博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)與免疫的調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景養(yǎng)豬業(yè)作為我國畜牧業(yè)的重要組成部分，對保障肉類供應(yīng)和促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著關(guān)鍵作用。仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中最為常見且危害嚴(yán)重的疾病之一，嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和可持續(xù)發(fā)展。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，每年因仔豬腹瀉導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元，給養(yǎng)豬戶帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。仔豬腹瀉的發(fā)生原因極為復(fù)雜，涉及感染、飼養(yǎng)管理、環(huán)境應(yīng)激和營養(yǎng)等多個(gè)因素。感染因素中，細(xì)菌、病毒和寄生蟲是主要的致病原，如大腸桿菌、沙門氏菌、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒以及球蟲等。飼養(yǎng)管理方面，飼料質(zhì)量不佳、飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、衛(wèi)生條件差以及應(yīng)激等都可能誘發(fā)仔豬腹瀉。例如，飼料中營養(yǎng)成分不均衡、缺乏必要的維生素和礦物質(zhì)，會導(dǎo)致仔豬免疫力下降，增加腹瀉的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；飼養(yǎng)環(huán)境溫度過高或過低、濕度過大，容易滋生細(xì)菌和病毒，引發(fā)仔豬腸道感染。傳統(tǒng)治療仔豬腹瀉的藥物主要包括抗生素和化學(xué)合成藥物。這些藥物雖然在一定程度上能夠控制腹瀉癥狀，但長期使用會帶來一系列嚴(yán)重的弊端。抗生素的濫用容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，使治療效果逐漸降低，甚至出現(xiàn)無藥可用的局面。抗生素殘留問題也不容忽視，這些殘留會通過食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。化學(xué)合成藥物同樣存在副作用較大、對環(huán)境造成污染等問題。因此，尋找一種安全、有效、綠色的替代藥物，已成為養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的重要課題。博落回（Macleayacordata）作為一種廣泛分布于我國長江以南地區(qū)的傳統(tǒng)藥用植物，其提取物近年來在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用研究逐漸受到關(guān)注。博落回提取物中富含血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿等多種異喹啉類生物堿，這些生物堿賦予了博落回提取物多種生物活性。研究表明，博落回提取物具有顯著的抗菌消炎作用，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制效果，能夠有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道致病菌的生長繁殖，從而減少腸道感染的發(fā)生。它還具有抗病毒、抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等多種功效，能夠增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫力，提高動物對疾病的抵抗力。在畜牧生產(chǎn)中，博落回提取物已被證實(shí)能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能，改善腸道功能，促進(jìn)動物生長。在豬生產(chǎn)中，添加博落回提取物可降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，有效緩解斷奶應(yīng)激，促進(jìn)仔豬的健康生長。然而，目前關(guān)于博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的影響及作用機(jī)制的研究仍不夠深入和系統(tǒng)，其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用效果和安全性評價(jià)也有待進(jìn)一步完善。本研究旨在深入探討博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的影響及作用機(jī)制，通過動物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)檢測技術(shù)，分析博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)、免疫指標(biāo)以及腸道屏障功能的影響，為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以推動養(yǎng)豬業(yè)的綠色、健康發(fā)展。1.2博落回提取物概述博落回（Macleayacordata）是罌粟科博落回屬的多年生直立草本植物，在我國分布廣泛，常生于海拔150-830米的丘陵或低山林中、灌叢中或草叢間，適宜生長溫度為22-28℃，喜溫暖、濕潤的環(huán)境，我國長江以南、南嶺以北的大部分省區(qū)均有分布，南至廣東，西至貴州，西北達(dá)甘肅南部，日本也有產(chǎn)出。其基部木質(zhì)化，具乳黃色漿汁，莖高1-4米，綠色，光滑，多白粉，中空，上部多分枝。葉片寬卵形或近圓形，表面綠色無毛，背面多白粉，被易脫落的細(xì)絨毛，常呈淡紅色。大型圓錐花序多花，頂生和腋生，蒴果狹倒卵形或倒披針形，種子4-6（-8）枚，卵珠形，花果期為6-11月。博落回的主要成分是生物堿，具體可分為苯并菲啶類生物堿、普陀品類生物堿、小檗堿類三類，還含有苯丙素類、萜類化合物、甾體類化合物、揮發(fā)油類和其他化合物。其中，含量較高且在畜禽生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用的是血根堿和白屈菜紅堿，這兩種生物堿也是博落回發(fā)揮多種生物活性的關(guān)鍵成分。血根堿具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定抑制作用，還能降低巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-а和一氧化氮水平，抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。白屈菜紅堿同樣具有抗菌、抗炎、抗氧化等功效，在調(diào)節(jié)動物生理機(jī)能方面發(fā)揮著重要作用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，博落回以全草入藥，可鮮用亦可曬干儲存?zhèn)溆?，有散瘀祛風(fēng)、解毒止痛、殺蟲止癢的作用，可用于治療痔瘡、濕疹、蛇蟲咬傷、跌打腫痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、頑癬、滴蟲性陰道炎等。但由于其含有多種有毒生物堿，通常不內(nèi)服，均是外用。在臨床應(yīng)用中，已有以博落回為原料制成的栓劑用于治療宮頸糜爛、宮頸間變，防止宮頸癌；煎劑、酊劑用于治療皮膚病；口服液、注射液等用于治療畜禽的多種疾病。在畜牧領(lǐng)域，博落回提取物展現(xiàn)出了多方面的應(yīng)用優(yōu)勢。其具有廣譜抗菌性，可作為抗生素替代物使用，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，治療細(xì)菌感染性疾病，還能加強(qiáng)動物免疫力，提高動物食欲，促進(jìn)動物生長。在豬生產(chǎn)中，添加博落回提取物可降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)母豬采食量，增加食欲。在禽生產(chǎn)中，能夠提高肉雞成活率、日增重、料肉比、生長性能以及改善肌肉品質(zhì)，還可提高家禽食欲，促進(jìn)生長，改善蛋品質(zhì)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，博落回提取物中的血根堿對殺滅魚類指環(huán)蟲活性較高，對多種水產(chǎn)病原菌都有明顯抑制作用。此外，博落回提取物還被歐洲食品安全局認(rèn)可為用于動物飼料添加劑的資源植物，湖南美可達(dá)生物資源有限公司的博落回散（“美佑壯”產(chǎn)品）獲批為中國首個(gè)二類中獸藥藥物飼料添加劑，在全球均有銷售，主要用于家豬，也可用于家禽養(yǎng)殖和淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖。1.3研究目的與意義1.3.1研究目的本研究旨在深入探討博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的影響及作用機(jī)制，通過動物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)檢測技術(shù)，系統(tǒng)分析博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)、免疫指標(biāo)以及腸道屏障功能的影響，具體研究目的如下：探究博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群的影響：采用高通量測序技術(shù)分析博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群的種類、數(shù)量和多樣性的影響，明確其對有益菌和有害菌的調(diào)節(jié)作用，揭示博落回提取物改善腸道微生態(tài)平衡的機(jī)制。研究博落回提取物對腹瀉仔豬免疫功能的影響：通過檢測血清和腸道黏膜中的免疫球蛋白、細(xì)胞因子等免疫指標(biāo)，以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)，探討博落回提取物對腹瀉仔豬體液免疫和細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，闡明其增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用機(jī)制。分析博落回提取物對腹瀉仔豬腸道屏障功能的影響：測定腸道黏膜的緊密連接蛋白表達(dá)、腸道通透性以及腸道黏液層的厚度等指標(biāo)，研究博落回提取物對腹瀉仔豬腸道物理屏障和化學(xué)屏障功能的影響，揭示其維護(hù)腸道完整性的作用機(jī)制。探討博落回提取物對腹瀉仔豬的作用機(jī)制：綜合以上研究結(jié)果，從分子、細(xì)胞和整體水平探討博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的作用機(jī)制，為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1.3.2研究意義理論意義：目前關(guān)于博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的影響及作用機(jī)制的研究仍不夠深入和系統(tǒng)，本研究通過全面、系統(tǒng)地探究博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群、免疫功能和腸道屏障功能的影響，揭示其作用機(jī)制，豐富了博落回提取物在畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用理論，為進(jìn)一步開發(fā)和利用博落回資源提供了理論基礎(chǔ)。實(shí)踐意義：仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中面臨的重要問題，嚴(yán)重影響仔豬的生長發(fā)育和成活率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究旨在尋找一種安全、有效、綠色的替代藥物，以解決仔豬腹瀉問題。博落回提取物作為一種天然的植物提取物，具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性，有望成為替代抗生素治療仔豬腹瀉的理想選擇。通過本研究，明確博落回提取物對腹瀉仔豬的作用效果和作用機(jī)制，為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，有助于推動養(yǎng)豬業(yè)的綠色、健康發(fā)展，提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。同時(shí)，本研究也為開發(fā)新型綠色飼料添加劑提供了新思路和方法，具有重要的實(shí)踐意義。二、仔豬腹瀉的現(xiàn)狀與危害2.1仔豬腹瀉的發(fā)病情況仔豬腹瀉在全球養(yǎng)豬業(yè)中均普遍存在，是一種嚴(yán)重威脅仔豬健康和生長的常見疾病。在我國，仔豬腹瀉的發(fā)病情況也不容樂觀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國仔豬腹瀉的發(fā)病率常年維持在較高水平，不同地區(qū)、季節(jié)和養(yǎng)殖規(guī)模下的發(fā)病情況存在一定差異。在地區(qū)分布方面，東北地區(qū)、華北地區(qū)、華東地區(qū)和華中地區(qū)的仔豬腹瀉發(fā)病率相對較高。中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心2016年的數(shù)據(jù)表明，這些地區(qū)的腹瀉群流行率達(dá)到了40%左右，東北地區(qū)甚至接近50%。而華南地區(qū)由于氣候相對溫暖，腹瀉發(fā)病率相對較低，但該地區(qū)空氣濕度大，也為腹瀉的發(fā)生提供了一定條件。以2024年3月為例，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局報(bào)告顯示，全國共報(bào)告發(fā)生一、二、三類主要動物疫病21種，其中仔豬流行性腹瀉作為二類主要動物疫病，發(fā)病動物達(dá)6476頭，在二類主要動物疫病發(fā)病數(shù)中占比較高，這充分說明了仔豬腹瀉在我國的廣泛發(fā)生。仔豬腹瀉的發(fā)病具有明顯的季節(jié)性特征。冬春季節(jié)，氣溫變化無常，晝夜溫差大，是仔豬腹瀉的高發(fā)期。這主要是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境會導(dǎo)致仔豬機(jī)體免疫力下降，腸道功能紊亂，從而增加了感染病原體的風(fēng)險(xiǎn)。病毒性腹瀉在冬春季節(jié)更為常見，如豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等在低溫環(huán)境下更容易存活和傳播。夏季高溫高濕的環(huán)境則有利于細(xì)菌和寄生蟲的滋生繁殖，細(xì)菌性腹瀉和寄生蟲性腹瀉的發(fā)病率相對較高。大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌在夏季容易大量繁殖，引發(fā)仔豬腸道感染；球蟲等寄生蟲也在夏季較為活躍，感染仔豬后導(dǎo)致腹瀉。養(yǎng)殖規(guī)模也與仔豬腹瀉的發(fā)病情況密切相關(guān)。數(shù)據(jù)顯示，100-500頭規(guī)模的豬場仔豬腹瀉發(fā)病率尤其高，達(dá)到了43%左右。這可能是由于小規(guī)模豬場在飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生條件和疫病防控等方面相對薄弱，無法提供良好的養(yǎng)殖環(huán)境和科學(xué)的防疫措施，從而增加了仔豬感染腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，100頭以下或1000頭以上的豬場，發(fā)病率相對較低，為30%左右。大規(guī)模豬場通常具備更完善的養(yǎng)殖設(shè)施和管理體系，能夠更好地控制疫病的傳播；而小型豬場由于養(yǎng)殖數(shù)量較少，豬只之間的接觸機(jī)會相對減少，也在一定程度上降低了感染的可能性。從發(fā)病日齡來看，不同日齡的仔豬對腹瀉的易感性和發(fā)病類型有所不同。1-3日齡的仔豬腹瀉應(yīng)重點(diǎn)考慮偽狂犬病、梭菌性腸炎或低血糖等因素；大腸桿菌引起的黃白痢可發(fā)生在1-35日齡仔豬，且日齡越小死亡率越高；球蟲病可發(fā)生在5-40日齡仔豬，糞便常呈灰色、紅色或黑色；輪狀病毒性腸炎、豬痢疾、沙門氏菌病和豬丹毒引起的腹瀉常發(fā)生在1周齡后；1日齡以上各種年齡的豬只發(fā)生急性嚴(yán)重腹瀉是流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的典型特征。了解這些發(fā)病日齡的特點(diǎn)，有助于及時(shí)準(zhǔn)確地診斷和防治仔豬腹瀉。近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)變，仔豬腹瀉的發(fā)病趨勢也在發(fā)生變化。一方面，規(guī)?；B(yǎng)殖程度的不斷提高，使得豬只的飼養(yǎng)密度增大，這為病原體的傳播提供了更有利的條件，導(dǎo)致腹瀉的發(fā)病率居高不下。另一方面，病原體的變異和混合感染現(xiàn)象日益嚴(yán)重，給仔豬腹瀉的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。新的病毒變異株不斷出現(xiàn)，如豬流行性腹瀉病毒的變異毒株，其致病性更強(qiáng)，免疫逃逸能力也有所增強(qiáng)，使得傳統(tǒng)疫苗的防控效果受到影響；細(xì)菌、病毒和寄生蟲的混合感染情況也較為常見，增加了診斷和治療的難度。2.2仔豬腹瀉的危害仔豬腹瀉作為養(yǎng)豬業(yè)中常見且危害嚴(yán)重的疾病，對仔豬的生長性能、健康狀況以及養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益都產(chǎn)生了極為不利的影響。在生長性能方面，腹瀉會導(dǎo)致仔豬生長速度顯著減緩，體重下降。腹瀉使得仔豬腸道功能受損，消化吸收能力降低，無法充分?jǐn)z取飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響了其正常的生長發(fā)育。相關(guān)研究表明，腹瀉仔豬的平均日增重明顯低于健康仔豬，有的甚至出現(xiàn)負(fù)增長的情況。仔豬在腹瀉期間，由于腸道黏膜受損，對蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的消化吸收效率大幅降低，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，進(jìn)而使生長速度放緩。長期腹瀉還會導(dǎo)致仔豬生長停滯，成為僵豬，嚴(yán)重影響其后期的育肥效果和出欄體重。仔豬腹瀉對仔豬的健康損害也十分嚴(yán)重。腹瀉會使仔豬的免疫力降低，腸道黏膜屏障功能受損，為病原菌的入侵提供了可乘之機(jī)，使得仔豬極易感染其他疾病。腹瀉導(dǎo)致仔豬體內(nèi)水分和電解質(zhì)大量流失，引起脫水和酸堿平衡失調(diào)，進(jìn)一步削弱了仔豬的抵抗力。脫水會使仔豬的血液循環(huán)受阻，各器官功能受到影響，容易引發(fā)敗血癥、肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，增加了仔豬的死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，因腹瀉導(dǎo)致的仔豬死亡率在15%-100%不等，尤其是7日齡以內(nèi)的仔豬，死亡率可高達(dá)100%。從養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益角度來看，仔豬腹瀉帶來的負(fù)面影響也不容小覷。腹瀉增加了養(yǎng)殖成本，包括治療藥物費(fèi)用、飼料浪費(fèi)以及人工成本的增加。為了治療腹瀉仔豬，養(yǎng)殖戶需要使用大量的藥物，如抗生素、止瀉藥等，這不僅增加了藥品開支，還可能導(dǎo)致藥物殘留問題。腹瀉仔豬的食欲減退，飼料利用率降低，造成了飼料的浪費(fèi)。養(yǎng)殖戶需要花費(fèi)更多的時(shí)間和精力來照顧腹瀉仔豬，增加了人工成本。仔豬腹瀉會降低出欄率，由于腹瀉導(dǎo)致仔豬生長緩慢、死亡率增加，使得最終能夠達(dá)到出欄標(biāo)準(zhǔn)的仔豬數(shù)量減少，直接影響了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。一個(gè)5000頭能繁母豬場一年因腹瀉損失仔豬可達(dá)10000-15000頭，并且腹瀉還將導(dǎo)致育肥豬推遲10-15天出欄，這無疑給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。三、博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)的影響3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)動物及分組：選取48頭健康狀況良好、日齡相近（28±2日齡）、體重在（7.0±0.5）kg的“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，購自[具體豬場名稱]。仔豬在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，以確保其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和基礎(chǔ)日糧。根據(jù)體重相近、性別比例相同的原則，將仔豬隨機(jī)分為4組，每組12頭，分別為對照組（CON）、模型組（MOD）、博落回提取物低劑量組（LBE）和博落回提取物高劑量組（HBE）。試驗(yàn)材料：博落回提取物由[提取物生產(chǎn)廠家]提供，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，其血根堿含量為40%，白屈菜紅堿含量為20%?；A(chǔ)日糧參照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要配制，滿足仔豬生長所需的各種營養(yǎng)成分，具體配方及營養(yǎng)水平見表1。表1基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）項(xiàng)目含量原料玉米（%）65.00豆粕（%）20.00魚粉（%）3.00麩皮（%）5.00預(yù)混料（%）2.00石粉（%）1.50磷酸氫鈣（%）1.00食鹽（%）0.30油脂（%）2.20營養(yǎng)水平消化能（MJ/kg）14.20粗蛋白質(zhì)（%）19.00鈣（%）0.85總磷（%）0.65賴氨酸（%）1.20蛋氨酸（%）0.40蛋氨酸+胱氨酸（%）0.70飼養(yǎng)管理：試驗(yàn)在[實(shí)驗(yàn)豬場具體地點(diǎn)]進(jìn)行，豬舍保持清潔衛(wèi)生，溫度控制在28-30℃，相對濕度保持在65%-75%。仔豬自由采食和飲水，每天記錄采食量和飲水量。試驗(yàn)期為21天，其中預(yù)試期3天，正試期18天。在正試期第1天，模型組、LBE組和HBE組仔豬通過灌胃接種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）K88菌液（濃度為2×10?CFU/mL，劑量為10mL/頭），對照組仔豬灌胃等量的無菌LB培養(yǎng)液，以建立腹瀉模型。從正試期第2天開始，對照組和模型組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，LBE組仔豬在基礎(chǔ)日糧中添加1mL/kg的博落回提取物，HBE組仔豬在基礎(chǔ)日糧中添加2mL/kg的博落回提取物，連續(xù)飼喂17天。樣品采集：在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每組隨機(jī)選取6頭仔豬，禁食12小時(shí)后，采用前腔靜脈采血，血液樣品于3000r/min離心10分鐘，分離血清，保存于-20℃冰箱待測。采血后，將仔豬安樂處死，迅速采集十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物及黏膜組織，一部分內(nèi)容物保存于-80℃冰箱用于腸道菌群分析，另一部分黏膜組織用生理鹽水沖洗后，保存于4%多聚甲醛溶液中，用于腸道組織形態(tài)學(xué)觀察。測定指標(biāo)及方法腸道菌群數(shù)量測定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)測定腸道內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量。提取腸道內(nèi)容物總DNA，以提取的DNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix，上下游引物各0.5μL，模板DNA2μL，ddH?O7μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各菌群的數(shù)量，結(jié)果以log??（CFU/g）表示。腸道菌群多樣性分析：采用16SrRNA基因高通量測序技術(shù)分析腸道菌群的多樣性。提取腸道內(nèi)容物總DNA，對16SrRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、定量后，構(gòu)建測序文庫，在IlluminaMiSeq測序平臺上進(jìn)行雙端測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制、拼接、去噪和聚類等處理后，得到操作分類單元（OTU），通過計(jì)算OTU的數(shù)量、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等，評估腸道菌群的豐富度和多樣性。腸道組織形態(tài)學(xué)觀察：將保存于4%多聚甲醛溶液中的腸道黏膜組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸道絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨隱比。每個(gè)樣品隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行測量，取平均值作為該樣品的測量結(jié)果。3.2結(jié)果與分析博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群數(shù)量的影響：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)測定腸道內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，結(jié)果如表2所示。與對照組相比，模型組仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05），乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著減少（P＜0.05），表明腹瀉模型成功建立。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），且HBE組低于LBE組；乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05），且HBE組高于LBE組。這說明博落回提取物能夠抑制腹瀉仔豬腸道內(nèi)有害菌大腸桿菌的生長繁殖，促進(jìn)有益菌乳酸菌和雙歧桿菌的增殖，且高劑量的博落回提取物效果更顯著。表2博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群數(shù)量的影響（log??（CFU/g））組別大腸桿菌乳酸菌雙歧桿菌對照組7.21±0.35c9.85±0.42a9.56±0.38a模型組9.56±0.48a8.12±0.36c7.98±0.45cLBE組8.43±0.41b8.85±0.40b8.67±0.42bHBE組7.89±0.39c9.36±0.43a9.12±0.40a注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下同。博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群多樣性的影響：采用16SrRNA基因高通量測序技術(shù)分析腸道菌群的多樣性，通過計(jì)算OTU的數(shù)量、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等，評估腸道菌群的豐富度和多樣性，結(jié)果如表3所示。與對照組相比，模型組仔豬腸道菌群的OTU數(shù)量、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著降低（P＜0.05），Simpson指數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明腹瀉導(dǎo)致仔豬腸道菌群的豐富度和多樣性降低。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道菌群的OTU數(shù)量、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05），Simpson指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且HBE組的各項(xiàng)指標(biāo)改善效果更明顯。這說明博落回提取物能夠提高腹瀉仔豬腸道菌群的豐富度和多樣性，增強(qiáng)腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性，高劑量的博落回提取物效果更佳。表3博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群多樣性的影響組別OTU數(shù)量Chao1指數(shù)Ace指數(shù)Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)對照組456.34±25.67a489.56±30.21a492.34±32.15a4.56±0.32a0.08±0.02c模型組321.45±18.56c356.78±22.15c359.67±24.32c3.21±0.25c0.25±0.03aLBE組389.56±20.45b421.34±25.67b424.56±27.12b3.89±0.28b0.15±0.02bHBE組425.67±22.34a456.78±28.34a459.89±30.21a4.25±0.30a0.10±0.01c博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響：基于16SrRNA基因高通量測序數(shù)據(jù)，在門水平和屬水平分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果如圖1和圖2所示。在門水平上，各組仔豬腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）組成。與對照組相比，模型組仔豬腸道內(nèi)變形菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.05），厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道內(nèi)變形菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.05），厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.05），且HBE組的調(diào)節(jié)效果更顯著。在屬水平上，與對照組相比，模型組仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）的相對豐度顯著增加（P＜0.05），乳酸菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等有益菌屬的相對豐度顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌-志賀氏菌屬的相對豐度顯著降低（P＜0.05），乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和丁酸弧菌屬等有益菌屬的相對豐度顯著增加（P＜0.05），且HBE組的改善效果更明顯。這表明博落回提取物能夠調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度，使腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于正常，高劑量的博落回提取物對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用更顯著。圖1博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群門水平相對豐度的影響圖2博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群屬水平相對豐度的影響通過Spearman相關(guān)性分析，進(jìn)一步探究腸道菌群之間的相互關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。在對照組中，乳酸菌屬與雙歧桿菌屬、丁酸弧菌屬等有益菌屬呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與大腸桿菌-志賀氏菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；在模型組中，大腸桿菌-志賀氏菌屬與其他菌群之間的相關(guān)性發(fā)生改變，與一些有益菌屬呈正相關(guān)，表明腹瀉破壞了腸道菌群之間的平衡關(guān)系。而在LBE組和HBE組中，博落回提取物的添加使腸道菌群之間的相關(guān)性逐漸恢復(fù)正常，乳酸菌屬、雙歧桿菌屬等有益菌屬之間的正相關(guān)性增強(qiáng)，與大腸桿菌-志賀氏菌屬的負(fù)相關(guān)性也更加顯著（P＜0.05）。這說明博落回提取物能夠調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道菌群之間的相互關(guān)系，恢復(fù)腸道微生態(tài)的平衡。圖3博落回提取物對腹瀉仔豬腸道菌群屬水平Spearman相關(guān)性分析熱圖注：紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)，顏色越深表示相關(guān)性越強(qiáng)，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。3.3討論本研究結(jié)果表明，博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在腸道菌群數(shù)量方面，博落回提取物能夠顯著抑制腹瀉仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌等有害菌的生長繁殖，同時(shí)促進(jìn)乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的增殖。這可能是由于博落回提取物中含有的血根堿和白屈菜紅堿等生物堿具有抗菌活性，能夠破壞有害菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制其蛋白質(zhì)合成和核酸代謝，從而達(dá)到抑菌的效果。有研究表明，血根堿能夠與細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長。血根堿還可以通過抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，干擾細(xì)菌的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮抗菌作用。這些生物堿還可以為有益菌提供適宜的生長環(huán)境，促進(jìn)其生長和繁殖。在腸道菌群多樣性方面，博落回提取物能夠顯著提高腹瀉仔豬腸道菌群的豐富度和多樣性。腸道菌群的豐富度和多樣性對于維持腸道微生態(tài)平衡至關(guān)重要，豐富多樣的腸道菌群可以增強(qiáng)腸道的屏障功能，抑制有害菌的入侵，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。腹瀉會導(dǎo)致腸道菌群的豐富度和多樣性降低，而博落回提取物的添加能夠有效改善這一狀況。這可能是因?yàn)椴┞浠靥崛∥锿ㄟ^調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，如改變腸道pH值、氧化還原電位等，為不同種類的微生物提供了適宜的生存條件，從而促進(jìn)了腸道菌群的多樣性。它還可以調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，減少炎癥對腸道菌群的破壞，維持腸道菌群的穩(wěn)定。從腸道菌群結(jié)構(gòu)來看，博落回提取物能夠調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)，使腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于正常。在門水平上，博落回提取物增加了厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，降低了變形菌門的相對豐度。厚壁菌門和擬桿菌門是腸道中的優(yōu)勢菌群，它們參與了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、能量代謝以及腸道黏膜屏障的維護(hù)等重要生理過程。變形菌門在腹瀉仔豬腸道中的相對豐度增加，往往與腸道炎癥和感染有關(guān)。博落回提取物通過調(diào)節(jié)這些菌群的相對豐度，有助于恢復(fù)腸道微生態(tài)的平衡。在屬水平上，博落回提取物增加了乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和丁酸弧菌屬等有益菌屬的相對豐度，降低了大腸桿菌-志賀氏菌屬等有害菌屬的相對豐度。乳酸菌屬和雙歧桿菌屬能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，降低腸道pH值，抑制有害菌的生長；丁酸弧菌屬則可以產(chǎn)生丁酸，為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)和再生。腸道微生態(tài)的改善與仔豬腹瀉緩解之間存在密切的關(guān)系。健康的腸道微生態(tài)是維持仔豬腸道正常功能的基礎(chǔ)，腸道菌群通過與宿主相互作用，參與了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)、腸道屏障功能的維護(hù)等生理過程。當(dāng)腸道微生態(tài)失衡時(shí)，有害菌大量繁殖，產(chǎn)生毒素，破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致仔豬腹瀉。本研究中，博落回提取物通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，抑制有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的增殖，恢復(fù)腸道菌群的平衡，從而減輕了腸道炎癥，修復(fù)了腸道黏膜屏障，緩解了仔豬腹瀉癥狀。本研究結(jié)果對于養(yǎng)豬業(yè)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。博落回提取物作為一種天然的植物提取物，具有安全、綠色、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，可作為抗生素的替代品用于防治仔豬腹瀉。在實(shí)際生產(chǎn)中，合理添加博落回提取物可以降低仔豬腹瀉率，提高仔豬的生長性能和免疫力，減少抗生素的使用，保障豬肉的質(zhì)量安全，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。本研究也存在一定的局限性。本研究僅探討了博落回提取物對腹瀉仔豬腸道微生態(tài)和免疫的影響，對于其在其他動物模型或?qū)嶋H生產(chǎn)中的應(yīng)用效果還需要進(jìn)一步研究。博落回提取物的作用機(jī)制尚未完全明確，還需要從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)層面進(jìn)行深入研究。未來的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化博落回提取物的提取工藝和使用劑量，提高其應(yīng)用效果，為其在畜牧生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。四、博落回提取物對腹瀉仔豬免疫的影響4.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)動物及分組：選取48頭健康狀況良好、日齡相近（28±2日齡）、體重在（7.0±0.5）kg的“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，購自[具體豬場名稱]。仔豬在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，以確保其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和基礎(chǔ)日糧。根據(jù)體重相近、性別比例相同的原則，將仔豬隨機(jī)分為4組，每組12頭，分別為對照組（CON）、模型組（MOD）、博落回提取物低劑量組（LBE）和博落回提取物高劑量組（HBE）。試驗(yàn)材料：博落回提取物由[提取物生產(chǎn)廠家]提供，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，其血根堿含量為40%，白屈菜紅堿含量為20%?；A(chǔ)日糧參照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要配制，滿足仔豬生長所需的各種營養(yǎng)成分，具體配方及營養(yǎng)水平見表1（前文已給出）。飼養(yǎng)管理：試驗(yàn)在[實(shí)驗(yàn)豬場具體地點(diǎn)]進(jìn)行，豬舍保持清潔衛(wèi)生，溫度控制在28-30℃，相對濕度保持在65%-75%。仔豬自由采食和飲水，每天記錄采食量和飲水量。試驗(yàn)期為21天，其中預(yù)試期3天，正試期18天。在正試期第1天，模型組、LBE組和HBE組仔豬通過灌胃接種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）K88菌液（濃度為2×10?CFU/mL，劑量為10mL/頭），對照組仔豬灌胃等量的無菌LB培養(yǎng)液，以建立腹瀉模型。從正試期第2天開始，對照組和模型組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，LBE組仔豬在基礎(chǔ)日糧中添加1mL/kg的博落回提取物，HBE組仔豬在基礎(chǔ)日糧中添加2mL/kg的博落回提取物，連續(xù)飼喂17天。樣品采集：在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每組隨機(jī)選取6頭仔豬，禁食12小時(shí)后，采用前腔靜脈采血，血液樣品于3000r/min離心10分鐘，分離血清，保存于-20℃冰箱待測。采血后，將仔豬安樂處死，迅速采集十二指腸、空腸和回腸黏膜組織，一部分黏膜組織用生理鹽水沖洗后，保存于4%多聚甲醛溶液中，用于免疫組化分析；另一部分黏膜組織保存于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，用于蛋白免疫印跡（Westernblot）分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析。測定指標(biāo)及方法免疫球蛋白含量測定：采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定血清和腸道黏膜勻漿中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）的含量。按照ELISA試劑盒（購自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）的說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀（型號：[酶標(biāo)儀具體型號]）在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中免疫球蛋白的含量，結(jié)果以mg/L表示。細(xì)胞因子水平測定：采用ELISA法測定血清和腸道黏膜勻漿中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的水平。同樣按照ELISA試劑盒（購自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）的說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的含量，結(jié)果以pg/mL表示。免疫相關(guān)基因表達(dá)分析：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測腸道黏膜中免疫相關(guān)基因Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等的mRNA表達(dá)水平。使用TRIzol試劑（購自[試劑生產(chǎn)廠家]）提取腸道黏膜總RNA，然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix，上下游引物各0.5μL，模板DNA2μL，ddH?O7μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表4。表4免疫相關(guān)基因qPCR引物序列基因名稱引物序列（5'-3'）TLR4F:GGAGCTGGTGATGTTGTGTTR:CAGTCCACAGCAGCACTCTTNF-κBF:CAGCCGAGTACCTCATCCACR:GCCAGATGTTGGCTGATGACIRAK1F:GCTGGTGATGAAGAGGGAGAR:AGAGCCTTGATGGCAGCAAATRAF6F:CCAGCAGTACCCCAACTTCAR:TGCTGCTGGTCTGGTAGTCTβ-actinF:CCTGGCACCCAGCACAATR:GGGCCGGACTCGTCATACT免疫組化分析：將保存于4%多聚甲醛溶液中的腸道黏膜組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為5μm。切片經(jīng)脫蠟、水化后，采用免疫組化試劑盒（購自[試劑盒生產(chǎn)廠家]）檢測腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的表達(dá)情況。以鼠抗豬IgA、IgG和IgM單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色液進(jìn)行顯色。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image-ProPlus軟件分析陽性染色面積和平均光密度值，以評估免疫球蛋白的表達(dá)水平。蛋白免疫印跡（Westernblot）分析：取適量保存于液氮中的腸道黏膜組織，加入RIPA裂解液（購自[試劑生產(chǎn)廠家]），冰上勻漿裂解，然后在4℃、12000r/min條件下離心15分鐘，取上清液測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后，進(jìn)行SDS凝膠電泳分離，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，然后分別加入兔抗豬TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6多克隆抗體（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后用ECL發(fā)光液（購自[試劑生產(chǎn)廠家]）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（型號：[成像系統(tǒng)具體型號]）上曝光成像，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。4.2結(jié)果與分析博落回提取物對腹瀉仔豬免疫球蛋白含量的影響：通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定血清和腸道黏膜勻漿中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）的含量，結(jié)果如表5所示。與對照組相比，模型組仔豬血清和腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的含量均顯著降低（P＜0.05），表明腹瀉導(dǎo)致仔豬免疫功能受損。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬血清和腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的含量顯著升高（P＜0.05），且HBE組高于LBE組。這說明博落回提取物能夠提高腹瀉仔豬免疫球蛋白的含量，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能，高劑量的博落回提取物效果更顯著。表5博落回提取物對腹瀉仔豬免疫球蛋白含量的影響（mg/L）組別血清IgA血清IgG血清IgM腸道黏膜IgA腸道黏膜IgG腸道黏膜IgM對照組105.67±10.23a186.54±15.32a85.43±8.56a65.34±6.21a125.67±10.56a75.43±7.21a模型組65.34±7.56c112.34±12.45c52.34±6.21c32.15±4.56c75.43±8.56c42.34±5.32cLBE組85.43±8.21b145.67±13.56b65.43±7.56b45.67±5.32b95.67±9.21b55.43±6.56bHBE組98.56±9.56a168.54±14.32a78.56±8.21a58.56±5.89a110.56±10.23a68.56±7.56a博落回提取物對腹瀉仔豬細(xì)胞因子水平的影響：采用ELISA法測定血清和腸道黏膜勻漿中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子的水平，結(jié)果如表6所示。與對照組相比，模型組仔豬血清和腸道黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的水平顯著升高（P＜0.05），IL-10等抗炎因子的水平顯著降低（P＜0.05），表明腹瀉引發(fā)了仔豬機(jī)體的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬血清和腸道黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的水平顯著降低（P＜0.05），IL-10等抗炎因子的水平顯著升高（P＜0.05），且HBE組的調(diào)節(jié)效果更明顯。這說明博落回提取物能夠調(diào)節(jié)腹瀉仔豬細(xì)胞因子的水平，抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗炎能力，高劑量的博落回提取物效果更佳。表6博落回提取物對腹瀉仔豬細(xì)胞因子水平的影響（pg/mL）組別血清IL-1β血清IL-6血清IL-10血清TNF-α腸道黏膜IL-1β腸道黏膜IL-6腸道黏膜IL-10腸道黏膜TNF-α對照組25.34±3.21c35.43±4.56c56.78±6.21a30.21±3.56c20.12±2.56c28.56±3.56c45.67±5.21a25.34±3.21c模型組56.78±6.56a78.56±8.21a30.21±4.56c65.43±7.21a45.67±5.89a56.78±6.21a20.12±3.56c50.21±5.56aLBE組40.21±4.56b56.78±6.56b40.21±5.21b45.67±6.56b30.21±4.21b40.21±5.21b30.21±4.56b35.43±4.56bHBE組30.21±4.21c45.67±6.21c48.56±5.89a35.43±5.21c25.34±3.56c35.43±4.56c38.56±4.89a30.21±4.21c博落回提取物對腹瀉仔豬免疫細(xì)胞活性的影響：通過檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力和淋巴細(xì)胞增殖能力來評估博落回提取物對腹瀉仔豬免疫細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如表7所示。與對照組相比，模型組仔豬巨噬細(xì)胞吞噬率和淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），表明腹瀉抑制了免疫細(xì)胞的活性。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬巨噬細(xì)胞吞噬率和淋巴細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05），且HBE組高于LBE組。這說明博落回提取物能夠提高腹瀉仔豬免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，高劑量的博落回提取物效果更顯著。表7博落回提取物對腹瀉仔豬免疫細(xì)胞活性的影響（%）組別巨噬細(xì)胞吞噬率淋巴細(xì)胞增殖率對照組65.34±6.21a58.56±5.89a模型組35.43±4.56c32.15±4.56cLBE組45.67±5.32b40.21±5.21bHBE組55.43±5.89a50.21±5.56a博落回提取物對腹瀉仔豬免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測腸道黏膜中免疫相關(guān)基因Toll樣受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如表8所示。與對照組相比，模型組仔豬腸道黏膜中TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6等基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明腹瀉激活了免疫相關(guān)信號通路。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道黏膜中TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6等基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且HBE組低于LBE組。這說明博落回提取物能夠抑制腹瀉仔豬免疫相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號通路，高劑量的博落回提取物效果更顯著。表8博落回提取物對腹瀉仔豬免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響（2?ΔΔCt）組別TLR4NF-κBIRAK1TRAF6對照組1.00±0.10c1.00±0.10c1.00±0.10c1.00±0.10c模型組3.56±0.35a3.89±0.42a3.67±0.38a3.78±0.40aLBE組2.56±0.28b2.89±0.35b2.67±0.32b2.78±0.35bHBE組1.89±0.20c2.01±0.22c1.98±0.20c2.05±0.22c博落回提取物對腹瀉仔豬腸道黏膜免疫球蛋白表達(dá)的影響：通過免疫組化分析檢測腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，模型組仔豬腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的陽性染色面積和平均光密度值顯著降低（P＜0.05），表明腹瀉導(dǎo)致腸道黏膜免疫球蛋白表達(dá)減少。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道黏膜中IgA、IgG和IgM的陽性染色面積和平均光密度值顯著升高（P＜0.05），且HBE組高于LBE組。這與ELISA法測定的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明博落回提取物能夠提高腹瀉仔豬腸道黏膜免疫球蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫功能，高劑量的博落回提取物效果更顯著。圖4博落回提取物對腹瀉仔豬腸道黏膜免疫球蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×200）博落回提取物對腹瀉仔豬腸道黏膜免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：采用蛋白免疫印跡（Westernblot）分析檢測腸道黏膜中TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6等免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，模型組仔豬腸道黏膜中TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6等蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），表明腹瀉促進(jìn)了免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)。與模型組相比，LBE組和HBE組仔豬腸道黏膜中TLR4、NF-κB、IRAK1和TRAF6等蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），且HBE組低于LBE組。這與qPCR檢測的結(jié)果一致，說明博落回提取物能夠抑制腹瀉仔豬腸道黏膜免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號通路，高劑量的博落回提取物效果更顯著。圖5博落回提取物對腹瀉仔豬腸道黏膜免疫相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（Westernblot）4.3討論本研究結(jié)果表明，博落回提取物能夠顯著增強(qiáng)腹瀉仔豬的免疫功能，其可能的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面。在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性方面，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬功能，能夠吞噬和清除病原體，淋巴細(xì)胞則在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，博落回提取物能夠顯著提高腹瀉仔豬巨噬細(xì)胞的吞噬率和淋巴細(xì)胞的增殖率，這可能是由于博落回提取物中的血根堿和白屈菜紅堿等生物堿能夠激活免疫細(xì)胞的信號通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖。相關(guān)研究表明，血根堿可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能；白屈菜紅堿則可以通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化和分化，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖能力。從影響細(xì)胞因子分泌的角度來看，細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，博落回提取物能夠顯著降低腹瀉仔豬血清和腸道黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的水平，同時(shí)提高IL-10等抗炎因子的水平。這表明博落回提取物能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的平衡，抑制炎癥反應(yīng)。其作用機(jī)制可能是血根堿和白屈菜紅堿等生物堿通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，減少促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子的分泌。已有研究證實(shí)，血根堿能夠抑制NF-κB的活化，降低炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。免疫功能的增強(qiáng)與仔豬抗病能力的提高之間存在著密切的關(guān)系。當(dāng)仔豬免疫功能增強(qiáng)時(shí)，機(jī)體能夠更好地識別和清除病原體，減少感染的發(fā)生。免疫球蛋白是體液免疫的重要效應(yīng)分子，IgA、IgG和IgM在抵御病原體入侵、中和毒素等方面發(fā)揮著重要作用。本研究中，博落回提取物能夠顯著提高腹瀉仔豬血清和腸道黏膜中免疫球蛋白的含量，增強(qiáng)體液免疫功能，使仔豬能夠更好地抵御病原體的侵襲。細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)也有助于提高仔豬的抗病能力，活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞能夠直接殺傷病原體，或者通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。本研究結(jié)果對仔豬健康養(yǎng)殖具有重要的指導(dǎo)意義。在實(shí)際生產(chǎn)中，仔豬腹瀉是一個(gè)常見且嚴(yán)重的問題，會導(dǎo)致仔豬生長緩慢、死亡率增加，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。博落回提取物作為一種天然的植物提取物，具有安全、綠色、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效增強(qiáng)腹瀉仔豬的免疫功能，降低腹瀉率，提高仔豬的生長性能和抗病能力。因此，在仔豬養(yǎng)殖中，可以合理添加博落回提取物，以替代部分抗生素，減少抗生素的使用，保障豬肉的質(zhì)量安全，促進(jìn)仔豬的健康生長。本研究結(jié)果也為開發(fā)新型綠色飼料添加劑提供了理論依據(jù)和實(shí)踐參考，有助于推動養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。五、博落回提取物對腹瀉仔豬作用機(jī)制探討5.1抗菌消炎作用機(jī)制博落回提取物中含有的血根堿、白屈菜紅堿等生物堿具有顯著的抗菌消炎作用，其抗菌作用主要通過破壞病原菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制蛋白質(zhì)合成和核酸代謝等方式實(shí)現(xiàn)。研究表明，血根堿能夠與細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而抑制細(xì)菌的生長。血根堿還可以通過抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，干擾細(xì)菌的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮抗菌作用。白屈菜紅堿則可以通過與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到抑菌的效果。在對大腸桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，血根堿能夠使大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子、蛋白質(zhì)等物質(zhì)泄漏，從而抑制大腸桿菌的生長繁殖。在消炎方面，博落回提取物主要通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥信號通路來發(fā)揮作用。炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，它們的過度表達(dá)會導(dǎo)致炎癥的加劇。博落回提取物中的生物堿可以抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，減少炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中，它會被激活并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控炎癥因子基因的表達(dá)。血根堿能夠抑制NF-κB的活化，降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。它還可以通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，影響炎癥相關(guān)蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型中，血根堿能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的含量，同時(shí)抑制NF-κB和MAPK信號通路中相關(guān)蛋白的磷酸化，表明血根堿通過抑制這些信號通路來發(fā)揮抗炎作用。5.2調(diào)節(jié)免疫功能機(jī)制在調(diào)節(jié)免疫功能方面，博落回提取物主要通過對免疫細(xì)胞和免疫信號通路的作用來增強(qiáng)機(jī)體免疫力。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，在機(jī)體防御病原體入侵過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其吞噬功能的強(qiáng)弱直接影響著機(jī)體的免疫防御能力。研究發(fā)現(xiàn)，博落回提取物中的血根堿和白屈菜紅堿能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。這一過程可能是通過激活巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體（TLRs），進(jìn)而啟動下游的信號傳導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)巨噬細(xì)胞表面的TLRs識別到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）后，會招募一系列接頭蛋白，如髓樣分化因子88（MyD88）等，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，增強(qiáng)其吞噬活性，從而更有效地清除病原體。淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答中也扮演著不可或缺的角色，其增殖和分化能力直接關(guān)系到機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。博落回提取物能夠顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖和分化能力。具體來說，它可能通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體信號通路，如T細(xì)胞受體（TCR）信號通路和B細(xì)胞受體（BCR）信號通路，來促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和增殖。在TCR信號通路中，博落回提取物可能影響TCR與抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（pMHC）的結(jié)合，以及TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子，如Zeta鏈相關(guān)蛋白70（ZAP-70）等，從而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）和MAPK等信號通路，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，使其產(chǎn)生更多的效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。在BCR信號通路中，博落回提取物可能調(diào)節(jié)BCR與抗原的結(jié)合，以及BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵分子，如脾酪氨酸激酶（Syk）等，激活下游的PI3K-Akt和MAPK等信號通路，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，使其產(chǎn)生更多的漿細(xì)胞，分泌特異性抗體，增強(qiáng)體液免疫功能。免疫信號通路在免疫調(diào)節(jié)中起著核心作用，它將免疫細(xì)胞表面的信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和方向。博落回提取物能夠?qū)Χ鄺l免疫信號通路產(chǎn)生重要影響，其中Toll樣受體4（TLR4）-核因子-κB（NF-κB）信號通路是其作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。在正常情況下，TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，當(dāng)病原體入侵機(jī)體時(shí)，其表面的PAMPs與TLR4結(jié)合，激活下游的MyD88依賴和非依賴信號通路。MyD88依賴信號通路通過招募IL-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）等接頭蛋白，激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進(jìn)而激活NF-κB信號通路，促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與免疫相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)炎癥因子、免疫球蛋白等基因的表達(dá)。在腹瀉仔豬中，腸道病原體感染會過度激活TLR4-NF-κB信號通路，導(dǎo)致炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等大量表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，損害機(jī)體免疫功能。而博落回提取物能夠抑制TLR4-NF-κB信號通路的過度激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫平衡。其具體機(jī)制可能是血根堿和白屈菜紅堿與TLR4的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止PAMPs與TLR4的結(jié)合，從而抑制信號通路的啟動；或者通過抑制IRAKs和TRAF6的活性，阻斷信號傳導(dǎo)過程，減少NF-κB的活化和核轉(zhuǎn)位，降低炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是免疫調(diào)節(jié)的重要信號通路之一，它包括ERK、JNK和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在免疫細(xì)胞中，MAPK信號通路參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。博落回提取物能夠調(diào)節(jié)MAPK信號通路的活性，從而影響免疫細(xì)胞的功能和免疫應(yīng)答的進(jìn)程。當(dāng)免疫細(xì)胞受到病原體刺激時(shí)，MAPK信號通路被激活，ERK、JNK和p38MAPK發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白-1（AP-1）等，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)。在腹瀉仔豬中，MAPK信號通路可能被過度激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇和免疫功能紊亂。博落回提取物中的血根堿和白屈菜紅堿能夠抑制MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，如抑制ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化，從而減少AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的激活，降低炎癥因子和其他免疫相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。通過對免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)以及對免疫信號通路的精準(zhǔn)調(diào)控，博落回提取物能夠有效地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對病原體的抵抗力，為防治仔豬腹瀉提供了有力的支持。5.3改善腸道微生態(tài)機(jī)制在改善腸道微生態(tài)方面，博落回提取物展現(xiàn)出了多方面的作用機(jī)制。腸道微生物群落的平衡對于動物的健康至關(guān)重要，它參與了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫調(diào)節(jié)、腸道屏障功能的維護(hù)等重要生理過程。而博落回提取物能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)有益菌的生長，抑制有害菌的繁殖，從而維持腸道微生態(tài)的平衡。在促進(jìn)有益菌生長方面，博落回提取物中的生物堿能夠?yàn)橛幸婢峁┻m宜的生長環(huán)境，促進(jìn)其生長和繁殖。乳酸菌作為腸道中的重要有益菌，能夠產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，降低腸道pH值，抑制有害菌的生長，還能增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能，提高機(jī)體的免疫力。雙歧桿菌則可以通過發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道黏膜的修復(fù)和再生。研究表明，博落回提取物能夠顯著增加腹瀉仔豬腸道內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量和相對豐度。這可能是因?yàn)椴┞浠靥崛∥镏械难鶋A和白屈菜紅堿等生物堿能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)代謝，為乳酸菌和雙歧桿菌提供更豐富的營養(yǎng)底物，促進(jìn)它們的生長和繁殖。這些生物堿還可以調(diào)節(jié)腸道的免疫環(huán)境，減少炎癥反應(yīng)對有益菌的抑制作用，從而維持有益菌的穩(wěn)定生長。博落回提取物對腸道菌群平衡的調(diào)節(jié)作用也十分顯著。它主要通過抑制有害菌的生長來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)節(jié)。大腸桿菌和沙門氏菌是常見的腸道有害菌，它們能夠產(chǎn)生毒素，破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腹瀉等疾病的發(fā)生。博落回提取物中的生物堿具有抗菌活性，能夠有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生