去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的體外抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（ACS）數(shù)據(jù)顯示，2022年美國(guó)胰腺癌新發(fā)病例達(dá)58,570例，死亡病例為47,590例，是美國(guó)第4大癌癥相關(guān)死因。在中國(guó)，胰腺癌的發(fā)病率同樣不容小覷，國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)表明，2015年中國(guó)胰腺癌發(fā)病率為6.4/10萬(wàn)，死亡率為5.1/10萬(wàn)，且男性發(fā)病率和死亡率均高于女性，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)。從全球范圍來(lái)看，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率與年齡密切相關(guān)，60歲以上人群是高發(fā)群體。胰腺癌之所以如此兇險(xiǎn)，很大程度上源于其早期診斷困難。胰腺的特殊解剖位置使得早期腫瘤難以被察覺(jué)，而且胰腺癌早期癥狀不典型，常表現(xiàn)為非特異性的上腹部隱痛不適、消化不良、腰背部疼痛等，這些癥狀很容易被患者忽視，或者被誤診為其他常見(jiàn)疾病。當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀，如皮膚鞏膜黃染、嚴(yán)重腹痛等就醫(yī)時(shí)，病情往往已進(jìn)展到中晚期，此時(shí)腫瘤多已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約80%的胰腺癌患者在首次診斷時(shí)已處于晚期，錯(cuò)失了最佳治療時(shí)機(jī)。目前，手術(shù)切除是治療胰腺癌的主要手段，但由于胰腺癌具有很強(qiáng)的侵襲性，手術(shù)切除率低，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高。即使接受了根治性手術(shù)，5年生存率也僅為15%-20%，在一些大的胰腺癌治療中心，5年生存率可達(dá)40%，但整體而言，胰腺癌患者的5年生存率不超過(guò)7%。對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除的晚期患者，化療和放療雖有一定作用，但效果有限，且這些治療手段往往伴隨著嚴(yán)重的副作用，給患者帶來(lái)極大痛苦，進(jìn)一步降低了患者的生活質(zhì)量和治療依從性。鑒于胰腺癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀，尋找安全、有效的治療藥物迫在眉睫。去甲斑蝥素作為一種從傳統(tǒng)中藥中提取的天然生物堿，已被證實(shí)具有抗腫瘤活性，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，為胰腺癌的治療帶來(lái)了新的希望。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探究去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的抑制作用，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。1.2去甲斑蝥素的研究現(xiàn)狀去甲斑蝥素（Norcantharidin，NCTD）是從傳統(tǒng)中藥斑蝥中提取的有效成分斑蝥素經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾得到的半合成衍生物。斑蝥作為一味傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)有著悠久的藥用歷史，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為下品，具有攻毒蝕瘡、逐瘀散結(jié)等功效。去甲斑蝥素在保留了斑蝥素抗腫瘤活性的同時(shí)，降低了其毒性，具有獨(dú)特的藥理特性，在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。在過(guò)去幾十年中，大量研究圍繞去甲斑蝥素的抗腫瘤作用展開(kāi)。眾多研究已證實(shí)，去甲斑蝥素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制增殖作用。例如，在肝癌研究中，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明去甲斑蝥素能夠抑制肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，來(lái)發(fā)揮其抗肝癌作用。在肺癌方面，研究發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素可以阻滯肺癌細(xì)胞周期，使細(xì)胞停滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖。此外，去甲斑蝥素對(duì)胃癌、食管癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出抑制作用，能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和侵襲等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤功效。去甲斑蝥素還具有獨(dú)特的升白細(xì)胞作用。傳統(tǒng)化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞數(shù)量急劇下降，使患者免疫力降低，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響治療進(jìn)程和患者生活質(zhì)量。而去甲斑蝥素在抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，能夠刺激骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)白細(xì)胞的生成，有效減輕化療藥物的骨髓抑制副作用。這種升白細(xì)胞特性使得去甲斑蝥素在與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，既能增強(qiáng)抗腫瘤效果，又能降低化療藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的損害，提高患者對(duì)化療的耐受性。在藥物劑型研發(fā)方面，科研人員為了提高去甲斑蝥素的療效、降低其毒副作用并改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，開(kāi)展了大量研究工作。目前，除了傳統(tǒng)的片劑、膠囊劑外，納米粒、脂質(zhì)體、微球等新型藥物遞送系統(tǒng)也被應(yīng)用于去甲斑蝥素的劑型開(kāi)發(fā)。例如，去甲斑蝥素納米粒能夠增加藥物的穩(wěn)定性，提高藥物在腫瘤組織中的富集程度，從而增強(qiáng)其抗腫瘤效果；脂質(zhì)體包裹的去甲斑蝥素可以改善藥物的溶解性，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。這些新型劑型的研究為去甲斑蝥素的臨床應(yīng)用提供了更多可能。盡管去甲斑蝥素在多種腫瘤治療研究中取得了一定成果，但目前關(guān)于其對(duì)胰腺癌作用的研究相對(duì)較少。胰腺癌由于其特殊的生物學(xué)行為和復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，對(duì)許多傳統(tǒng)治療方法具有較強(qiáng)的耐藥性，而去甲斑蝥素獨(dú)特的作用機(jī)制可能為胰腺癌的治療開(kāi)辟新的途徑。因此，深入探究去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的抑制作用及機(jī)制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.3研究目的與意義本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，深入探究去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的抑制作用及其潛在機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。胰腺癌作為一種高致死率的惡性腫瘤，目前的治療手段存在諸多局限性，尋找新型有效的治療藥物迫在眉睫。去甲斑蝥素作為一種具有獨(dú)特藥理特性的天然生物堿，在多種腫瘤治療研究中展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，但在胰腺癌治療領(lǐng)域的研究尚顯不足。通過(guò)本研究，明確去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的影響，有助于進(jìn)一步拓展去甲斑蝥素的應(yīng)用范圍，為胰腺癌的藥物研發(fā)提供新的方向。從機(jī)制研究角度來(lái)看，深入剖析去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，能夠揭示其在胰腺癌治療中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為理解胰腺癌的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供重要線(xiàn)索。這不僅有助于優(yōu)化現(xiàn)有治療方案，提高治療效果，還可能為開(kāi)發(fā)針對(duì)胰腺癌的個(gè)性化治療策略奠定基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果若能證實(shí)去甲斑蝥素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的有效抑制作用，有望為胰腺癌患者提供新的治療選擇。結(jié)合去甲斑蝥素本身具有的升白細(xì)胞等優(yōu)勢(shì)，其與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可能在增強(qiáng)抗腫瘤效果的同時(shí)，減輕化療藥物的毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量和治療依從性。這對(duì)于改善胰腺癌患者的預(yù)后，延長(zhǎng)生存期具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人胰腺癌細(xì)胞PANC-1購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株來(lái)源于一名56歲白人男性的胰腺導(dǎo)管腺癌組織，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。在實(shí)驗(yàn)前，將PANC-1細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期且密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)操作。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑去甲斑蝥素（純度≥98%，HPLC檢測(cè)）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃避光保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，產(chǎn)品貨號(hào)為11995-065，其含有豐富的氨基酸、維生素、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)镻ANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，貨號(hào)為10099-141，其富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，在培養(yǎng)基中的添加比例為10%。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）購(gòu)自Solarbio公司，貨號(hào)為T(mén)1300，用于細(xì)胞的消化傳代，能使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，便于后續(xù)的細(xì)胞操作。青鏈霉素雙抗（100×）購(gòu)自Invitrogen公司，貨號(hào)為15140-122，每100mL培養(yǎng)基中添加1mL雙抗，可有效抑制細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。MTT試劑（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)為M2128，用PBS溶解配制成5mg/mL的溶液，過(guò)濾除菌后4℃避光保存，用于細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，用于溶解去甲斑蝥素等難溶性試劑，在MTT實(shí)驗(yàn)中還用于溶解細(xì)胞中的甲瓚產(chǎn)物。2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific3111型）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，該培養(yǎng)箱具有高精度的溫度和CO?濃度控制系統(tǒng)，溫度控制范圍為室溫+5℃-55℃，精度可達(dá)±0.1℃，CO?控制范圍為0-20%，精度為±0.1%，能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。低速離心機(jī)（Eppendorf5804R型）購(gòu)自艾本德股份公司，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)14,000rpm，具備多種轉(zhuǎn)頭可供選擇，可滿(mǎn)足細(xì)胞離心、試劑分離等多種實(shí)驗(yàn)需求。酶標(biāo)儀（Bio-TekELx800型）購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司，可在200-1000nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光吸收值的檢測(cè)，用于MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖活力的定量分析。倒置顯微鏡（OlympusIX73型）購(gòu)自?shī)W林巴斯株式會(huì)社，配備高分辨率的物鏡和CCD相機(jī)，可對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)等進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和記錄。超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰SW-CJ-2FD型）購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，采用垂直流潔凈技術(shù)，可提供百級(jí)潔凈度的操作環(huán)境，有效防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染。電子天平（SartoriusBS224S型）購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，精度可達(dá)0.1mg，用于稱(chēng)量去甲斑蝥素、MTT等試劑。移液器（EppendorfResearchplus系列）購(gòu)自艾本德股份公司，包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同量程，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和細(xì)胞懸液。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代從液氮罐中取出凍存的人胰腺癌細(xì)胞PANC-1，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱完全培養(yǎng)基（90%DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期且密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。首先，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在消化過(guò)程中，需在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，迅速將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，加入3-4mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫壁并分散成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)與傳代過(guò)程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，所有操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，使用的試劑和耗材均需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理。同時(shí)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等，及時(shí)更換培養(yǎng)基，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)環(huán)境。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，如培養(yǎng)液變渾濁、出現(xiàn)異味、顯微鏡下可見(jiàn)雜菌等，應(yīng)立即采取相應(yīng)措施，如丟棄污染細(xì)胞、對(duì)培養(yǎng)箱和實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行消毒等，防止污染擴(kuò)散。2.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率MTT法的原理是利用活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過(guò)酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，從而可用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，加入含不同濃度去甲斑蝥素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（只含培養(yǎng)基和MTT試劑，不含細(xì)胞）和對(duì)照孔（含細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)DMSO、培養(yǎng)液、MTT試劑）。繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需先1000rpm離心5分鐘后再吸棄上清。然后每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式如下：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)計(jì)算不同濃度去甲斑蝥素處理組的細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線(xiàn)，分析去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用。2.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度去甲斑蝥素（0μM、10μM、40μM）的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束后，將6孔板置于倒置顯微鏡下，分別在100倍和200倍視野下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，包括細(xì)胞的大小、形狀、輪廓、透明度、貼壁情況等，并使用顯微鏡自帶的CCD相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。正常生長(zhǎng)的PANC-1細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)。與對(duì)照組相比，若去甲斑蝥素處理組的細(xì)胞出現(xiàn)體積變小、形態(tài)變圓、細(xì)胞間隙增大、貼壁能力減弱、細(xì)胞碎片增多等現(xiàn)象，可初步判斷去甲斑蝥素對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了影響，可能誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡或壞死。2.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡流式細(xì)胞術(shù)的原理是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的含量和分布，以及細(xì)胞的大小、形態(tài)、表面標(biāo)志物等特征，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定性和定量分析。在細(xì)胞周期檢測(cè)中，利用DNA染料（如PI）與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞DNA含量的變化，確定細(xì)胞在細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2/M期）的分布比例。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，常用AnnexinV-FITC/PI雙染法，AnnexinV可與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，PI可進(jìn)入壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，以每瓶5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6個(gè)T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度去甲斑蝥素（0μM、20μM、80μM）的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)培養(yǎng)瓶。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。對(duì)于細(xì)胞周期檢測(cè)，加入70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞1次。加入500μL含有50μg/mLPI和100μg/mLRNaseA的染色液，37℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為630nm，收集10000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布比例。對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，用500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm（FITC）和630nm（PI），收集10000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡率。2.2.5Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞以每瓶1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6個(gè)T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度去甲斑蝥素（0μM、10μM、40μM）的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)培養(yǎng)瓶。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，每次輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以充分去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入100-150μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使裂解液充分接觸細(xì)胞。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液至新的離心管中，即為總蛋白提取液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。首先，將BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合，配制成BCA工作液。取96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔（0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL）和樣品孔。向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，每孔20μL，向樣品孔中加入20μL待測(cè)蛋白樣品。然后，向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中計(jì)算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使蛋白終濃度為1-2μg/μL，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。配制10%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker，80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠與濃縮膠交界處，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后將PVDF膜和濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5分鐘。按照“負(fù)極-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-正極”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，放入轉(zhuǎn)膜槽中，250mA恒流轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液（用5%BSA-TBST配制）中，4℃孵育過(guò)夜。一抗包括Caspase-3、Bcl-2、Bax等相關(guān)蛋白的抗體，具體稀釋比例參照抗體說(shuō)明書(shū)。孵育過(guò)夜后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液（用5%脫脂奶粉-TBST配制，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，稀釋比例參照抗體說(shuō)明書(shū)）中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將ECL發(fā)光液A液和B液按1:1混合，均勻滴加在PVDF膜上，避光反應(yīng)1-2分鐘。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、顯影，采集圖像。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。對(duì)于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡、Westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用Tukey法進(jìn)行多重比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，準(zhǔn)確評(píng)估去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖、細(xì)胞周期、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用采用MTT法檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）在作用24h、48h、72h后對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。時(shí)間（h）去甲斑蝥素濃度（μM）平均OD值（x±s）抑制率（%）2401.256±0.03202451.123±0.02810.624100.987±0.02521.424200.856±0.02231.924400.654±0.01847.924800.456±0.01563.74801.325±0.03504851.056±0.02920.348100.897±0.02632.348200.689±0.02347.948400.456±0.01965.648800.256±0.01381.07201.456±0.03807251.089±0.03125.272100.856±0.02741.272200.623±0.02457.272400.389±0.01773.372800.189±0.01187.0經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組（0μM）相比，不同濃度去甲斑蝥素在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖均具有顯著抑制作用（P<0.01）。在同一作用時(shí)間下，隨著去甲斑蝥素濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性；在相同濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率也逐漸升高，表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性。當(dāng)去甲斑蝥素濃度為80μM作用72h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)87.0%，表明去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用隨劑量和時(shí)間的增加而增強(qiáng)。圖1不同濃度去甲斑蝥素在不同時(shí)間對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖抑制率的影響注：與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001。3.2去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞形態(tài)的影響在倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組（0μM去甲斑蝥素處理）和不同濃度去甲斑蝥素（10μM、40μM）處理48h后的PANC-1細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。圖2不同濃度去甲斑蝥素處理48h后PANC-1細(xì)胞形態(tài)（×100，×200）對(duì)照組細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)較為規(guī)則，呈多邊形或梭形，細(xì)胞之間緊密相連，排列有序，細(xì)胞膜完整，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見(jiàn)。當(dāng)用10μM去甲斑蝥素處理后，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)變化，細(xì)胞體積略有縮小，部分細(xì)胞的邊緣變得不規(guī)整，呈現(xiàn)出一定程度的皺縮，細(xì)胞之間的連接也有所減弱，細(xì)胞間隙稍有增大，但大部分細(xì)胞仍能保持貼壁生長(zhǎng)。在40μM去甲斑蝥素處理組中，細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，大部分細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞變圓，許多細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞數(shù)量顯著減少。細(xì)胞輪廓變得模糊，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)一些顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞核形態(tài)也發(fā)生改變，部分細(xì)胞核固縮、邊緣化。這些形態(tài)學(xué)變化表明，去甲斑蝥素能夠改變PANC-1細(xì)胞的正常形態(tài)，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)的改變更加顯著，提示去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞具有損傷作用，可能誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡或壞死。3.3去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素（0μM、20μM、80μM）處理48h后PANC-1細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，結(jié)果如圖3和表1所示。圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素處理48h后PANC-1細(xì)胞周期分布組別G1期細(xì)胞比例（%）S期細(xì)胞比例（%）G2/M期細(xì)胞比例（%）對(duì)照組（0μM）48.65±2.1235.46±1.8515.89±1.0220μM去甲斑蝥素組56.78±2.56*28.54±1.58*14.68±0.9580μM去甲斑蝥素組68.45±3.01**20.12±1.23**11.43±0.81**注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。由圖3和表1可見(jiàn)，對(duì)照組中G1期細(xì)胞比例為48.65±2.12%，S期細(xì)胞比例為35.46±1.85%，G2/M期細(xì)胞比例為15.89±1.02%。當(dāng)用20μM去甲斑蝥素處理后，G1期細(xì)胞比例顯著升高至56.78±2.56%（P<0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低至28.54±1.58%（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)去甲斑蝥素濃度增加到80μM時(shí)，G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至68.45±3.01%（P<0.01），S期細(xì)胞比例進(jìn)一步降低至20.12±1.23%（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例也顯著下降至11.43±0.81%（P<0.01）。上述結(jié)果表明，去甲斑蝥素能夠阻滯PANC-1細(xì)胞周期于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，且這種阻滯作用隨著去甲斑蝥素濃度的增加而增強(qiáng)。細(xì)胞周期的阻滯可能是去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一，通過(guò)使細(xì)胞停滯在G1期，減少進(jìn)入DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)量，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。3.4去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素（0μM、20μM、80μM）處理48h后PANC-1細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖4和表2所示。圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素處理48h后PANC-1細(xì)胞凋亡率組別凋亡率（%）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）對(duì)照組（0μM）5.68±0.523.25±0.352.43±0.2120μM去甲斑蝥素組18.56±1.23*10.45±0.85*8.11±0.62*80μM去甲斑蝥素組35.46±2.01**19.67±1.32**15.79±1.15**注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。從圖4和表2可以看出，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，僅為5.68±0.52%，其中早期凋亡率為3.25±0.35%，晚期凋亡率為2.43±0.21%。當(dāng)用20μM去甲斑蝥素處理后，細(xì)胞凋亡率顯著升高至18.56±1.23%（P<0.05），早期凋亡率和晚期凋亡率分別升高至10.45±0.85%（P<0.05）和8.11±0.62%（P<0.05）。當(dāng)去甲斑蝥素濃度增加到80μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步顯著升高至35.46±2.01%（P<0.01），早期凋亡率和晚期凋亡率也分別顯著升高至19.67±1.32%（P<0.01）和15.79±1.15%（P<0.01）。上述結(jié)果表明，去甲斑蝥素能夠誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，且隨著去甲斑蝥素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。這進(jìn)一步說(shuō)明去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和機(jī)體正常生理功能具有重要意義。去甲斑蝥素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如線(xiàn)粒體凋亡途徑或死亡受體凋亡途徑等，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖。3.5去甲斑蝥素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用Westernblot法檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素（0μM、10μM、40μM）處理48h后PANC-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax以及增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。圖5Westernblot檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素處理48h后PANC-1細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)從圖5中可以看出，與對(duì)照組（0μM）相比，隨著去甲斑蝥素濃度的增加，Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且在40μM去甲斑蝥素處理組中，Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)水平則隨著去甲斑蝥素濃度的升高而顯著下降，在40μM去甲斑蝥素處理組中，Bcl-2蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志。Bax是一種促凋亡蛋白，可通過(guò)與線(xiàn)粒體膜上的電壓依賴(lài)性陰離子通道（VDAC）相互作用，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2則是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制Bax的促凋亡作用，維持線(xiàn)粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，去甲斑蝥素能夠上調(diào)Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，表明去甲斑蝥素可能通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，從而誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。在增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)方面，與對(duì)照組相比，隨著去甲斑蝥素濃度的增加，PCNA蛋白的表達(dá)水平顯著降低，在40μM去甲斑蝥素處理組中，PCNA蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PCNA是一種與DNA合成密切相關(guān)的核蛋白，在細(xì)胞增殖的S期表達(dá)量最高，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞的增殖活性。去甲斑蝥素降低PCNA蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖具有抑制作用。綜上所述，去甲斑蝥素可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax以及增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)，誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。四、分析與討論4.1去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的作用本研究結(jié)果表明，去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的增殖具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著去甲斑蝥素濃度從5μM逐漸增加到80μM，作用時(shí)間從24h延長(zhǎng)至72h，PANC-1細(xì)胞的增殖抑制率不斷升高，當(dāng)去甲斑蝥素濃度為80μM作用72h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)87.0%。這一結(jié)果與張日沅等人的研究一致，他們采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度去甲斑蝥素處理人胰腺癌PANC-1細(xì)胞24h后的增殖情況，發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能降低細(xì)胞的存活率，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，表明去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。與其他研究中去甲斑蝥素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用相比，本研究中去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞的抑制效果具有一定的特異性。例如，在對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的研究中，孫震曉等發(fā)現(xiàn)10mg/L（約36.4μM）去甲斑蝥素作用24h后，部分細(xì)胞出現(xiàn)固縮、細(xì)胞質(zhì)膜突起、核染色質(zhì)異常凝集并伴有凋亡小體的形成，表明去甲斑蝥素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。在對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的研究中，也觀察到去甲斑蝥素能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡。雖然去甲斑蝥素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有抑制增殖作用，但不同腫瘤細(xì)胞對(duì)去甲斑蝥素的敏感性存在差異。這種差異可能與不同腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、基因表達(dá)譜以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的差異有關(guān)。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在差異的原因可能是多方面的。首先，不同研究中使用的細(xì)胞株不同，細(xì)胞的來(lái)源、培養(yǎng)條件、傳代次數(shù)等因素都可能影響細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。其次，實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)的差異也可能導(dǎo)致結(jié)果的不同。例如，本研究采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，而有些研究可能采用CCK-8法、EdU法等其他方法，這些方法在檢測(cè)原理、靈敏度等方面存在一定差異。此外，去甲斑蝥素的純度、溶解方式以及作用時(shí)間和濃度的設(shè)置等實(shí)驗(yàn)條件的不同，也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果來(lái)看，隨著去甲斑蝥素濃度的增加，PANC-1細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小、形態(tài)變圓、貼壁能力減弱等變化，這些形態(tài)學(xué)改變提示去甲斑蝥素可能通過(guò)損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，去甲斑蝥素能夠阻滯PANC-1細(xì)胞周期于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的時(shí)期，去甲斑蝥素使細(xì)胞阻滯在G1期，導(dǎo)致進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞數(shù)量減少，從而抑制了細(xì)胞的分裂和增殖。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，去甲斑蝥素能夠誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，去甲斑蝥素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而減少存活細(xì)胞數(shù)量，抑制細(xì)胞增殖。Westernblot檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，去甲斑蝥素能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活線(xiàn)粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制PANC-1細(xì)胞的增殖。4.2去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞形態(tài)、周期和凋亡的影響機(jī)制從細(xì)胞形態(tài)變化來(lái)看，對(duì)照組的PANC-1細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁緊密，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間連接緊密，而經(jīng)去甲斑蝥素處理后，細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小、變圓、貼壁能力下降等現(xiàn)象，這與去甲斑蝥素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程相契合。細(xì)胞凋亡時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)改變，包括細(xì)胞膜皺縮、起泡，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮、邊緣化等，最終形成凋亡小體。去甲斑蝥素可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白的降解，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而引起細(xì)胞形態(tài)的改變。在細(xì)胞周期方面，本研究發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠阻滯PANC-1細(xì)胞周期于G1期。細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)受到一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）的調(diào)控。在G1期，CyclinD與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。去甲斑蝥素可能通過(guò)影響CyclinD-CDK4/6-Rb-E2F信號(hào)通路，抑制Rb的磷酸化，使E2F不能釋放，從而阻礙細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期。此外，去甲斑蝥素還可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子，如p21、p27等，抑制CDK的活性，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。細(xì)胞凋亡是去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。線(xiàn)粒體凋亡途徑在去甲斑蝥素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，去甲斑蝥素上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，在細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體膜上，形成多聚體，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等執(zhí)行蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。而去甲斑蝥素降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少了Bcl-2對(duì)Bax的抑制作用，促進(jìn)了線(xiàn)粒體凋亡途徑的激活。同時(shí)，去甲斑蝥素還能激活Caspase-3，進(jìn)一步證實(shí)了其通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。4.3去甲斑蝥素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及意義通過(guò)Westernblot檢測(cè)結(jié)果可知，去甲斑蝥素能夠顯著調(diào)節(jié)PANC-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax以及增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)。這一結(jié)果與細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的變化密切相關(guān)，進(jìn)一步揭示了去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。在凋亡相關(guān)蛋白方面，去甲斑蝥素上調(diào)Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活后可作用于多種細(xì)胞內(nèi)底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bax是促凋亡蛋白，在正常細(xì)胞中，Bax主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，但在凋亡信號(hào)刺激下，Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體膜上，形成同源寡聚體，破壞線(xiàn)粒體膜的完整性，促使細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究中，去甲斑蝥素處理后，Bax表達(dá)上調(diào)，表明其可能通過(guò)增強(qiáng)Bax的促凋亡作用，促進(jìn)線(xiàn)粒體膜的損傷和細(xì)胞色素C的釋放，激活Caspase-3，最終誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡蛋白，它能夠通過(guò)與Bax等促凋亡蛋白相互作用，形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡活性，維持線(xiàn)粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。去甲斑蝥素下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少了Bcl-2對(duì)Bax的抑制作用，使得Bax能夠更有效地發(fā)揮促凋亡作用，進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這種對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)節(jié)，改變了細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細(xì)胞向凋亡方向發(fā)展，這與前面流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的去甲斑蝥素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致，共同揭示了去甲斑蝥素通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑抑制PANC-1細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)變化也進(jìn)一步證實(shí)了去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的蛋白質(zhì)，它與DNA聚合酶δ相互作用，參與DNA的合成、修復(fù)和細(xì)胞周期的調(diào)控。在細(xì)胞周期的G1晚期和S期，PCNA的表達(dá)水平顯著升高，其表達(dá)量與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)。本研究中，隨著去甲斑蝥素濃度的增加，PCNA蛋白的表達(dá)水平顯著降低，表明去甲斑蝥素能夠抑制PANC-1細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖過(guò)程。這與MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖的抑制作用以及細(xì)胞周期檢測(cè)中去甲斑蝥素使細(xì)胞阻滯在G1期的結(jié)果相互印證。去甲斑蝥素可能通過(guò)抑制PCNA的表達(dá)，影響DNA聚合酶的活性，阻礙DNA的合成和復(fù)制，從而使細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。本研究中去甲斑蝥素對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有重要的研究意義。從基礎(chǔ)研究角度來(lái)看，這些結(jié)果豐富了我們對(duì)去甲斑蝥素抗腫瘤分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步深入研究去甲斑蝥素在胰腺癌治療中的作用提供了重要的理論依據(jù)。通過(guò)明確去甲斑蝥素作用的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路，有助于我們理解胰腺癌的發(fā)病機(jī)制以及細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制。在臨床應(yīng)用方面，這些研究結(jié)果為胰腺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療思路。如果能夠在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證去甲斑蝥素對(duì)這些蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其抗腫瘤效果，那么去甲斑蝥素有可能成為一種新的治療胰腺癌的藥物，或者作為輔助藥物與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，提高胰腺癌的治療效果。此外，對(duì)這些蛋白表達(dá)的檢測(cè)還可以作為評(píng)估去甲斑蝥素治療效果的生物標(biāo)志物，為臨床治療方案的制定和調(diào)整提供參考。4.4研究的局限性與展望本研究雖取得了一定成果，明確了去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的抑制作用及其部分機(jī)制，但仍存在一些局限性。在樣本數(shù)量方面，本研究主要針對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1這一單細(xì)胞株進(jìn)行研究，樣本類(lèi)型相對(duì)單一。胰腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，不同患者來(lái)源的胰腺癌細(xì)胞在生物學(xué)特性、基因表達(dá)譜等方面存在顯著差異。僅研究一種細(xì)胞株可能無(wú)法全面反映去甲斑蝥素對(duì)胰腺癌的作用效果，研究結(jié)果的普適性受到一定限制。在研究方法上，本研究主要采用體外實(shí)驗(yàn)，雖然體外實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)，但體外實(shí)驗(yàn)環(huán)境與體內(nèi)實(shí)際情況存在差異。體內(nèi)腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，包含多種細(xì)胞類(lèi)型（如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分，這些因素相互作用，共同影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和對(duì)藥物的反應(yīng)。而體外實(shí)驗(yàn)難以完全模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，因此，本研究結(jié)果在體內(nèi)的有效性和可行性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。在作用機(jī)制研究深度上，本研究初步揭示了去甲斑蝥素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期以及調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)抑制PANC-1細(xì)胞增殖。然而，去甲斑蝥素作用的具體分子信號(hào)通路尚未完全明確。細(xì)胞內(nèi)存在多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，去甲斑蝥素可能通過(guò)多條信號(hào)通路協(xié)同作用來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。例如，PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、存活等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，去甲斑蝥素是否通過(guò)調(diào)控這些信號(hào)通路來(lái)影響PANC-1細(xì)胞的生物學(xué)行為，仍有待進(jìn)一步深入研究?；诒狙芯康木窒扌?，未來(lái)的研究可從以下幾個(gè)方向展開(kāi)。在樣本多樣性方面，應(yīng)納入更多不同來(lái)源的胰腺癌細(xì)胞株以及原代胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究，以更全面地評(píng)估去甲斑蝥素對(duì)胰腺癌的作用效果。同時(shí)，可收集胰腺癌患者的臨床樣本，進(jìn)行相關(guān)的臨床前研究，進(jìn)一步驗(yàn)證去甲斑蝥素在體內(nèi)的有效性和安全性。在研究方法上，需加強(qiáng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，建立胰腺癌動(dòng)物模型，如裸鼠胰腺癌移植瘤模型、基因工程小鼠胰腺癌模型等，深入探究去甲斑蝥素在體內(nèi)的抗腫瘤作用及其機(jī)制。此外，還可結(jié)合臨床研究，開(kāi)展小規(guī)模的臨床試驗(yàn)，觀察去甲斑蝥素對(duì)胰腺癌患者的治療效果和不良反應(yīng)，為其臨床應(yīng)用提供更直接的證據(jù)。在作用機(jī)制研究方面，可利用高通量技術(shù)，如基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等，全面分析去甲斑蝥素處理后PANC-1細(xì)胞的基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，篩選出潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)RNA干擾、基因過(guò)表達(dá)等技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證這些靶點(diǎn)和信號(hào)通路在去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖中的作用。此外，還可研究去甲斑蝥素與其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合作用機(jī)制，探索聯(lián)合用藥方案，以提高胰腺癌的治療效果。通過(guò)進(jìn)一步深入研究，有望為胰腺癌的治療提供更有效的藥物和治療策略，改善胰腺癌患者的預(yù)后。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了去甲斑蝥素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖的抑制作用及其潛在機(jī)制，取得了以下重要成果：抑制細(xì)胞增殖：采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。隨著去甲斑蝥素濃度從5μM增加到80μM，作用時(shí)間從24h延長(zhǎng)至72h，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，在80μM去甲斑蝥素作用72h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)87.0%。這表明去甲斑蝥素能夠有效地抑制PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，為胰腺癌的治療提供了潛在的藥物選擇。改變細(xì)胞形態(tài)：通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素處理后的PANC-1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。對(duì)照組細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁緊密，形態(tài)規(guī)則；而經(jīng)去甲斑蝥素處理后，細(xì)胞體積縮小、變圓，貼壁能力下降，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落。這些形態(tài)學(xué)變化提示去甲斑蝥素可能通過(guò)損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制細(xì)胞增殖。阻滯細(xì)胞周期：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，去甲斑蝥素能夠阻滯PANC-1細(xì)胞周期于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。隨著去甲斑蝥素濃度的增加，G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低。細(xì)胞周期的阻滯使得細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂，從而減少了細(xì)胞的增殖數(shù)量，這是去甲斑蝥素抑制PANC-1細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：同樣利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素能夠誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，為5.68±0.52%，而20μM去甲斑蝥素處理組細(xì)胞凋亡率升高至18.56±1.23%，80μM去甲斑蝥素處理組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至35.46±2.01%。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，去甲斑蝥素誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致存活細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖。調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)：通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素能夠顯著調(diào)節(jié)PANC-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)。具體表現(xiàn)為上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)。這種對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)進(jìn)一步證實(shí)了去甲斑蝥素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用。Caspase-3和Bax表達(dá)的上調(diào)以及Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，表明去甲斑蝥素激活了線(xiàn)粒體凋亡途徑，促