(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN120204373A(21)申請(qǐng)?zhí)?02510712224.3(22)申請(qǐng)日2025.05.30號(hào)游錫火丁靜吳小霞張文寶趙莉班萬(wàn)里(74)專利代理機(jī)構(gòu)哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司23211A61K39/00(2006.01)A61P33/10(2006.01)序列表(電子公布)附圖5頁(yè)(54)發(fā)明名稱一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用(57)摘要一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。為了解決目前對(duì)犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗的研制停滯不前，保護(hù)性抗原篩選滯后的問(wèn)題，本發(fā)明首先構(gòu)建了細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)，接著利用感染細(xì)粒棘球絳蟲犬陽(yáng)性血清對(duì)文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，通過(guò)二代測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析，從文庫(kù)中篩選出細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲的抗原蛋白，該抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，編碼基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。經(jīng)驗(yàn)證，該抗原蛋白能特異性與感染細(xì)粒棘球絳21.一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗，所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.由權(quán)利要求1中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗，所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一種權(quán)利要求2中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的篩選方法，其特1)構(gòu)建犬細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)；2)將文庫(kù)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜獲得菌落；3)菌落置于4℃倒置1-2h,把0.45μm硝酸纖維素膜裁剪至與培養(yǎng)平板相匹配的規(guī)格鋪于培養(yǎng)基表面，用牙簽在3個(gè)不對(duì)稱位置上做出標(biāo)記，取下硝酸纖維素膜使菌落接觸面朝上，鋪于含IPTG的具有Amp抗性的LB板上，37℃倒置培養(yǎng)6-8h,培養(yǎng)平板溫育后用封口膜包好倒置貯存于4℃;4)超凈工作臺(tái)中取出硝酸纖維素膜，在氯仿蒸氣中暴露15min后置于平皿中，加細(xì)菌裂解緩沖液浸沒硝酸纖維素膜室溫過(guò)夜裂解，換洗脫緩沖液室溫靜置3次，每次30min,封閉液室溫封閉2h;5)將封閉的硝酸纖維素膜與犬陽(yáng)性血清室溫孵育2h,硝酸纖維素膜置于含1%Triton-X、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%SDS的洗脫緩沖液中1h,于洗脫緩沖液中洗硝酸纖維素膜3次，每次30min;6)將步驟5)獲得的硝酸纖維素膜置于1:5000稀釋的堿性磷酸酶AP標(biāo)記親和純化兔抗狗IgG二抗中，室溫孵育2h,利用步驟5)所述洗脫緩沖液洗硝酸纖維素膜后采用5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸/硝基藍(lán)四氮氯化銨作為底物顯色，獲得硝酸纖維素膜上陽(yáng)性顯色信號(hào)的位置，最后用蒸餾水終止反應(yīng)，陽(yáng)性克隆載體抗原-抗體復(fù)合物處出現(xiàn)絳紫色；7)根據(jù)硝酸纖維素膜上陽(yáng)性環(huán)的位置，對(duì)應(yīng)到培養(yǎng)平板上可疑陽(yáng)性克隆所在的具體位板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜；進(jìn)行第二輪和第三輪篩選，直至得到一致的免疫陽(yáng)性重組體，提取質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，根據(jù)測(cè)序正確的重組體設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；8)將所述PCR產(chǎn)物經(jīng)重組表達(dá)，得到高純度的細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白。4.一種含有權(quán)利要求1中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將重組表達(dá)載體用于制備細(xì)粒棘球絳蟲終末宿主犬疫苗候選基因。5.一種含有權(quán)利要求1中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將重組表達(dá)載體用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。6.一種含有權(quán)利要求1中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因或權(quán)利要求4中所述重組表達(dá)載體的重組細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將重組細(xì)胞用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。7.一種含有權(quán)利要求2中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將融合蛋白用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。8.一種含有權(quán)利要求2中所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白的3應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是將融合蛋白用于制備診斷終末宿主犬細(xì)粒棘球絳蟲感染的試劑或試劑盒。4一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]棘球蚴病/包蟲病是由棘球絳蟲屬(帶科)的絳蟲蚴蟲(中絳期)引起的人畜共患寄生蟲病。在我國(guó)對(duì)公共衛(wèi)生具有重要意義的兩個(gè)引起囊型棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)和泡型棘球蚴病(alveolarechinococcosis,AE)的物種分別為細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus,Eg)和多房棘球絳蟲(Echinococcus[0003]終末宿主犬是人和家畜棘球蚴病的主要傳染源，對(duì)犬采取疫苗預(yù)防是控制包蟲病在我國(guó)牧區(qū)流行的最理想措施。若能對(duì)犬實(shí)施免疫預(yù)防，將極大簡(jiǎn)化包蟲病的控制方法，加快包蟲病的控制進(jìn)程，大幅降低和控制人畜間包蟲病的發(fā)病率。但目前對(duì)犬免疫疫苗的研制停滯不前，其重要原因在于保護(hù)性免疫機(jī)制不明及保護(hù)性抗原篩選的滯后。[0004]對(duì)于細(xì)粒棘球蚴病的疫苗接種，初步策略是提取細(xì)粒棘球絳蟲生命周期各個(gè)階段的蟲體粗抗原，包括成蟲整個(gè)蟲體、原頭節(jié)粗提物、可育囊和其它階段蟲體組織提取物，將粗抗原免疫宿主誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫力，或提取在寄生蟲的新陳代謝和宿主免疫攻擊中發(fā)揮重要作用的蟲體排泄/代謝分泌物(E/S)來(lái)免疫宿主。然而，這些粗抗原成分復(fù)雜，含有多種抗原蛋白，且批間差異大，在臨床結(jié)果方面存在不一致的情況。除此之外，粗抗原造成過(guò)敏反應(yīng)的可能性大，樣本來(lái)源有限造成生產(chǎn)成本較高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其在臨床上的運(yùn)用；同時(shí)由于一些交叉反應(yīng)性問(wèn)題(與感染其他絳蟲和線蟲的犬血清有交叉反應(yīng)),以及研制終末宿主粗抗原疫苗可能對(duì)工作人員的生命健康造成威脅等問(wèn)題，因此隨著基因工程疫苗研究的深入，蟲體粗抗原疫苗逐漸被其他疫苗替代。[0005]由于牧犬的數(shù)量遠(yuǎn)小于牲畜的數(shù)量，所以對(duì)終末宿主犬的控制成本遠(yuǎn)低于中間宿主。因此，我們可以通過(guò)采取免疫預(yù)防控制終宿主犬來(lái)更好地控制包蟲病，這使得尋找犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染疫苗的候選抗原變得尤為重要。發(fā)明內(nèi)容[0006]為了解決目前對(duì)犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗的研制停滯不前，保護(hù)性抗原篩選滯后的問(wèn)題，本發(fā)明建立了細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA文庫(kù)，并利用細(xì)粒棘球蚴感染后的犬陽(yáng)性血清，采用免疫學(xué)多輪篩選技術(shù)，將反應(yīng)原性強(qiáng)的單菌落進(jìn)行二代測(cè)序鑒定新抗原，為新型疫苗研發(fā)和開發(fā)特異性的診斷試劑等提供新的候選抗原。[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的技術(shù)效果，本發(fā)明提出了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗，所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5[0008]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供由上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗，所述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：1)構(gòu)建犬細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)；2)將文庫(kù)均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜獲得菌落；3)菌落置于4℃倒置1-2h,把0.45μm硝酸纖維素膜裁剪至與培養(yǎng)平板相匹配的規(guī)格鋪于培養(yǎng)基表面，用牙簽在3個(gè)不對(duì)稱位置上做出標(biāo)記，取下硝酸纖維素膜使菌落接觸膜包好倒置貯存于4℃;4)超凈工作臺(tái)中取出硝酸纖維素膜，在氯仿蒸氣中暴露15min后置于平皿中，加細(xì)菌裂解緩沖液浸沒硝酸纖維素膜室溫過(guò)夜裂解，換洗脫緩沖液室溫靜置3次，每次30min,封閉液室溫封閉2h;5)將封閉的硝酸纖維素膜與犬陽(yáng)性血清室溫孵育2h,硝酸纖維素膜置于含1%Triton-X、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%SDS的洗脫緩沖液中1h,于洗脫緩沖液中洗硝酸纖維素6)將步驟5)獲得的硝酸纖維素膜置于1:5000稀釋的堿性磷酸酶AP標(biāo)記親和純化兔抗狗IgG二抗中，室溫孵育2h,利用步驟5)所述洗脫緩沖液洗硝酸纖維素膜后采用5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸/硝基藍(lán)四氮氯化銨作為底物顯色，獲得硝酸纖維素膜上陽(yáng)性顯色信號(hào)的位置，最后用蒸餾水終止反應(yīng)，陽(yáng)性克隆載體抗原-抗體復(fù)合物處出現(xiàn)絳紫色；7)根據(jù)硝酸纖維素膜上陽(yáng)性環(huán)的位置，對(duì)應(yīng)到培養(yǎng)平板上可疑陽(yáng)性克隆所在的具的LB板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜；按前述方法進(jìn)行第二輪和第三輪篩選，直至得到一致的免疫陽(yáng)性8)將所述PCR產(chǎn)物經(jīng)重組表達(dá)，得到高純度的細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白。[0010]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將重組表達(dá)載體用于制備細(xì)粒棘球絳蟲終末宿主犬疫苗候選基[0011]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種含有上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將重組表達(dá)載體用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。[0012]本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種含有上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因或上述重組表達(dá)載體的重組細(xì)胞的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將重組細(xì)胞用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。[0013]本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種含有上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將融合蛋白用于制備犬抗細(xì)粒棘球絳蟲感染的疫苗。[0014]本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種含有上述細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的融合蛋白的應(yīng)用，所述應(yīng)用是將融合蛋白用于制備診斷終末宿主犬細(xì)粒棘球絳蟲感6球絳蟲犬陽(yáng)性血清反應(yīng)，在犬抗細(xì)粒棘球絳蟲疫苗及診斷試劑研發(fā)中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖5為實(shí)施例2篩選到的一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分圖6為實(shí)施例2篩選到的一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Marker,1為pBlueScriptIISK(-)載體重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；圖9實(shí)施例2篩選到的一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因在E.coliBL21(DE3)細(xì)胞圖10為實(shí)施例2篩選到的一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因在E.coliBL21(胞中誘導(dǎo)表達(dá)純化后進(jìn)行的10%SDS圖；其中，圖10中的M為Marker,1為純化后的圖11為實(shí)施例2篩選到的一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因Westernblotting圖；7明內(nèi)容的實(shí)施例后，當(dāng)可由本發(fā)明內(nèi)容所教示的技術(shù)，加以改變及修飾，其并不脫離本發(fā)明內(nèi)容的精神與范圍。[0018]本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。[0019]以下實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所使用的材料、試劑、[0020]實(shí)施例1:細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA文庫(kù)的構(gòu)建本發(fā)明所使用的細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)采自包蟲病流行地區(qū)縣級(jí)牛/羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)屠宰的細(xì)粒棘球蚴感染的羊肝。細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA文庫(kù)的構(gòu)建包括如下步驟：首先分離得到細(xì)粒棘球絳蟲原頭節(jié)，人工經(jīng)口感染實(shí)驗(yàn)犬，如圖1所示剖殺時(shí)限設(shè)計(jì)獲得細(xì)粒棘鏈；將雙鏈cDNA連接到pBlueScriptIISK(-)載體中，而后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞取提前保存在液氮中的細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲樣品置于1.5mL離心管中，使用TRIZOL試劑從細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲中提取總RNA,使用0ligotexmRNAKits分離純化試劑在一個(gè)0.2mLRNasefree離心管中，加入以下反應(yīng)體系：E.coli.DNALigase(10U/μL)1μL,E.coli.RNase儀中，70℃處理7min,立即置于冰上。在一個(gè)新的0.2mLRNasefree管中配制第一鏈反應(yīng)反應(yīng)管降至45℃后，維持在45℃孵育2min,加入第二個(gè)管中的反應(yīng)體系混勻，避免產(chǎn)生氣泡，反應(yīng)產(chǎn)物移入新的1.5mLRNasefree管中，加入下列試劑混勻，-8產(chǎn)物于4℃,16000×g離心30min,棄上清，加入RNasef在上述反應(yīng)液中加入以下各試劑：DEPC-treatedwater91μL,5×SecondEDTA(pH8.0)10μL,加入酚、氯仿和異戊醇的混合溶液(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)160μL,充分混勻30s;14000rpm,室溫離心5min,小心將上清取到新的離心管中，[0024]加5'接頭(3個(gè)讀碼框，每個(gè)讀碼框連接一份，共3份),所用體系為cDNA34μL,10×T4ligase聚合酶，16℃放置20min,補(bǔ)平末端。8[0025](3)回收目的長(zhǎng)度的cDNA片段使用1%濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，電泳cDNA產(chǎn)物，切膠回收約1Kbp的片段。膠塊70℃10min,轉(zhuǎn)移到45℃,加入10×buffer,以及5μL的溶膠酶，45℃,處理3h。然后4℃[0026](4)cDNA與載體的連接NO.5),使得改造后載體大小為4818bp,如圖2)混合，加入5μLall-direct重組酶，以及5μL水，混勻，置于25℃反應(yīng)20h向上述反應(yīng)液中加入2μLProteinaseK滅活重組酶，78μ無(wú)水乙醇375μL,混合均勻并置于-80℃不少于1小時(shí)，于4℃,16000rpm離心30min,小心去上清，加入150μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，于4℃,16000rpm離心3min;重復(fù)此步驟一次，去槍吹吸30-40次。瞬時(shí)離心2s收集cDNA,立即置于冰上。ctcgagacaagtttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatttagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactaatgctgccaacttagcggccgctaagttggcagcatcacccgacgcactttgcgccgaataaaagatcacttcgcagaataaataaatcctggtgtccctgttgataccgggaagcccttgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccagtcatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataacgatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttatgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccactttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaaggatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaaccttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagcggggcgtaatctagaggatccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcaagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggaaagcggaaaatcaggaagggattattgaaatgaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggttagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtcccccgtgaactttacccggtggtgggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcctctgcaggtcgaccatagtgactggatatgttgtgttttacagtattatgtagtctgttttt9tttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagctttcttgtaca(5)電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞加入電轉(zhuǎn)杯，置冰上45min,于電轉(zhuǎn)化儀上電擊(電壓為2.9kV,電阻為200Ω,功率為25μF),電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入LB培養(yǎng)基1mL,然后取入到新的15mL離心管，補(bǔ)足體積到5mL,置于37℃,250rpm培養(yǎng)至少1h。余培養(yǎng)物可4℃保存過(guò)夜，或者加入甘油至終濃度20%存于-80℃。cDNA文庫(kù)在LB固體培養(yǎng)基上形成的陽(yáng)性克隆如圖3所示。[0029](6)文庫(kù)質(zhì)量鑒定文庫(kù)質(zhì)量通過(guò)如下公式鑒定：CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/10μL×100倍×1×103μL;文庫(kù)總CFU=CFU/mL×文庫(kù)菌液總體積(mL)。[0030]經(jīng)鑒定，構(gòu)建獲得的文庫(kù)的庫(kù)容量為1×1[0031](7)插入片段大小鑒定挑取平板上的單克隆，PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，PCR引物是載體的通用引本發(fā)明提供的cDNA文庫(kù)的免疫篩選首先采用假篩選法吸附純化感染細(xì)粒棘球絳蟲犬陽(yáng)性血清探針，去除非特異性交叉反應(yīng)抗體成分：主要是去除相對(duì)低豐度的抗大腸桿菌抗體成分，最后產(chǎn)生理想的可用于特異性免疫學(xué)篩選的抗體探針；然后利用特異性免疫學(xué)篩選，具體為每次用10只感染細(xì)粒棘球絳蟲犬陽(yáng)性血清的混合樣本對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲3天幼蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，選取靈敏度高、反應(yīng)性強(qiáng)的含有細(xì)粒棘球蚴基因的陽(yáng)性克隆，并將重組載體送生物公司測(cè)序，獲得目的基因序列。最后對(duì)cDNA插入的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該序列進(jìn)行同源性檢索。對(duì)測(cè)序后的目的基因氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及免疫原性分析。挑取E.coli(BL21DE3)單克隆于104℃,5000×g離心10min,除盡培養(yǎng)基。用3mLTris-HCI(50mM,pH8.0)和EDTA(10mM,pH8.0)重懸菌體，反復(fù)凍融3次后，超聲破碎至菌液變清亮。4℃,5000×g離心15min,離心收集上清即為E.coli(BL21DE3)裂解液。取細(xì)粒棘球絳蟲犬陽(yáng)性混合血清100μL,加入1體稀釋液稀釋，使血清終濃度為1:100,加入終濃度為0.02%的疊氮化鈉，4℃保存。2.1初篩2.1.1細(xì)菌培養(yǎng)將擴(kuò)增后的文庫(kù)均勻涂布于LB板(Amp+),37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，菌落長(zhǎng)至直徑0.1-0.2mm,從培養(yǎng)箱中取出平板4℃倒置1-2h。硝酸纖維素膜即NC膜(Millipore,0.45μm)裁剪至與培養(yǎng)平板相匹配的規(guī)格鋪于培養(yǎng)基表面，與菌落接觸至變濕，用注射器針尖在3個(gè)不對(duì)稱位置上做出標(biāo)記。37℃溫育培養(yǎng)平板約6h,直至長(zhǎng)出新菌落。用封口膜包好主平板倒置貯存于4℃。[0037]2.1.4固定超凈工作臺(tái)中取出NC膜，在氯仿蒸氣中暴露15min后置于平皿中。加細(xì)菌裂解緩沖液浸沒NC膜，將平皿放在搖床上50rpm室溫過(guò)夜裂解，換洗脫緩5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h。[0040]2.1.7表達(dá)目的融合蛋白陽(yáng)性克隆的檢測(cè)與假篩法處理的犬陽(yáng)性血清孵育2h,將平皿放在搖床上50rpm室溫緩慢搖動(dòng)。NC膜置于含1%Triton-X、0.5%脫氧膽酸鈉和0.1%SDS的洗脫緩沖液中1h,洗脫緩沖液中洗NC膜3次，每次30min,室溫下于搖床上50rpm緩慢搖動(dòng)。二抗選用堿性磷酸酶AP標(biāo)記親和純化兔抗狗IgG(Jackson,USA),1:5000洗膜后采用BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸)/NBT(硝基藍(lán)四氮氯化銨)作為底物顯色。蒸餾水終止反應(yīng)。陽(yáng)性克隆抗原-抗體復(fù)合物處出現(xiàn)絳紫色。[0041]2.1.8陽(yáng)性克隆定位根據(jù)膜上陽(yáng)性環(huán)的位置，對(duì)應(yīng)到培養(yǎng)平板上可疑陽(yáng)性克隆所在的具體位置挑取單將上述菌落接種在LB板(Amp+)上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按前述方法進(jìn)行第二輪篩選，目的是獲得單一的陽(yáng)性克隆。重復(fù)復(fù)篩的步驟進(jìn)行第三輪篩選，直至得到一致的免疫陽(yáng)性重組體，平板上出現(xiàn)100%的陽(yáng)性克隆。[0044]通過(guò)上述方法，本發(fā)明篩選到一種細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白基因(本發(fā)明命名為Eg282),其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明獲得的目的基因長(zhǎng)度為282bp,編碼93個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所93位的TAG對(duì)應(yīng)mRNA的終止密碼子TAA。所編碼細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白的分子量約為10.道爾頓。將目的基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白為細(xì)粒棘球絳蟲假定蛋白。[0045]實(shí)施例3:PBluescript重組質(zhì)粒的提取、檢測(cè)和分析挑取陽(yáng)性克隆單菌落于LB(含100μg/mLAmp)液體培養(yǎng)基中，37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，用天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA,用30-50μL洗脫液將質(zhì)粒DNA洗脫。將提取的質(zhì)粒送生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，使用M13F和M13R作為通用引物。刪除上下游酶切位點(diǎn)將序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)和同源性分析，在HTTP://11/orffinder/網(wǎng)站進(jìn)行0RF分析，確定最大的開放閱讀框；在https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/npsa基序列在NCBI中做BLAST分析，其編碼蛋白的序列與SEQIDNO.2的1-93氨基酸序列相同。旋占29.03%,無(wú)規(guī)則卷曲占59.14%,延伸鏈占11.83%;蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲等柔性結(jié)構(gòu)圖6所示，對(duì)本發(fā)明篩選到的基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析可知(SMART:Mainpage atgttggctaaaaaaaagattgttggcctcgttacagatatggttactaaggatccggaaatggtttctacctgcctccgtactacgcctccggccgtgaatccgaacttcgcccactcagccactgccactacaaccaaccatttaagtgcacctcacggcaatggcacaacatgtattgtggaacattttatcaacgacgaatactttttttcgcgtaatt實(shí)施例4:目的基因的克隆、轉(zhuǎn)化根據(jù)目的基因的序列(SEQIDNO.1),選擇合適的核酸內(nèi)切酶(BamHI和XhoI)將目的基因從pBlueScriptIISK(-)載體中切下，同時(shí)用同樣的內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體PET32a。[0047]如圖7和圖8所示，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將凝膠中的目的片段和表達(dá)載體切下，用天根公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將目的基因和表達(dá)載體用T4連接酶連接，連接體系如下：T4Iigase1μL,T4Iigasebuffer1μL,連接。[0048]取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a細(xì)胞，具體方法為：將10μL的連接產(chǎn)物與100μLE.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30min,之后于42℃水浴熱休克90s,再置于冰上1-2分鐘，然后加入700μL預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37℃,200rpm震蕩培養(yǎng)1h,取100μL菌液涂LB(Amp+)平板，倒置于37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)。在平板中挑取5-10個(gè)單菌落，分別置于1mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37℃,200rpm過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，送生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序檢測(cè)連接是否成功，將連接成功的重組載體用天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，取10μL質(zhì)粒照以上方法轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)細(xì)胞。1、重組蛋白的小量表達(dá)分別取轉(zhuǎn)化重組載體及含有pET32a空載體的E.coliBL21(DE3)單菌落于3mLLB37℃,200rpm誘導(dǎo)表達(dá)3h.離心收集菌體，用PBS溶液洗兩次，將兩者同時(shí)進(jìn)行10%SDS-取確定表達(dá)的E.coliBL21(DE3)單菌落于100mLLB(100μg/mLAmp)基中，37℃,200rpm振蕩培養(yǎng)2h,而后加入IPTG至終濃度為1mM,37℃,1800rpm誘導(dǎo)表達(dá)高壓的PBS溶液，超聲3次，每次3s,間隔5s,共30min,留部分超聲后全菌后再次離心，收表達(dá)，菌體破碎后上清中未出現(xiàn)明顯的目的條帶，重組蛋白為包涵體蛋白，大小為30.83KDa左右(由于pET32a載體含有腸激酶、凝血酶、子質(zhì)量增加了約20.4KD),均與理論值相符。由于該蛋白存在于包涵體中，將沉淀重懸于適量的包涵體裂解緩沖液：>20mL/每克菌(濕重),用磁力攪拌器攪拌4℃過(guò)夜。將裂解好的溶液4℃,6000rpm,離心20min,收集上清。6×His融合蛋白在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)NI-NTA樹脂對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，并根據(jù)供應(yīng)商(Qiagen,Germany)的說(shuō)明在變性條件下(尿素)洗脫。洗脫的蛋白進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)檢測(cè)純化后蛋白濃度，獲得的重組蛋白作為抗原使用。[0052]實(shí)施例6:重組蛋白的免疫原性分析采用Westernblotting法對(duì)該抗原進(jìn)行免疫學(xué)分析，具體步驟如下：抗原上樣量為20μg/lane,用1:1000稀釋犬陽(yáng)性血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗狗IgG(Promega,China)在含0.05%Tween-20(TBSTween-20)的TBST中1:5000稀釋作為二抗。使用超高靈敏度ECL試劑盒(Biosharp)作為化學(xué)發(fā)光底物。[0053]如圖11所示，純化后的重組蛋白與抗His標(biāo)簽抗體反應(yīng)，且與抗細(xì)粒棘球絳蟲成蟲的犬陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合，而與陰性血清在目的蛋白處無(wú)反應(yīng)條帶，顯示重組蛋白具有良好的抗原性。[0054]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1(4740)BciV(4740)BciV(4570)Acul(4567)BssSalDraIII(237)(4502)XmnI(4442)Bog(4440)BsaHI(4408)Bcgl(4383)Scal(4273)Pvul(4051)NmeAIII