達(dá)量很低，但在Rosetta(DE3)中能夠?qū)崿F(xiàn)較好的表達(dá)。Origami系列菌株，如Origami2(DE3)，其主要特點是能夠顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性及活性表達(dá)。蛋白質(zhì)中的二硫鍵對于維持蛋白的正確折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要。一些蛋白在表達(dá)過程中需要形成二硫鍵才能具有生物活性，而大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)通常是還原性環(huán)境，不利于二硫鍵的形成。Origami2(DE3)通過對菌株內(nèi)的一些基因進行改造，改變了細(xì)胞質(zhì)的氧化還原環(huán)境，使得蛋白在表達(dá)過程中更容易形成正確的二硫鍵，從而提高了蛋白的可溶性和活性。在表達(dá)一些需要二硫鍵維持結(jié)構(gòu)的抗體片段或酶時，Origami2(DE3)能夠發(fā)揮重要作用。3.2.2表達(dá)載體的種類與選擇原核表達(dá)載體種類繁多，不同類型的表達(dá)載體具有各自獨特的特點，在選擇時需要綜合考慮多種因素。pET系列載體是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)載體之一。它以T7啟動子為核心，具有高表達(dá)水平的顯著優(yōu)勢。T7啟動子來源于噬菌體，專一與T7啟動子結(jié)合的T7RNA聚合酶被整合在宿主菌（如BL21(DE3)）的基因組中。當(dāng)受到IPTG誘導(dǎo)時，T7RNA聚合酶開始表達(dá)并結(jié)合在T7啟動子上，啟動重組蛋白的表達(dá)。T7RNA聚合酶的活性極高，使得下游的重組蛋白能夠得到高效表達(dá)，其產(chǎn)率可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白量的50%以上。pET系列載體有多種不同的亞型，如pET-28a、pET-30a等，它們帶有不同的融合標(biāo)簽和篩選標(biāo)記。以pET-28a為例，其帶有His-tag標(biāo)簽，便于使用鎳柱進行親和層析純化。在構(gòu)建重組表達(dá)載體時，將目的基因插入到pET-28a的多克隆位點，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)等宿主菌中，在IPTG誘導(dǎo)下，就可以大量表達(dá)帶有His-tag標(biāo)簽的重組蛋白。該系列載體還具有調(diào)控精確的優(yōu)點，通過加入誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和時間，可以精確調(diào)控基因的表達(dá)。pET系列載體有多種載體-宿主菌組合可供選擇，并且有不同的融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置，還包含可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌，能滿足不同的實驗需求。pGEX系列載體利用tac啟動子，在tac啟動子和多克隆位點之間插入了谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因以及編碼凝血蛋白酶或者FactorXa因子切割位點的序列。當(dāng)外源基因表達(dá)時，會表達(dá)出編碼GST標(biāo)簽、目的蛋白和切割位點的融合蛋白。GST標(biāo)簽可以與谷胱甘肽樹脂特異性結(jié)合，便于使用親和層析進行純化。在純化后，可以用凝血蛋白酶或者FactorXa因子切割融合蛋白，去除GST標(biāo)簽。該系列載體上還有一個lacIq基因，能夠表達(dá)更多的阻遏蛋白以實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控，降低本底表達(dá)。對于一些難溶性蛋白的表達(dá)，GST標(biāo)簽有助于增加外源蛋白的溶解度，提高蛋白的穩(wěn)定性和可操作性。但GST標(biāo)簽相對較大，可能會對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定影響，在某些對蛋白純度要求極高的實驗中，去除標(biāo)簽的步驟可能會增加操作復(fù)雜性和時間成本。pMAL系列表達(dá)載體利用強tac啟動子，含有一個malE基因（編碼麥芽糖結(jié)合蛋白），能與外源蛋白形成融合蛋白。在這兩個編碼序列之間有切割位點，便于在純化時使用FactorXa或者凝集素蛋白酶等將外源蛋白從融合蛋白中切割下來。它還含有一個LacZ基因，利用外源基因插入失活的特點，可以進行藍(lán)白斑篩選。這種載體可以使外源蛋白在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)可以促進二硫鍵的形成，利于蛋白質(zhì)的正確折疊。在表達(dá)一些需要正確折疊和具有生物活性的蛋白時，pMAL系列載體具有一定的優(yōu)勢。在本研究中，選擇表達(dá)載體主要考慮了以下依據(jù)。由于本研究的目的是高效表達(dá)冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段，需要載體具有較高的表達(dá)水平。pET系列載體以其高效的T7啟動子系統(tǒng)，能夠滿足大量表達(dá)S1蛋白片段的需求?？紤]到后續(xù)對表達(dá)蛋白的純化和鑒定，pET系列載體常見的His-tag標(biāo)簽便于使用鎳柱進行親和層析純化，能夠快速、高效地從復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中分離出目的蛋白。而且pET系列載體有多種商業(yè)化的產(chǎn)品可供選擇，其構(gòu)建方法相對成熟，操作較為簡便，有利于實驗的順利進行。綜合以上因素，本研究選擇了pET系列載體中的pET-28a作為表達(dá)載體，用于構(gòu)建HCoV-229ES1蛋白片段的重組表達(dá)載體。3.3原核表達(dá)的基本原理與流程3.3.1基因克隆與載體構(gòu)建基因克隆是原核表達(dá)的關(guān)鍵起始步驟，其核心目的是將編碼冠狀病毒HCoV-229ES1蛋白片段的基因準(zhǔn)確無誤地獲取并插入到合適的表達(dá)載體中，為后續(xù)的蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。首先，獲取目的基因。研究人員可以從已有的HCoV-229E病毒樣本中提取病毒基因組RNA。提取過程通常采用商業(yè)化的RNA提取試劑盒，利用試劑盒中的裂解液裂解病毒顆粒，釋放出RNA，再通過吸附柱、洗滌液和洗脫液等一系列操作，去除雜質(zhì)，獲得高純度的病毒基因組RNA。以提取的病毒基因組RNA為模板，根據(jù)已知的HCoV-229ES1蛋白基因序列，設(shè)計特異性引物。引物的設(shè)計需要考慮多個因素，包括引物的長度、GC含量、Tm值（解鏈溫度）等。一般來說，引物長度在18-25個堿基對左右較為合適，GC含量保持在40%-60%，Tm值盡量接近60℃。上下游引物分別引入合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便后續(xù)與表達(dá)載體進行連接。設(shè)計好引物后，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴增目的基因片段。在RT-PCR反應(yīng)體系中，加入病毒基因組RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）、引物以及緩沖液等成分。首先，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒基因組RNA為模板合成cDNA。然后，以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過PCR擴增反應(yīng)，使目的基因片段得到大量擴增。PCR反應(yīng)通常包括變性、退火和延伸三個步驟，經(jīng)過30-35個循環(huán)后，可獲得足夠量的目的基因片段。選擇合適的表達(dá)載體對于目的基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。在本研究中，選用了pET-28a作為表達(dá)載體。pET-28a載體具有多個優(yōu)勢，它含有強T7啟動子，能夠驅(qū)動目的基因的高效轉(zhuǎn)錄。在T7啟動子下游，有多克隆位點，便于目的基因的插入。該載體還帶有His-tag標(biāo)簽，便于后續(xù)利用鎳柱進行親和層析純化。在構(gòu)建重組表達(dá)載體時，首先用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對pET-28a載體和擴增得到的S1蛋白基因片段進行雙酶切。限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在該位點切割DNA。選擇的限制性內(nèi)切酶需要保證在載體和目的基因片段上具有唯一的酶切位點，以確保酶切的特異性。酶切后的載體和目的基因片段會產(chǎn)生粘性末端或平末端。將酶切后的載體和目的基因片段混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)。DNA連接酶能夠催化載體和目的基因片段的粘性末端或平末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將目的基因片段插入到載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。連接反應(yīng)通常在16℃左右進行過夜，以提高連接效率。構(gòu)建好的重組表達(dá)載體需要進行驗證，以確保目的基因準(zhǔn)確插入且序列正確。常用的驗證方法包括PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定。PCR鑒定是利用載體和目的基因上的特異性引物，對重組表達(dá)載體進行PCR擴增。如果能夠擴增出預(yù)期大小的條帶，則初步說明目的基因可能已成功插入載體。酶切鑒定則是用之前的限制性內(nèi)切酶對重組表達(dá)載體進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物的條帶大小，判斷目的基因是否插入以及插入的方向是否正確。最準(zhǔn)確的驗證方法是測序鑒定，將重組表達(dá)載體送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序結(jié)果與已知的S1蛋白基因序列進行比對，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性，沒有發(fā)生堿基突變、缺失或插入等錯誤。3.3.2轉(zhuǎn)化與篩選陽性克隆將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌株，是實現(xiàn)原核表達(dá)的重要環(huán)節(jié)，這一過程稱為轉(zhuǎn)化。常用的轉(zhuǎn)化方法有熱激轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法。熱激轉(zhuǎn)化法是基于大腸桿菌細(xì)胞膜在溫度變化時通透性改變的原理。首先，制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將大腸桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600值在0.4-0.6之間）。此時的細(xì)胞處于代謝旺盛、生理狀態(tài)良好的時期，對DNA的攝取能力較強。將培養(yǎng)好的菌液置于冰上冷卻10-15分鐘，使細(xì)胞的生理狀態(tài)穩(wěn)定下來。然后，通過離心收集細(xì)胞，棄去上清液，用預(yù)冷的CaCl?溶液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞處于Ca2?的環(huán)境中。Ca2?能夠與細(xì)胞膜上的磷脂分子相互作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加細(xì)胞膜的通透性。將細(xì)胞在冰上放置30分鐘，讓Ca2?充分作用于細(xì)胞膜。在離心管中加入適量的重組表達(dá)載體DNA，輕輕混勻，冰上放置30分鐘，使載體DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。將離心管迅速放入42℃的水浴中熱激90秒，這一過程會使細(xì)胞膜的通透性進一步增大，載體DNA能夠進入細(xì)胞內(nèi)。熱激后，立即將離心管放回冰上冷卻2-3分鐘，使細(xì)胞膜的通透性恢復(fù)正常，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。向離心管中加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、150-200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1小時，讓細(xì)胞恢復(fù)正常的生理狀態(tài)，并表達(dá)載體上的抗生素抗性基因。最后，將菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素，因為pET-28a載體帶有卡那霉素抗性基因）的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在含有抗生素的平板上，只有成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的細(xì)胞才能生長，因為重組表達(dá)載體攜帶的抗生素抗性基因賦予了細(xì)胞對抗生素的抗性。電轉(zhuǎn)化法則是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬間的小孔，使DNA能夠進入細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌細(xì)胞用冰冷的無菌水或低鹽緩沖液多次洗滌，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基成分，然后用冰冷的甘油重懸細(xì)胞，制備成高濃度的感受態(tài)細(xì)胞懸液。將適量的重組表達(dá)載體DNA與感受態(tài)細(xì)胞懸液混合，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)化儀中，設(shè)置合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，如電壓、電容、電阻等。一般來說，電壓在1.8-2.5kV之間，電容在25μF左右，電阻在200Ω左右。施加高壓電脈沖后，細(xì)胞膜上會形成小孔，載體DNA趁機進入細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)后，迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入適量的LB液體培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，在37℃、150-200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)胞恢復(fù)正常的生理狀態(tài)。將菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在轉(zhuǎn)化后的平板上，會生長出許多菌落，這些菌落中可能包含成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的陽性克隆，也可能包含未成功轉(zhuǎn)化的陰性克隆。為了篩選出陽性克隆，需要采用多種方法進行鑒定。菌落PCR是一種快速篩選陽性克隆的方法。從平板上挑取單菌落，接種到含有適量LB液體培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）的PCR管或96孔板中。以菌液為模板，利用載體和目的基因上的特異性引物進行PCR擴增。如果菌落中含有重組表達(dá)載體，那么在PCR擴增后，會得到預(yù)期大小的目的基因片段。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)。如果有條帶出現(xiàn)，則初步判斷該菌落為陽性克隆。酶切鑒定是進一步驗證陽性克隆的方法。從菌落PCR初步鑒定為陽性的克隆中提取重組表達(dá)載體。提取過程通常采用商業(yè)化的質(zhì)粒提取試劑盒，利用試劑盒中的試劑裂解細(xì)胞，釋放出質(zhì)粒DNA，再通過一系列的純化步驟，獲得高純度的重組表達(dá)載體。用之前構(gòu)建重組表達(dá)載體時使用的限制性內(nèi)切酶對提取的重組表達(dá)載體進行酶切。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，觀察酶切條帶的大小和數(shù)量。如果酶切條帶與預(yù)期的結(jié)果一致，即能夠切出目的基因片段和載體片段，且大小與理論值相符，則進一步證明該克隆為陽性克隆。測序鑒定是最準(zhǔn)確的篩選陽性克隆的方法。對于經(jīng)過菌落PCR和酶切鑒定初步確定為陽性的克隆，將提取的重組表達(dá)載體送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序結(jié)果與已知的S1蛋白基因序列進行比對，確保目的基因序列的準(zhǔn)確性，沒有發(fā)生堿基突變、缺失或插入等錯誤。只有經(jīng)過測序驗證的陽性克隆，才能用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實驗。3.3.3誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化誘導(dǎo)表達(dá)是使重組大腸桿菌表達(dá)目的蛋白的關(guān)鍵步驟，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，可以提高S1蛋白片段的表達(dá)量和可溶性。在誘導(dǎo)表達(dá)前，需要對重組大腸桿菌進行培養(yǎng)。將篩選得到的陽性克隆接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌生長至對數(shù)生長期。次日，按照1:100-1:200的比例將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌的OD600值達(dá)到0.4-0.6。此時，細(xì)菌處于生長旺盛的狀態(tài)，適合進行誘導(dǎo)表達(dá)。對于使用pET-28a載體的表達(dá)系統(tǒng)，常用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑。IPTG能夠與載體上的阻遏蛋白（lacI）結(jié)合，解除阻遏蛋白對T7啟動子的抑制作用，從而啟動T7RNA聚合酶的表達(dá)。T7RNA聚合酶能夠特異性地識別并結(jié)合T7啟動子，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使重組大腸桿菌表達(dá)S1蛋白片段。在菌液OD600值達(dá)到0.4-0.6時，加入終濃度為0.1-1mM的IPTG，繼續(xù)在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)4-8小時。不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)時間可能會對S1蛋白片段的表達(dá)量和可溶性產(chǎn)生影響。較低濃度的IPTG（如0.1-0.5mM）可能會減少包涵體的形成，提高蛋白的可溶性，但表達(dá)量可能相對較低。較高濃度的IPTG（如0.5-1mM）可能會提高表達(dá)量，但也可能增加包涵體的形成幾率。誘導(dǎo)時間過短，蛋白表達(dá)量可能不足；誘導(dǎo)時間過長，可能會導(dǎo)致蛋白降解或細(xì)胞生長受到抑制。因此，需要通過實驗優(yōu)化IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，以獲得最佳的表達(dá)效果。除了IPTG濃度和誘導(dǎo)時間外，培養(yǎng)溫度也會對S1蛋白片段的表達(dá)產(chǎn)生影響。在37℃誘導(dǎo)表達(dá)時，蛋白表達(dá)速度較快，但可能會增加包涵體的形成。降低誘導(dǎo)溫度（如16℃-25℃），可以減緩蛋白表達(dá)速度，有利于蛋白的正確折疊，提高蛋白的可溶性。在較低溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，可能需要延長誘導(dǎo)時間，以保證足夠的蛋白表達(dá)量?？梢試L試在不同溫度下進行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)合SDS-PAGE分析，確定最適合S1蛋白片段表達(dá)的溫度條件。蛋白純化是從細(xì)胞裂解液中分離和提純目的蛋白的過程，其目的是獲得高純度的S1蛋白片段，以便進行后續(xù)的鑒定和研究。常用的蛋白純化技術(shù)包括親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等。親和層析是利用目的蛋白與特異性配體之間的親和力進行分離的方法。由于pET-28a載體表達(dá)的S1蛋白片段帶有His-tag標(biāo)簽，因此可以采用鎳柱親和層析進行初步純化。將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組大腸桿菌離心收集，用適量的裂解緩沖液（如含有咪唑、Tris-HCl、NaCl等成分的緩沖液）重懸菌體。通過超聲破碎等方法裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白釋放到裂解液中。將裂解液離心，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。將上清液緩慢通過預(yù)先平衡好的鎳柱，His-tag標(biāo)簽?zāi)軌蚺c鎳柱上的鎳離子特異性結(jié)合，而其他雜蛋白則不與鎳柱結(jié)合，從而被洗脫下來。用含有一定濃度咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，咪唑能夠與His-tag標(biāo)簽競爭結(jié)合鎳離子，當(dāng)咪唑濃度達(dá)到一定程度時，目的蛋白就會從鎳柱上洗脫下來。通過收集洗脫液，可以得到初步純化的S1蛋白片段。離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面的電荷性質(zhì)和電荷量的不同進行分離的方法。蛋白質(zhì)在不同的pH條件下會帶有不同的電荷，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過離子交換層析柱時，帶有相反電荷的蛋白質(zhì)會與層析柱上的離子交換基團結(jié)合，而其他蛋白質(zhì)則不結(jié)合，從而實現(xiàn)分離。根據(jù)S1蛋白片段的等電點（pI），選擇合適的離子交換層析柱，如陰離子交換柱或陽離子交換柱。在合適的緩沖液條件下，將初步純化的S1蛋白片段上樣到離子交換層析柱上，然后用不同濃度的鹽溶液進行梯度洗脫。隨著鹽濃度的增加，與離子交換基團結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)會先被洗脫下來，而與離子交換基團結(jié)合較強的蛋白質(zhì)則需要更高濃度的鹽溶液才能洗脫下來。通過收集不同洗脫峰的蛋白溶液，結(jié)合SDS-PAGE分析，確定含有S1蛋白片段的洗脫峰，進一步提高蛋白的純度。凝膠過濾層析又稱分子篩層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同進行分離的方法。凝膠過濾層析柱中填充有具有一定孔徑的凝膠顆粒，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過層析柱時，分子較小的蛋白質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的內(nèi)部孔隙，而分子較大的蛋白質(zhì)則不能進入，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動。因此，分子較大的蛋白質(zhì)會先從層析柱中洗脫出來，而分子較小的蛋白質(zhì)則會后洗脫出來。將經(jīng)過離子交換層析進一步純化的S1蛋白片段上樣到凝膠過濾層析柱上，用合適的緩沖液進行洗脫。通過收集不同洗脫體積的蛋白溶液，結(jié)合SDS-PAGE分析，確定含有S1蛋白片段的洗脫峰，獲得高純度的S1蛋白片段。在蛋白純化過程中，每一步純化后都需要對蛋白的純度和濃度進行檢測。常用的檢測方法包括SDS-PAGE電泳和Bradford法等。SDS-PAGE電泳可以直觀地觀察蛋白的純度和分子量，與預(yù)期的S1蛋白片段分子量進行對比，判斷蛋白的純度和是否存在降解等情況。Bradford法是利用蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合后顏色變化的原理，通過分光光度計測定吸光度值，從而定量測定蛋白的濃度。通過多次純化和檢測，最終獲得高純度、高濃度的S1蛋白片段，滿足后續(xù)鑒定和研究的需求。四、HCoV-229ES1蛋白片段的原核表達(dá)實驗4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料準(zhǔn)備病毒株與菌株：HCoV-229E病毒株（由[病毒來源機構(gòu)]提供），用于提取病毒基因組RNA，為后續(xù)獲取S1蛋白基因序列提供模板。表達(dá)菌株選用大腸桿菌BL21(DE3)（購自[試劑公司名稱]），該菌株常用于原核表達(dá)，其基因組中整合了T7噬菌體RNA聚合酶基因，能在誘導(dǎo)條件下高效表達(dá)克隆于含有T7啟動子的表達(dá)載體的基因。表達(dá)載體：選用pET-28a表達(dá)載體（購自[試劑公司名稱]），它帶有強T7啟動子，能驅(qū)動目的基因高效轉(zhuǎn)錄；多克隆位點便于目的基因的插入；還含有His-tag標(biāo)簽，利于后續(xù)利用鎳柱進行親和層析純化。工具酶與試劑：限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI（購自[試劑公司名稱]），用于對pET-28a表達(dá)載體和擴增得到的S1蛋白基因片段進行雙酶切，使載體和基因片段產(chǎn)生粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。DNA連接酶（購自[試劑公司名稱]），用于將酶切后的載體和目的基因片段連接起來，構(gòu)建重組表達(dá)載體。培養(yǎng)基與抗生素：LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（自配），用于培養(yǎng)大腸桿菌，其成分包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂（固體培養(yǎng)基時添加）?？敲顾兀ㄙ徸訹試劑公司名稱]），由于pET-28a載體帶有卡那霉素抗性基因，在培養(yǎng)基中添加卡那霉素可用于篩選成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的大腸桿菌。其他試劑：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，購自[試劑公司名稱]），作為誘導(dǎo)劑，能與載體上的阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏蛋白對T7啟動子的抑制作用，從而啟動T7RNA聚合酶的表達(dá)，進而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。質(zhì)粒提取試劑盒（購自[試劑公司名稱]），用于提取重組表達(dá)載體。PCR擴增試劑盒（購自[試劑公司名稱]），用于擴增S1蛋白基因片段。DNAMarker和蛋白Marker（購自[試劑公司名稱]），分別用于在瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷目的DNA片段和蛋白的大小。4.1.2基因序列獲取與分析從NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫中獲取HCoV-229E的全基因組序列，該數(shù)據(jù)庫收錄了大量的生物基因序列信息，具有權(quán)威性和全面性。利用生物信息學(xué)軟件（如DNAMAN、BioEdit等）對獲取的全基因組序列進行分析，通過與已知的冠狀病毒S1蛋白基因序列進行比對，確定HCoV-229ES1蛋白的編碼序列。在比對過程中，這些軟件能夠快速準(zhǔn)確地識別出S1蛋白基因序列在全基因組中的位置和邊界。對S1蛋白基因序列進行深入分析，包括開放閱讀框（ORF）預(yù)測，確定基因的起始密碼子和終止密碼子，明確基因的編碼區(qū)域。分析基因的GC含量，GC含量會影響基因的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率，一般來說，適宜的GC含量有助于基因的穩(wěn)定表達(dá)。預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，通過相關(guān)的結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件（如PSIPRED、SWISS-MODEL等），可以初步了解S1蛋白的空間結(jié)構(gòu)，為后續(xù)研究蛋白的功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。分析蛋白的抗原表位，抗原表位是蛋白質(zhì)中能夠被免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的特定區(qū)域，通過抗原表位預(yù)測軟件（如IEDBAnalysisResource），可以預(yù)測S1蛋白的潛在抗原表位，為疫苗和診斷試劑的開發(fā)提供重要依據(jù)。通過這些分析，有助于深入了解S1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點，為后續(xù)的原核表達(dá)實驗提供理論指導(dǎo)。4.1.3表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)S1蛋白基因序列和pET-28a表達(dá)載體的多克隆位點，設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計時，在上下游引物的5'端分別引入NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便后續(xù)對目的基因和載體進行雙酶切。引物的設(shè)計還需考慮引物的長度、GC含量、Tm值（解鏈溫度）等因素，一般引物長度在18-25個堿基對左右，GC含量保持在40%-60%，Tm值盡量接近60℃。利用PCR擴增試劑盒，以提取的HCoV-229E病毒基因組RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴增S1蛋白基因片段。在RT-PCR反應(yīng)體系中，加入病毒基因組RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）、引物以及緩沖液等成分。首先，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒基因組RNA為模板合成cDNA。然后，以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，通過PCR擴增反應(yīng)，使目的基因片段得到大量擴增。PCR反應(yīng)通常包括變性、退火和延伸三個步驟，經(jīng)過30-35個循環(huán)后，可獲得足夠量的目的基因片段。用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別對擴增得到的S1蛋白基因片段和pET-28a表達(dá)載體進行雙酶切。將酶切后的S1蛋白基因片段和pET-28a表達(dá)載體進行連接反應(yīng)，使用DNA連接酶將兩者連接起來，構(gòu)建重組表達(dá)載體。連接反應(yīng)通常在16℃左右進行過夜，以提高連接效率。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物在冰上混合，然后短暫加熱至42℃左右，再迅速放回冰上，使連接產(chǎn)物進入細(xì)胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落，接種到含有適量LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）的PCR管或96孔板中，進行菌落PCR鑒定。以菌液為模板，利用載體和目的基因上的特異性引物進行PCR擴增。如果菌落中含有重組表達(dá)載體，那么在PCR擴增后，會得到預(yù)期大小的目的基因片段。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)。如果有條帶出現(xiàn)，則初步判斷該菌落為陽性克隆。對菌落PCR初步鑒定為陽性的克隆，提取重組表達(dá)載體，用NdeI和XhoI進行酶切鑒定。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析，觀察酶切條帶的大小和數(shù)量。如果酶切條帶與預(yù)期的結(jié)果一致，即能夠切出目的基因片段和載體片段，且大小與理論值相符，則進一步證明該克隆為陽性克隆。將經(jīng)過菌落PCR和酶切鑒定初步確定為陽性的克隆，提取的重組表達(dá)載體送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序結(jié)果與已知的S1蛋白基因序列進行比對，確保目的基因序列的準(zhǔn)確性，沒有發(fā)生堿基突變、缺失或插入等錯誤。只有經(jīng)過測序驗證的陽性克隆，才能用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實驗。4.2細(xì)菌轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選4.2.1感受態(tài)細(xì)胞的制備采用氯化鈣（CaCl?）法制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。從-80℃冰箱中取出保藏的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少量菌液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板（含卡那霉素）上。將平板倒置，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時，直至長出單菌落。挑取單菌落接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）中，在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌生長至對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)的菌液按照1:100-1:200的比例轉(zhuǎn)接至100mlLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）中，繼續(xù)在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)2-3小時，期間每隔30-40分鐘測定一次菌液的OD600值，直至OD600值達(dá)到0.4-0.6。此時的細(xì)胞處于對數(shù)生長期，生理狀態(tài)良好，對DNA的攝取能力較強。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50ml離心管中，冰上放置10分鐘，使細(xì)胞的生理狀態(tài)穩(wěn)定下來。然后，在4℃、3000g的條件下離心10分鐘，收集細(xì)胞。棄去上清液，用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl?溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞，動作要輕柔，避免損傷細(xì)胞。懸浮后的細(xì)胞冰上放置15-30分鐘，讓Ca2?充分作用于細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的通透性。再次在4℃、3000g的條件下離心10分鐘，收集細(xì)胞。棄去上清液，加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl?溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。將感受態(tài)細(xì)胞懸液分裝成200μl的小份，貯存于-80℃冰箱中，可保存半年。在制備感受態(tài)細(xì)胞過程中，需注意以下事項。所用的器皿，如離心管、移液器槍頭、培養(yǎng)基瓶等，均需經(jīng)過高壓滅菌處理，以防止雜菌污染。整個操作過程需在冰上進行，以維持細(xì)胞的生理狀態(tài)，避免細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變。CaCl?溶液需用最純凈的水配制，并提前預(yù)冷，以保證其有效性。在懸浮細(xì)胞時，動作要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞的活性。從甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液，不要使用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液，以保證細(xì)胞的生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)化效率。4.2.2轉(zhuǎn)化與涂板培養(yǎng)從-80℃冰箱中取出200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。在無菌條件下，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入適量的重組表達(dá)載體DNA（含量不超過50ng，體積不超過10μl），輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，冰上放置30分鐘，使載體DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。將離心管迅速放入42℃的水浴中熱激90秒，這一過程會使細(xì)胞膜的通透性進一步增大，載體DNA能夠進入細(xì)胞內(nèi)。熱激后，立即將離心管放回冰上冷卻3-5分鐘，使細(xì)胞膜的通透性恢復(fù)正常，穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。向離心管中加入1ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、150-200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1小時，讓細(xì)胞恢復(fù)正常的生理狀態(tài)，并表達(dá)載體上的抗生素抗性基因。將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上。涂布時，使用無菌的涂布棒，將菌液均勻地涂布在平板表面。先將涂布棒在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻后再蘸取菌液進行涂布。涂布完成后，將平板正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置平板，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時。在培養(yǎng)過程中，重組大腸桿菌會在平板上生長形成菌落。由于重組表達(dá)載體攜帶卡那霉素抗性基因，只有成功轉(zhuǎn)化了重組表達(dá)載體的細(xì)胞才能在含有卡那霉素的平板上生長，而未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長。在涂布培養(yǎng)過程中，要注意保持操作環(huán)境的無菌，避免雜菌污染平板，影響后續(xù)的篩選結(jié)果。4.2.3陽性克隆的鑒定從涂布培養(yǎng)后的平板上挑取單菌落，接種到含有適量LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素）的PCR管或96孔板中。以菌液為模板，利用載體和目的基因上的特異性引物進行菌落PCR鑒定。在PCR反應(yīng)體系中，加入菌液模板、PCR擴增試劑盒中的TaqDNA聚合酶、dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸）、引物以及緩沖液等成分。PCR反應(yīng)通常包括變性、退火和延伸三個步驟，經(jīng)過30-35個循環(huán)后，可對目的基因片段進行擴增。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在電泳過程中，以DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。將PCR產(chǎn)物與DNAMarker同時上樣到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，在一定的電壓下進行電泳。DNA在電場的作用下會向正極移動，由于不同大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，經(jīng)過一段時間的電泳后，會在凝膠上形成不同位置的條帶。通過觀察PCR產(chǎn)物在凝膠上的條帶位置，與DNAMarker的條帶進行對比，如果出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則初步判斷該菌落為陽性克隆。對于菌落PCR初步鑒定為陽性的克隆，進一步進行酶切鑒定。提取這些克隆中的重組表達(dá)載體，采用商業(yè)化的質(zhì)粒提取試劑盒，利用試劑盒中的試劑裂解細(xì)胞，釋放出質(zhì)粒DNA，再通過一系列的純化步驟，獲得高純度的重組表達(dá)載體。用之前構(gòu)建重組表達(dá)載體時使用的限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI對提取的重組表達(dá)載體進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系中加入重組表達(dá)載體、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等成分，在適宜的溫度下反應(yīng)一段時間。將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，同樣以DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。如果酶切條帶與預(yù)期的結(jié)果一致，即能夠切出目的基因片段和載體片段，且大小與理論值相符，則進一步證明該克隆為陽性克隆。將經(jīng)過菌落PCR和酶切鑒定初步確定為陽性的克隆，提取的重組表達(dá)載體送至專業(yè)的測序公司進行測序。測序公司會采用先進的測序技術(shù)，如Sanger測序或二代測序技術(shù)，對重組表達(dá)載體中的目的基因序列進行測定。將測序結(jié)果與已知的HCoV-229ES1蛋白基因序列進行比對，確保目的基因序列的準(zhǔn)確性，沒有發(fā)生堿基突變、缺失或插入等錯誤。只有經(jīng)過測序驗證的陽性克隆，才能用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實驗。4.3表達(dá)條件的優(yōu)化4.3.1誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度是影響重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，它直接關(guān)系到目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)質(zhì)量。在本研究中，使用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑，探究不同IPTG濃度對S1蛋白片段表達(dá)量的影響，以確定最佳誘導(dǎo)劑濃度。將含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21(DE3)接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌生長至對數(shù)生長期。次日，按照1:100-1:200的比例將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌的OD600值達(dá)到0.4-0.6。此時，將菌液等分為5份，分別加入不同終濃度的IPTG，使其終濃度分別為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1.0mM。在加入IPTG后，繼續(xù)在37℃、200-250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)6小時。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液在4℃、5000g的條件下離心10分鐘，收集菌體。用適量的PBS緩沖液（pH7.4）重懸菌體，然后進行超聲破碎。超聲破碎條件為：功率200W，超聲3秒，間隔5秒，總時間10分鐘。破碎后的菌液在4℃、12000g的條件下離心30分鐘，分別收集上清液（可溶性蛋白部分）和沉淀（包涵體部分）。采用SDS-PAGE電泳對不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的S1蛋白片段進行分析。將收集的上清液和沉淀分別與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。然后