生化核酸教學課件探索生命的遺傳密碼與分子機制目錄第一章：核酸基礎(chǔ)與結(jié)構(gòu)核酸的定義與分類、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、RNA種類、核酸高級結(jié)構(gòu)、細胞核與核孔復(fù)合物第二章：核酸的功能與代謝DNA復(fù)制機制、轉(zhuǎn)錄過程、RNA加工、核酸修復(fù)機制、病毒核酸特性第三章：核酸技術(shù)與應(yīng)用DNA測序技術(shù)、PCR技術(shù)、基因編輯、核酸芯片、核酸藥物、生物安全與倫理本課件將系統(tǒng)介紹核酸的結(jié)構(gòu)特點、生物學功能及現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用，旨在幫助學生掌握核酸科學的基礎(chǔ)知識和前沿進展，為進一步學習分子生物學和生物技術(shù)奠定堅實基礎(chǔ)。第一章：核酸基礎(chǔ)與結(jié)構(gòu)探索生命的基本構(gòu)件在本章中，我們將深入探討核酸的基本構(gòu)成單位、化學特性、空間結(jié)構(gòu)以及在細胞中的分布與組織形式。通過對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA多樣性的分析，理解核酸如何成為生命信息的載體和遺傳物質(zhì)的本質(zhì)。核酸的定義與分類核酸的基本概念核酸是一類由核苷酸聚合而成的生物大分子，是遺傳信息的儲存、傳遞和表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。核苷酸由三部分組成：含氮堿基、五碳糖和磷酸基團。根據(jù)所含五碳糖的不同，核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA與RNA的基本特點?DNA：含脫氧核糖，堿基為A、T、G、C，通常呈雙鏈結(jié)構(gòu)，主要存在于細胞核內(nèi)?RNA：含核糖，堿基為A、U、G、C，通常呈單鏈結(jié)構(gòu)，在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布在生命活動中的基本作用?遺傳信息的儲存與傳遞：DNA作為遺傳物質(zhì)保存著生物體的全部遺傳信息?蛋白質(zhì)合成的指導：通過DNA→RNA→蛋白質(zhì)的中心法則實現(xiàn)遺傳信息的表達?生物調(diào)控：某些RNA（如miRNA、lncRNA）參與基因表達調(diào)控核酸在細胞中的分布真核細胞：DNA主要存在于細胞核內(nèi)，RNA分布于細胞核和細胞質(zhì)原核細胞：DNA和RNA均位于擬核區(qū)細胞器：線粒體和葉綠體含有少量DNA核酸的發(fā)現(xiàn)歷史1869年：弗里德里?！っ仔獱柺状螐陌准毎蟹蛛x出"核素"1944年：艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)DNA的化學組成與雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA的基本化學組成DNA分子由脫氧核糖核苷酸聚合而成。每個核苷酸包含三個組分：脫氧核糖(deoxyribose)：一種五碳糖，C-2位缺少羥基含氮堿基：包括嘌呤(A、G)和嘧啶(T、C)兩類磷酸基團：連接相鄰核苷酸，形成磷酸二酯鍵堿基配對原則DNA雙鏈中堿基通過氫鍵特異性配對：腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)：形成兩個氫鍵鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)：形成三個氫鍵這種特異性配對確保了DNA復(fù)制和遺傳信息傳遞的精確性。G-C配對比A-T配對更穩(wěn)定，因此GC含量高的DNA片段熔解溫度更高。沃森-克里克雙螺旋模型1953年，沃森和克里克根據(jù)X射線衍射數(shù)據(jù)提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，具有以下特點：反平行鏈：兩條多核苷酸鏈方向相反（一條5'→3'，另一條3'→5'）右手螺旋：常見B型DNA為右手螺旋，每10個堿基對完成一圈主溝與次溝：螺旋結(jié)構(gòu)形成大小不等的溝，是蛋白質(zhì)結(jié)合的重要位點磷酸-糖骨架：位于雙螺旋外側(cè)，堿基朝向內(nèi)側(cè)堆積作用：相鄰堿基間的非共價相互作用，增強結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性DNA雙螺旋模型示意圖DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵特點上圖展示了DNA分子精確的雙螺旋結(jié)構(gòu)，清晰標注了各組成部分：兩條反向平行的多核苷酸鏈纏繞成右手螺旋脫氧核糖和磷酸基團構(gòu)成的骨架位于外側(cè)堿基對位于內(nèi)側(cè)，通過氫鍵連接A-T間形成兩個氫鍵，G-C間形成三個氫鍵每個完整螺旋周期含10個堿基對，上升3.4納米螺旋直徑約為2納米雙螺旋結(jié)構(gòu)的生物學意義DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)完美解決了三個生命根本問題：遺傳信息存儲：堿基序列編碼遺傳信息，四種堿基的排列組合可產(chǎn)生海量信息穩(wěn)定性與完整性：雙鏈結(jié)構(gòu)和多重非共價作用提供了分子穩(wěn)定性，保護遺傳信息信息復(fù)制：互補配對原則為DNA半保留復(fù)制提供了分子基礎(chǔ)，確保遺傳信息準確傳遞信息表達：雙鏈可以局部解開，使模板鏈暴露用于轉(zhuǎn)錄RNA的種類與結(jié)構(gòu)特點信使RNA(mRNA)攜帶DNA編碼的遺傳信息，指導蛋白質(zhì)合成。特點：5'端有7-甲基鳥嘌呤帽子結(jié)構(gòu)（真核細胞）3'端有多聚腺苷酸尾巴（真核細胞）包含編碼區(qū)(CDS)和非編碼區(qū)(UTR)壽命較短，真核mRNA半衰期從數(shù)分鐘到數(shù)天不等轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)將氨基酸運送到核糖體，實現(xiàn)遺傳密碼翻譯。特點：約75-95個核苷酸長度呈獨特的三葉草二級結(jié)構(gòu)L形三級結(jié)構(gòu)，一端有反密碼子，另一端連接特定氨基酸含多種修飾堿基，增強功能與穩(wěn)定性核糖體RNA(rRNA)構(gòu)成核糖體的主要成分，為蛋白質(zhì)合成提供場所。特點：最豐富的RNA類型，占細胞總RNA的80%以上高度保守的序列和復(fù)雜的二級、三級結(jié)構(gòu)真核細胞含28S、18S、5.8S和5S四種主要rRNA具有催化肽鍵形成的核酶活性RNA與DNA的主要區(qū)別糖成分不同：RNA含核糖（2'位有羥基），DNA含脫氧核糖堿基組成不同：RNA含尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)鏈結(jié)構(gòu)不同：RNA通常為單鏈，可形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)；DNA通常為雙鏈穩(wěn)定性不同：RNA中2'羥基使其比DNA更易水解，穩(wěn)定性較低其他重要RNA類型小核RNA(snRNA)：參與mRNA前體的剪接小核仁RNA(snoRNA)：指導rRNA的修飾微小RNA(miRNA)：調(diào)控基因表達的小分子RNA長鏈非編碼RNA(lncRNA)：參與多種調(diào)控過程核酸的高級結(jié)構(gòu)染色質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)染色質(zhì)是真核細胞核內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)及RNA形成的復(fù)合體，是遺傳物質(zhì)的功能單位。其主要組成包括：DNA：人類基因組約30億個堿基對，完全伸展長度約2米組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，富含賴氨酸和精氨酸，包括H1、H2A、H2B、H3和H4非組蛋白：參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持和基因表達調(diào)控的多種蛋白質(zhì)RNA：包括各種非編碼RNA，參與染色質(zhì)組織和調(diào)控染色質(zhì)的多級折疊結(jié)構(gòu)染色質(zhì)通過多級折疊實現(xiàn)DNA的高度壓縮：核小體：基本結(jié)構(gòu)單位，由約146bpDNA纏繞組蛋白八聚體（H2A、H2B、H3、H4各兩個）形成的"珠子"30nm纖維：核小體進一步盤繞形成的螺旋結(jié)構(gòu)，H1組蛋白參與穩(wěn)定染色質(zhì)環(huán)：30nm纖維形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，附著于蛋白質(zhì)骨架染色體：細胞分裂時高度壓縮的染色質(zhì)形態(tài)染色質(zhì)類型與基因表達常染色質(zhì)：松散結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄活躍異染色質(zhì)：高度壓縮，轉(zhuǎn)錄抑制組成型異染色質(zhì)：如著絲粒、端粒區(qū)域兼性異染色質(zhì)：可在不同細胞類型或發(fā)育階段轉(zhuǎn)換表觀遺傳修飾不改變DNA序列但影響基因表達的染色質(zhì)修飾：DNA甲基化：通常抑制基因表達組蛋白修飾：如甲基化、乙?；?、磷酸化等細胞核與核孔復(fù)合物細胞核的結(jié)構(gòu)與組成細胞核是真核細胞最顯著的特征，是遺傳物質(zhì)的主要儲存場所和基因表達的調(diào)控中心。其主要結(jié)構(gòu)包括：核被膜：由內(nèi)、外兩層脂質(zhì)雙分子層膜組成，兩膜間為核周腔核孔復(fù)合物：貫穿核被膜的管道結(jié)構(gòu)，負責核質(zhì)物質(zhì)交換染色質(zhì)：DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體，包含全部遺傳信息核仁：核內(nèi)最明顯的亞結(jié)構(gòu)，是rRNA合成和核糖體組裝的場所核基質(zhì)：核內(nèi)的纖維網(wǎng)絡(luò)，支持核結(jié)構(gòu)并參與核功能核孔復(fù)合物的結(jié)構(gòu)核孔復(fù)合物(NuclearPoreComplex,NPC)是貫穿核被膜的大型蛋白質(zhì)復(fù)合體，由約30種不同的核孔蛋白(nucleoporins,Nups)組成，總分子量約125MDa，呈八重對稱結(jié)構(gòu)，主要包括：細胞質(zhì)環(huán)：位于細胞質(zhì)側(cè)，具有8個細胞質(zhì)纖維中央通道：直徑約30-50nm，含有充滿FG重復(fù)序列的Nups核籃：位于核內(nèi)側(cè)，呈籃狀結(jié)構(gòu)核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運機制核孔復(fù)合物是核質(zhì)物質(zhì)交換的唯一通道，不同分子通過不同方式通過：被動擴散：小分子(＜40kDa)可自由通過主動轉(zhuǎn)運：大分子需專門轉(zhuǎn)運系統(tǒng)核定位信號(NLS)：指導蛋白進入細胞核核輸出信號(NES)：指導蛋白從細胞核輸出轉(zhuǎn)運蛋白：如importin、exportin等Ran-GTP循環(huán)：提供能量并決定轉(zhuǎn)運方向核質(zhì)轉(zhuǎn)運的生物學意義保證DNA與蛋白質(zhì)合成場所的分離提供基因表達的調(diào)控點防止未成熟RNA進入細胞質(zhì)細胞核結(jié)構(gòu)與核孔復(fù)合物示意圖細胞核的微觀結(jié)構(gòu)上圖展示了細胞核的精細結(jié)構(gòu)，可以觀察到：雙層核膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)外核膜之間為核周腔核膜上分布著眾多核孔復(fù)合物核內(nèi)可見染色質(zhì)的分布，包括常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域核仁作為明顯的致密區(qū)域，是rRNA合成和核糖體組裝的場所核基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)支撐整個核結(jié)構(gòu)細胞核的隔離使真核生物能夠?qū)崿F(xiàn)基因表達的復(fù)雜調(diào)控，這是原核生物所不具備的優(yōu)勢。核孔復(fù)合物的精細結(jié)構(gòu)放大圖展示了核孔復(fù)合物的詳細結(jié)構(gòu)：八重對稱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，直徑約100-150nm中央通道直徑約30-50nm細胞質(zhì)側(cè)的細胞質(zhì)纖維核內(nèi)側(cè)的核籃結(jié)構(gòu)由約30種不同的核孔蛋白組成人類細胞核膜上分布著約2000-4000個核孔復(fù)合物，它們不僅是物質(zhì)轉(zhuǎn)運的通道，也參與染色質(zhì)組織、基因表達調(diào)控、DNA修復(fù)等多種核功能。第二章：核酸的功能與代謝生命信息的流動與維護核酸不是靜態(tài)存在的分子，而是在生命活動中不斷進行動態(tài)變化。本章將探討核酸如何通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程實現(xiàn)遺傳信息的傳遞與表達，以及細胞如何維護核酸的完整性。DNA復(fù)制的分子機制半保留復(fù)制模型DNA復(fù)制采用半保留復(fù)制方式，即兩條子鏈各含一條親代鏈和一條新合成鏈。此機制由Meselson和Stahl于1958年通過密度梯度離心實驗證實。復(fù)制過程包括：起始：在復(fù)制起點(Origin)處DNA解旋，形成復(fù)制泡延伸：兩條鏈同時進行復(fù)制，形成雙向復(fù)制叉終止：復(fù)制叉相遇，復(fù)制完成復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)與組分復(fù)制叉是DNA復(fù)制的核心區(qū)域，包含多種酶和蛋白質(zhì)：解旋酶：解開DNA雙螺旋，使用ATP提供能量單鏈結(jié)合蛋白(SSB)：穩(wěn)定單鏈DNA，防止重新退火拓撲異構(gòu)酶：解決超螺旋問題，如DNA拓撲異構(gòu)酶I和II引物酶：合成RNA引物，為DNA聚合酶提供3'羥基DNA聚合酶：催化DNA合成的核心酶連接酶：連接岡崎片段DNA聚合酶的特性DNA聚合酶是復(fù)制的核心酶，具有以下特點：只能從5'→3'方向合成DNA需要引物提供3'羥基需要模板指導核苷酸選擇主要DNA聚合酶：原核生物：DNA聚合酶I、II、III（III為主要復(fù)制酶）真核生物：α、β、γ、δ、ε等（δ和ε為主要復(fù)制酶）領(lǐng)先鏈與滯后鏈由于DNA聚合酶只能5'→3'合成，兩條模板鏈復(fù)制方式不同：領(lǐng)先鏈：連續(xù)合成轉(zhuǎn)錄過程與mRNA合成轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄從啟動子(promoter)區(qū)域開始：原核生物：RNA聚合酶結(jié)合-10區(qū)(TATAbox)和-35區(qū)真核生物：轉(zhuǎn)錄因子(如TFIID)先結(jié)合TATAbox，然后RNA聚合酶II結(jié)合形成啟動復(fù)合物后，DNA局部解旋，暴露模板鏈轉(zhuǎn)錄延伸RNA聚合酶沿5'→3'方向合成RNA：以DNA模板鏈為模板，按堿基互補原則(A-U,G-C)合成RNA不需引物，可直接起始合成催化核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵延伸過程中，DNA在聚合酶前方解旋，在后方重新退火轉(zhuǎn)錄終止在終止信號處RNA聚合酶停止合成：原核生物：Rho依賴型終止：需Rho蛋白參與Rho非依賴型終止：依賴發(fā)夾結(jié)構(gòu)和U富集區(qū)真核生物：多聚A信號(AAUAAA)和下游GU富集區(qū)RNA聚合酶釋放，新生RNA鏈釋放，完成轉(zhuǎn)錄原核與真核轉(zhuǎn)錄的主要差異原核生物轉(zhuǎn)錄特點轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)進行，無空間分離單一RNA聚合酶負責所有RNA合成不需要大量轉(zhuǎn)錄因子操縱子結(jié)構(gòu)，多順反子mRNAmRNA無需加工即可翻譯mRNA不穩(wěn)定，半衰期短（幾分鐘）真核生物轉(zhuǎn)錄特點轉(zhuǎn)錄在細胞核內(nèi)，翻譯在細胞質(zhì)中三種RNA聚合酶(I,II,III)分別轉(zhuǎn)錄不同RNA需要眾多轉(zhuǎn)錄因子參與基因獨立轉(zhuǎn)錄，通常單順反子mRNAmRNA前體需加工（帽化、多聚A化、剪接）mRNA較穩(wěn)定，半衰期長（數(shù)小時至數(shù)天）RNA加工與翻譯準備真核mRNA前體的加工真核細胞中，RNA聚合酶II合成的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（前mRNA）需要經(jīng)過一系列加工才能成為成熟mRNA：1.5'帽子結(jié)構(gòu)(5'Capping)在轉(zhuǎn)錄起始后不久，當RNA鏈長約20-30nt時進行：去除5'三磷酸的γ和β磷酸添加GMP并形成5'-5'三磷酸鍵G的N7位甲基化，形成m7G帽子功能：保護mRNA免受5'外切酶降解；輔助mRNA出核；協(xié)助翻譯起始2.3'多聚腺苷酸化(3'Polyadenylation)在轉(zhuǎn)錄終止后進行：識別多聚A信號(AAUAAA)和下游GU富集元件切除信號后的RNA由多聚A聚合酶添加約200個腺苷酸，形成poly(A)尾功能：增加mRNA穩(wěn)定性；輔助mRNA出核；增強翻譯效率3.RNA剪接(RNASplicing)去除內(nèi)含子，連接外顯子：由小核核糖核蛋白(snRNP)和其他蛋白質(zhì)組成的剪接體(spliceosome)催化識別5'剪接位點(GU)、3'剪接位點(AG)和分支點(A)兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：形成套索結(jié)構(gòu)，然后切除內(nèi)含子并連接外顯子可變剪接一個基因可通過不同剪接方式產(chǎn)生多種mRNA：外顯子跳躍(exonskipping)可變5'/3'剪接位點互斥外顯子(mutuallyexclusiveexons)內(nèi)含子保留(intronretention)可變剪接極大增加了基因組編碼能力，人類約95%的多外顯子基因存在可變剪接。核糖體組裝與翻譯起始成熟mRNA出核后，在細胞質(zhì)中進行翻譯：起始因子eIF4F識別5'帽子結(jié)構(gòu)40S小亞基結(jié)合，形成43S前起始復(fù)合物掃描至起始密碼子(AUG)60S大亞基結(jié)合，形成80S核糖體轉(zhuǎn)錄與翻譯流程圖轉(zhuǎn)錄過程關(guān)鍵酶與步驟上圖展示了基因表達的中心法則流程，從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的完整途徑。在轉(zhuǎn)錄階段，主要涉及：RNA聚合酶：原核生物：單一RNA聚合酶，需要σ因子識別啟動子真核生物：RNA聚合酶I(rRNA)、II(mRNA)、III(tRNA,5SrRNA)轉(zhuǎn)錄因子：輔助識別啟動子并調(diào)控轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(GTFs)：如TFIIA,TFIIB,TFIID等特異性轉(zhuǎn)錄因子：響應(yīng)特定信號，調(diào)控特定基因表達RNA加工酶：帽化酶復(fù)合物多聚A聚合酶剪接體組分(U1,U2,U4/U6,U5snRNP)翻譯過程關(guān)鍵組分與步驟在翻譯階段，主要參與的分子機器包括：核糖體：蛋白質(zhì)合成的場所原核：70S(50S+30S)真核：80S(60S+40S)tRNA：氨?；髷y帶特定氨基酸，根據(jù)反密碼子-密碼子配對原則將氨基酸帶到核糖體氨酰tRNA合成酶：催化特定氨基酸與對應(yīng)tRNA連接翻譯因子：起始因子(IF/eIF)：輔助翻譯起始延伸因子(EF/eEF)：輔助肽鏈延伸釋放因子(RF/eRF)：識別終止密碼子，終止翻譯核酸的修復(fù)機制DNA損傷的來源DNA分子持續(xù)面臨多種損傷源的威脅：內(nèi)源性因素：DNA復(fù)制錯誤（約每10?個堿基1個錯誤）活性氧(ROS)導致的氧化損傷自發(fā)性脫嘌呤/脫嘧啶自發(fā)性胞嘧啶脫氨基外源性因素：紫外線輻射（形成嘧啶二聚體）電離輻射（產(chǎn)生單鏈和雙鏈斷裂）化學致突變劑（如亞硝酸、烷基化劑）DNA交聯(lián)劑（如順鉑）若不修復(fù)，DNA損傷可導致突變、細胞死亡、癌變及衰老。主要DNA修復(fù)途徑堿基切除修復(fù)(BER)修復(fù)單個損傷堿基：DNA糖基化酶識別并切除損傷堿基AP內(nèi)切酶切開無堿基位點DNA聚合酶β填補缺口DNA連接酶封閉缺口核苷酸切除修復(fù)(NER)修復(fù)畸變較大的損傷：識別DNA螺旋畸變切除含損傷的寡核苷酸片段（約30個核苷酸）DNA聚合酶填補缺口DNA連接酶連接錯配修復(fù)(MMR)修復(fù)堿基錯配和短插入/缺失：MutS識別錯配MutL/MutH切開含錯配的新生鏈外切酶降解包含錯配的片段重新合成正確序列雙鏈斷裂修復(fù)最嚴重的DNA損傷：非同源末端連接(NHEJ)：直接連接斷裂末端同源重組修復(fù)(HR)：使用姐妹染色單體作模板DNA損傷應(yīng)答與疾病細胞檢測到DNA損傷后，激活DNA損傷應(yīng)答(DDR)系統(tǒng)：檢查點激活，暫停細胞周期修復(fù)系統(tǒng)募集若損傷過重，激活細胞凋亡或衰老DNA修復(fù)缺陷導致多種遺傳疾病，如：色素性干皮癥(XP)：NER缺陷，極度光敏感共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(A-T)：DSB修復(fù)缺陷病毒核酸的特殊結(jié)構(gòu)與復(fù)制病毒核酸的多樣性病毒是核酸多樣性的極佳例證，可按核酸類型分類：雙鏈DNA病毒：皰疹病毒科：如單純皰疹病毒(HSV)痘病毒科：如天花病毒腺病毒科：引起呼吸道感染單鏈DNA病毒：細小病毒科：如人類細小病毒B19雙鏈RNA病毒：呼腸孤病毒科：引起腹瀉正鏈單鏈RNA病毒：冠狀病毒科：如SARS-CoV-2黃病毒科：如登革熱病毒負鏈單鏈RNA病毒：正黏病毒科：如流感病毒彈狀病毒科：如埃博拉病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒的特殊復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄病毒含RNA基因組，但通過DNA中間體復(fù)制：吸附與進入：病毒通過包膜糖蛋白與細胞受體結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄：病毒RNA→雙鏈DNA，由逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)催化以tRNA為引物，合成負鏈DNA降解RNA模板，留下RNA片段作為正鏈DNA合成引物合成正鏈DNA，形成雙鏈DNA整合：病毒DNA整合入宿主基因組，形成前病毒轉(zhuǎn)錄與翻譯：利用宿主機器合成病毒蛋白組裝與出芽：新病毒粒子形成并釋放乙型肝炎病毒(HBV)—一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒HBV是嗜肝DNA病毒科的成員，具有獨特的復(fù)制策略：基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA(rcDNA)，存在一個單鏈區(qū)域進入細胞核后，rcDNA轉(zhuǎn)化為共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA(pgRNA)pgRNA在細胞質(zhì)中由病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA新合成的DNA基因組被包裝入病毒衣殼，形成新病毒顆粒第三章：核酸技術(shù)與應(yīng)用從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化核酸科學的理論突破帶來了革命性的技術(shù)創(chuàng)新。本章將介紹現(xiàn)代核酸技術(shù)的發(fā)展歷程、基本原理及其在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、法醫(yī)學等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。我們將重點關(guān)注DNA測序、PCR、基因編輯、核酸芯片等技術(shù)，以及核酸藥物和疫苗的最新進展。DNA測序技術(shù)發(fā)展史1第一代測序：Sanger法（1977年）由FrederickSanger開發(fā)的雙脫氧終止法：使用放射性或熒光標記的雙脫氧核苷酸(ddNTPs)DNA聚合酶延伸過程中隨機終止通過凝膠電泳分離不同長度的DNA片段讀取長度約700-900bp應(yīng)用：人類基因組計劃(1990-2003)采用該技術(shù)2第二代測序：高通量測序（2005年后）也稱為下一代測序(NGS)，特點是大規(guī)模平行測序：454測序：焦磷酸測序，檢測焦磷酸釋放Illumina測序：合成測序，檢測熒光標記的核苷酸SOLiD測序：連接測序，使用DNA連接酶讀取長度短(75-300bp)，但通量極高成本大幅降低，從人類基因組計劃的30億美元到現(xiàn)在的不到1000美元3第三代測序：單分子測序（2010年后）直接測序單個DNA分子，無需擴增：PacificBiosciences：單分子實時測序(SMRT)，讀長可達數(shù)萬堿基OxfordNanopore：納米孔測序，DNA通過納米孔時改變電流優(yōu)勢：超長讀長，直接檢測DNA修飾應(yīng)用：復(fù)雜基因組組裝，結(jié)構(gòu)變異檢測，表觀基因組學測序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)學應(yīng)用遺傳病診斷腫瘤基因組學藥物基因組學無創(chuàng)產(chǎn)前檢測病原體鑒定科研應(yīng)用基因組學轉(zhuǎn)錄組學表觀基因組學宏基因組學古DNA研究其他領(lǐng)域農(nóng)業(yè)育種法醫(yī)DNA分析物種鑒定環(huán)境監(jiān)測微生物組研究PCR技術(shù)原理與應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)的基本原理PCR(PolymeraseChainReaction)技術(shù)由KaryMullis于1983年發(fā)明，能在體外特異性擴增DNA片段：PCR反應(yīng)的基本組分：模板DNA：含有目標序列的DNA引物對：兩條與目標序列互補的短寡核苷酸耐熱DNA聚合酶：如Taq聚合酶（來自嗜熱菌）dNTPs：四種脫氧核糖核苷三磷酸緩沖液：提供適宜的離子環(huán)境PCR擴增的三個步驟（循環(huán)進行）：變性(Denaturation)：94-98°C，使雙鏈DNA解鏈退火(Annealing)：50-65°C，引物與單鏈DNA模板結(jié)合延伸(Extension)：72°C，DNA聚合酶從引物延伸合成新鏈通過30-40個循環(huán)，可將目標DNA擴增2^30-2^40倍，實現(xiàn)從極微量DNA到可檢測量的放大。PCR技術(shù)的變種實時定量PCR(qPCR)：通過熒光信號實時監(jiān)測DNA擴增量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)：先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR巢式PCR(NestedPCR)：兩輪PCR提高特異性多重PCR(MultiplexPCR)：同時擴增多個目標數(shù)字PCR(DigitalPCR)：將樣本分散到成千上萬個反應(yīng)中，實現(xiàn)絕對定量長片段PCR：使用高保真聚合酶擴增長片段PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用臨床診斷病原體檢測（如新冠病毒檢測）遺傳病基因檢測腫瘤標志物檢測藥物基因組學檢測科學研究基因克隆與表達基因表達水平分析基因突變分析構(gòu)建基因文庫法醫(yī)學應(yīng)用DNA指紋分析親子鑒定古DNA分析死者身份確認基因編輯技術(shù)簡介基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程基因編輯是指精確修改基因組DNA序列的技術(shù)，經(jīng)歷了多代發(fā)展：第一代：鋅指核酸酶(ZFN)，通過融合鋅指蛋白與FokI核酸酶實現(xiàn)第二代：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)，設(shè)計更為靈活第三代：CRISPR-Cas系統(tǒng)，基于細菌免疫系統(tǒng)，操作簡便、高效新興技術(shù)：堿基編輯(BE)和質(zhì)粒編輯(PE)，可實現(xiàn)單堿基精確修改CRISPR-Cas9系統(tǒng)原理CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要由兩個關(guān)鍵組分組成：Cas9蛋白：具有核酸酶活性，能切割雙鏈DNA向?qū)NA(gRNA)：含有20個堿基的序列，引導Cas9結(jié)合目標位點工作過程：gRNA引導Cas9蛋白結(jié)合目標DNA序列識別PAM(原型相鄰基序)，通常為NGGCas9切割PAM上游約3bp處的雙鏈DNA細胞通過非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)修復(fù)雙鏈斷裂NHEJ：常導致插入/缺失突變，用于基因敲除HDR：利用修復(fù)模板，可實現(xiàn)精確修改CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢設(shè)計簡單，只需更改gRNA序列高效率，成功率通常超過70%多靶點編輯，可同時編輯多個基因成本低，易于普及適用于幾乎所有生物基因編輯的限制與挑戰(zhàn)脫靶效應(yīng)：在非目標位點產(chǎn)生編輯遞送問題：如何將編輯組分遞送到目標細胞免疫反應(yīng)：Cas9蛋白可能引發(fā)免疫反應(yīng)倫理問題：特別是涉及生殖細胞編輯時基因編輯的應(yīng)用案例醫(yī)學應(yīng)用遺傳病治療：如鐮狀細胞貧血、β-地中海貧血等癌癥免疫療法：CAR-T細胞療法中編輯T細胞抗病毒治療：切除整合的HIV基因組器官移植：編輯豬基因減少排異反應(yīng)農(nóng)業(yè)應(yīng)用作物改良：抗病蟲害、抗逆性增強、營養(yǎng)價值提高動物育種：無角牛、瘦肉豬等基因驅(qū)動：控制蚊子傳播瘧疾基礎(chǔ)研究基因功能研究：敲除/敲入基因研究功能疾病模型構(gòu)建：建立動物模型研究疾病機制CRISPR基因編輯示意圖CRISPR-Cas9靶向切割過程詳解上圖展示了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的詳細工作機制：識別階段：向?qū)NA(gRNA)的20個堿基序列與目標DNA形成堿基配對Cas9蛋白識別PAM序列(NGG)DNA雙鏈打開形成R-loop結(jié)構(gòu)切割階段：RuvC結(jié)構(gòu)域切割PAM非互補鏈HNH結(jié)構(gòu)域切割PAM互補鏈在目標序列上游約3bp處形成雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)階段：細胞內(nèi)DNA修復(fù)機制激活非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)導致基因敲除或精確編輯CRISPR系統(tǒng)的技術(shù)改進為提高特異性和擴展應(yīng)用范圍，科學家開發(fā)了多種改良型CRISPR系統(tǒng)：高保真Cas9變體：如eSpCas9、SpCas9-HF1，減少脫靶效應(yīng)Cas9昵酶：僅切割一條鏈，配對使用提高特異性催化失活Cas9(dCas9)：結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)域：調(diào)控基因表達結(jié)合熒光蛋白：可視化特定DNA序列結(jié)合組蛋白修飾酶：表觀遺傳修飾堿基編輯器：結(jié)合胞嘧啶/腺嘌呤脫氨酶，實現(xiàn)C→T或A→G轉(zhuǎn)換質(zhì)粒編輯器：可實現(xiàn)所有12種點突變，無需雙鏈斷裂其他Cas蛋白：如Cas12a(Cpf1)，識別不同PAM，產(chǎn)生粘性末端核酸芯片與生物信息學核酸芯片技術(shù)原理核酸芯片(Microarray)是一種高通量檢測技術(shù)，可同時分析成千上萬個基因表達或遺傳變異：基本原理：基于核酸分子的互補配對芯片類型：寡核苷酸芯片：直接合成短寡核苷酸cDNA芯片：點樣長DNA片段SNP芯片：檢測單核苷酸多態(tài)性實驗流程：提取樣本RNA/DNA標記(熒光或生物素)芯片雜交洗脫非特異性結(jié)合掃描信號數(shù)據(jù)分析核酸芯片應(yīng)用基因表達分析：研究不同條件下基因表達譜基因分型：檢測基因組變異比較基因組雜交(CGH)：檢測基因組拷貝數(shù)變異ChIP-on-chip：研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用藥物篩選：研究藥物對基因表達的影響生物信息學與大數(shù)據(jù)分析隨著高通量技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)爆炸式增長，生物信息學成為解析生物大數(shù)據(jù)的關(guān)鍵：數(shù)據(jù)類型：基因組序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)代謝組數(shù)據(jù)表觀基因組數(shù)據(jù)分析工具：序列比對工具(BLAST,MUSCLE)基因組瀏覽器(IGV,UCSC)RNA-seq分析工具(DESeq2,edgeR)變異檢測工具(GATK,VarScan)功能富集分析(GO,KEGG)前沿：單細胞組學與空間轉(zhuǎn)錄組學單細胞RNA測序(scRNA-seq)在單細胞水平研究基因表達：揭示細胞異質(zhì)性發(fā)現(xiàn)罕見細胞類型重建細胞發(fā)育軌跡技術(shù)平臺：10xGenomics,Drop-seq,Smart-seq空間轉(zhuǎn)錄組學保留空間信息的基因表達分析：理解組織中基因表達的空間分布研究細胞間相互作用技術(shù)平臺：Visium,MERFISH,Slide-seq應(yīng)用：腫瘤微環(huán)境研究、器官發(fā)育研究多組學整合分析整合多種組學數(shù)據(jù)：基因組+轉(zhuǎn)錄組+表觀基因組多模態(tài)單細胞測序分析方法：降維、聚類、軌跡分析解析復(fù)雜生物系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)核酸藥物與智能遞送系統(tǒng)核酸藥物的類型與機制核酸藥物利用核酸分子的特異性序列或結(jié)構(gòu)發(fā)揮治療作用：反義寡核苷酸(ASO)：與mRNA互補結(jié)合，阻斷翻譯或招募RNaseH降解已上市藥物：Spinraza(脊髓性肌萎縮癥)、Tegsedi(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變)小干擾RNA(siRNA)：通過RNA干擾機制降解特定mRNA已上市藥物：Onpattro(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變)、Givlaari(急性肝卟啉癥)適配體：特異結(jié)合靶標蛋白的單鏈核酸已上市藥物：Macugen(眼科適應(yīng)癥)mRNA藥物：導入編碼特定蛋白的mRNA，用于表達治療性蛋白已上市產(chǎn)品：COVID-19mRNA疫苗基因療法：導入功能性基因替代缺陷基因已上市藥物：Luxturna(遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良)、Zolgensma(脊髓性肌萎縮癥)核酸藥物遞送系統(tǒng)核酸藥物遞送面臨多重挑戰(zhàn)，包括核酸酶降解、腎清除、內(nèi)吞體逃逸等：化學修飾：增強穩(wěn)定性磷硫鍵修飾2'-糖基修飾（如2'-O-甲基）鎖核酸(LNA)修飾納米載體：保護并促進細胞攝取脂質(zhì)納米顆粒(LNP)：mRNA疫苗使用聚合物納米顆粒：如PLGA、PEI外泌體：自然來源的納米載體病毒載體：如AAV、慢病毒靶向策略：提高特異性配體修飾：如GalNAc（肝臟靶向）抗體偶聯(lián)：精確靶向特定細胞組織特異性啟動子：控制表達位置mRNA疫苗：核酸藥物的突破性應(yīng)用mRNA疫苗工作原理含有編碼抗原蛋白的修飾mRNA通過LNP遞送至細胞內(nèi)細胞翻譯產(chǎn)生抗原蛋白誘導體液和細胞免疫應(yīng)答優(yōu)勢開發(fā)速度快（COVID-19疫苗僅用11個月）無需活病毒，安全性高誘導強效免疫應(yīng)答生產(chǎn)工藝標準化，易于擴大規(guī)模適應(yīng)性強，可快速應(yīng)對病毒變異未來展望擴展至其他感染性疾病疫苗開發(fā)治療性腫瘤疫苗自身免疫性疾病治療蛋白質(zhì)替代療法開發(fā)常溫穩(wěn)定配方生物安全與倫理問題基因編輯的倫理爭議隨著核酸技術(shù)特別是基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，相關(guān)倫理問題日益凸顯：人類生殖系編輯：2018年"基因編輯嬰兒"事件引發(fā)全球爭議關(guān)鍵問題：改變將傳遞給后代，潛在風險難以評估國際共識：目前應(yīng)暫停人類生殖系基因編輯臨床應(yīng)用體細胞基因編輯：僅影響個體，不傳遞給后代倫理爭議較小，多國已批準臨床試驗關(guān)注點：安全性、有效性、可及性、知情同意基因增強：非治療性目的改變?nèi)祟惢蚩赡芗觿∩鐣黄降纫l(fā)"設(shè)計嬰兒"擔憂物種滅絕技術(shù)：通過基因驅(qū)動技術(shù)消滅有害物種生態(tài)風險難以預(yù)測跨境影響需國際協(xié)調(diào)核酸技術(shù)的社會影響核酸技術(shù)的廣泛應(yīng)用正在深刻影響社會多個方面：健康公平性：高成本技術(shù)可能加劇醫(yī)療不平等如何確保技術(shù)惠及全球人口基因隱私：基因數(shù)據(jù)包含敏感個人信息需防止歧視性使用數(shù)據(jù)所有權(quán)與分享政策文化與宗教因素：不同文化對生命干預(yù)的態(tài)度各異尊重多元價值觀的重要性核酸技術(shù)管理框架國際規(guī)范《生物武器公約》禁止生物武器研發(fā)世界衛(wèi)生組織(WHO)基因編輯治理框架聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)《世界生物倫理與人權(quán)宣言》國際人類基因組編輯委員會建議國家監(jiān)管中國：《人類遺傳資源管理條例》、《生物安全法》美國：FDA、NIH、RAC監(jiān)管框架歐盟：《生物技術(shù)發(fā)明法律保護指令》各國倫理委員會審查機制科學共同體自律阿西洛瑪會議模式（科學家自律）學術(shù)期刊倫理規(guī)范與審查研究機構(gòu)倫理委員會科學家倫理培訓與教育課堂互動：核酸知識問答DNA堿基配對規(guī)則問題：DNA雙螺旋中，堿基配對的原則是什么？各堿基對之間形成幾個氫鍵？答案：DNA中遵循互補配對原則：腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)配對，鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對。A-T之間形成2個氫鍵，G-C之間形成3個氫鍵。RNA與DNA的區(qū)別問題：列舉RNA與DNA在化學組成和結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別。答案：(1)糖成分不同：RNA含核糖，DNA含脫氧核糖；(2)堿基組成不同：RNA含尿嘧啶(U)，DNA含胸腺嘧啶(T)；(3)鏈結(jié)構(gòu)不同：RNA通常為單鏈，DNA通常為雙鏈；(4)穩(wěn)定性不同：RNA較不穩(wěn)定。核酸復(fù)制與轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵酶問題：DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中各需要哪些關(guān)鍵酶？它們的功能是什么？答案：DNA復(fù)制：DNA聚合酶(合成DNA)、解旋酶(解開雙螺旋)、引物酶(合成RNA引物)、DNA連接酶(連接岡崎片段)、拓撲異構(gòu)酶(解決超螺旋問題)轉(zhuǎn)錄：RNA聚合酶(合成RNA)、真核生物還需要多種轉(zhuǎn)錄因子PCR實驗設(shè)計問題：設(shè)計PCR實驗時需要考慮哪些關(guān)鍵因素？答案：(1)引物設(shè)計：特異性、長度(18-25bp)、GC含量(40-60%)、Tm值(55-65℃)、避免二級結(jié)構(gòu)；(2)退火溫度：通常比引物Tm值低5℃；(3)延伸時間：根據(jù)產(chǎn)物長度(約1kb/min)；(4)循環(huán)數(shù)：通常25-35個；(5)模板量和純度思考題與討論中心法則的例外思考：分子生物學中心法則(DNA→RNA→蛋白質(zhì))有哪些例外情況？這些例外對我們理解生命有何啟示？逆轉(zhuǎn)錄：RNA→DNA(如HIV病毒)RNA復(fù)制：RNA→RNA(如RNA病毒)直接翻譯：DNA→蛋白質(zhì)(實驗室條件下)朊病毒：蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)(不涉及核酸)非編碼RNA：不翻譯為蛋白質(zhì)基因編輯倫理探討討論：你認為在什么條件下人類胚胎基因編輯可能是倫理上可接受的？應(yīng)該設(shè)置哪些限制？嚴重遺傳病治療的必要性安全性與有效性的充分證據(jù)替代治療方案的缺乏社會共識與監(jiān)管框架復(fù)習與總結(jié)核酸結(jié)構(gòu)與功能核心要點核酸的基本結(jié)構(gòu)核酸是由核苷酸通過磷酸二酯鍵連接形成的聚合物DNA：脫氧核糖+雙螺旋+A、T、G、C堿基RNA：核糖+通常單鏈+A、U、G、C堿基互補配對原則：A-T/U,G-C核酸在細胞中以染色質(zhì)形式存在，具有多級折疊結(jié)構(gòu)核酸的代謝過程DNA復(fù)制：半保留復(fù)制，高度精確(錯誤率≈10^-9)轉(zhuǎn)錄：DNA→RNA，由RNA聚合酶催化RNA加工：5'帽化、3'多聚A化、剪接翻譯：mRNA→蛋白質(zhì)，在核糖體上進行核酸修復(fù)機制確保遺傳信息完整性核酸技術(shù)應(yīng)用DNA測序：從Sanger法到高通量測序PCR：體外擴增特定DNA片段基因編輯：CRISPR-Cas9精確修改基因核酸芯片：高通量分析基因表達或變異核酸藥物：治療遺傳病、感染病和癌癥的新途徑現(xiàn)代核酸技術(shù)的未來展望技術(shù)創(chuàng)新方向單分子實時測序：直接讀取修飾堿基，超長讀長微流控技術(shù)：單細胞分析，高通量篩選基因編輯精確化：堿基編輯、質(zhì)粒編輯，減少脫靶合成生物學：人工染色體，全基因組合成核酸計算：DNA存儲，分子計算醫(yī)學應(yīng)用前景精準醫(yī)療：基于基因組的個體化治療基因療法：針對單基因遺傳病的根治液體活檢：循環(huán)核酸早期診斷腫瘤RNA治療：mRNA疫苗和藥物的廣泛應(yīng)用微生物組調(diào)控：基于核酸的微生態(tài)平衡跨學科融合趨勢人工智能+核酸科學：預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，設(shè)計藥物納米技術(shù)+核酸遞送：精準靶向，提高效率材料科學+DNA折紙術(shù)：創(chuàng)建納米結(jié)構(gòu)和器件生物信息學+系統(tǒng)生物學：多組學整合分析倫理學+科技評估：負責任的創(chuàng)新學習建議核酸科學是現(xiàn)代生命科學的基礎(chǔ)，也是最活躍的研究領(lǐng)域之一。建議同學們：夯實基礎(chǔ)知識：透徹理解核酸結(jié)構(gòu)與功能的基本原理關(guān)注前沿進展：定期閱讀權(quán)威期刊和科普文章實踐操作技能：參與實驗室實習，掌握基本實驗技術(shù)跨學科學習：拓展生物信息學、化學、物理等相關(guān)知識參考文獻與資料來源教材與專著翟中和,王喜忠,丁明孝.(2021).《細胞生物學》(第5版).北京:高等教育出版社.朱玉賢,李毅,鄭曉峰.(2018).《現(xiàn)代分子生物學》(第5版).北京:高等教育出版社.BruceAlberts,AlexanderJohnson,JulianLewis,etal.(2014).《MolecularBiologyoftheCell》(6thedition).GarlandScience.JamesD.Watson,TaniaA.Baker,StephenP.Bell,etal.(2013).《MolecularBiologyoftheGene》(7thedition).Pearson.JenniferA.Doudna,SamuelH.Sternberg.(2017).《ACrackinCreation:GeneEditingandtheUnthinkablePowertoControlEvolution》.HoughtonMifflinHarcourt.期刊文獻Crick,F.(1970).Centraldogmaofmolecularbiology.Nature,227(5258),561-563.Sanger,F.,Nicklen,S.,&Coulson,A.R.(1977).DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,74(12),5463-5467.Mullis,K.,etal.(1986).Specificenzyma