PCR技術(shù)和基因編輯技術(shù)1.RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）常規(guī)的PCR過程是由DNA依賴的DNA聚合酶以DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增的，而逆轉(zhuǎn)錄PCR則由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。首先，由逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為與其互補(bǔ)的DNA（cDNA），再通過常規(guī)PCR和相應(yīng)引物進(jìn)行另一DNA鏈的合成以及DNA雙鏈的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄PCR是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA，廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。2.反向PCR反向PCR是克隆基因組已知序列旁側(cè)序列的一種方法。其原理是選取已知序列中不存在的內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，使已知序列和待檢測(cè)的旁側(cè)序列位于同一片段被切下，然后對(duì)該片段進(jìn)行自身環(huán)化。以該環(huán)化DNA作為模板，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得所需的未知序列信息。利用該技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有的環(huán)狀DNA（如質(zhì)粒）的線性化。3.不對(duì)稱PCR不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA的過程，這對(duì)引物分別稱為非限制性引物和限制性引物，兩條引物的比例通常為100∶1，這樣隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，濃度低的引物很快被消耗光，高濃度引物隨即產(chǎn)生大量的目的單鏈DNA。低濃度引物的加入保證了擴(kuò)增過程具有足夠多的模板，而高濃度引物則保證了單鏈DNA的大量合成。4.熒光定量PCR（1）熒光染料熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光信號(hào)，不摻入鏈中的（游離的）染料不會(huì)發(fā)出任何熒光信號(hào)。（2）水解探針，以TaqMan探針為代表。①水解探針的組成②水解探針（TaqMan）工作原理PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。圖示如下：5.巢式PCR巢式PCR先用待擴(kuò)增DNA外側(cè)的一對(duì)引物完成一次PCR，再將其作為模板，根據(jù)原來引物內(nèi)側(cè)的序列設(shè)置新的引物，再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以減少第一次擴(kuò)增中出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增片段，提升擴(kuò)增的精確性。但由于操作過程中的開蓋處理，會(huì)增加產(chǎn)物污染的概率。圖示如下：6.重疊延伸PCR重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的技術(shù)，可通過定點(diǎn)誘變?cè)隗w外改造DNA分子，并將改造后的目的基因?qū)胭|(zhì)粒構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。（1）上圖所示的重疊延伸PCR技術(shù)中，PCR1的引物是引物A、引物C。PCR4可獲得大量定點(diǎn)誘變目的基因，此時(shí)的引物為引物C、引物D。PCR3時(shí)模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是子鏈的延伸方向只能從5'→3'，以DNA分子③作模板時(shí)子鏈不能延伸。（2）為使重疊延伸PCR技術(shù)改造后的目的基因（該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列）能與載體正確連接，PCR4時(shí)，應(yīng)在基因上、下游引物的5'端分別添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。7.基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，其原理是由一條單鏈向?qū)NA（sgRNA）引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割（如圖）。CRISPR復(fù)合體中的sgRNA的主要功能是與靶向基因（目的基因）上特定堿基序列互補(bǔ)，從而定向引導(dǎo)Cas9蛋白與靶向基因結(jié)合，并在特定位點(diǎn)切割DNA。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因生物，與傳統(tǒng)的基因工程相比，其明顯優(yōu)點(diǎn)是可將目的基因定點(diǎn)插入所需位點(diǎn)，避免了因目的基因隨機(jī)插入宿主細(xì)胞DNA引起的生物安全性問題。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因治療、基因水平進(jìn)行動(dòng)植物的育種、研究基因的功能等方面有廣闊的應(yīng)用前景。1.（2024·江蘇南京調(diào)研）如圖是快速RT-PCR過程示意圖，①和②為逆轉(zhuǎn)錄酶催化的逆轉(zhuǎn)錄過程，③是PCR過程。據(jù)圖分析下列敘述錯(cuò)誤的是（）A.逆轉(zhuǎn)錄酶具有DNA聚合酶能力B.③PCR過程只需要引物bC.RT-PCR可檢測(cè)基因表達(dá)水平D.RT-PCR可檢測(cè)合胞病毒等RNA病毒解析：B③PCR過程需要一對(duì)引物，B錯(cuò)誤。2.（2024·山東濰坊質(zhì)檢）反向PCR流程如圖所示，該技術(shù)可利用一段已知DNA序列設(shè)計(jì)合理的引物，擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列。圖中已知序列一條鏈的堿基排列順序?yàn)椤?'—AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGTAGCCTCT—3'”。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A.Ⅰ酶切：用一種限制酶切割DNA，以使兩端未知序列形成相同的黏性末端B.Ⅱ連接：使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵C.設(shè)計(jì)的兩種引物分別是“5'—AACTATGCGCTCATGA—3'”和“5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'”D.對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。該DNA單鏈序列可能為“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”解析：C由圖可知，經(jīng)過Ⅰ酶切過程后，由于用一種限制酶切割DNA，從而使兩端未知序列形成相同的黏性末端，A正確；Ⅱ過程是將DNA片段連接起來，該過程中使用DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，B正確；設(shè)計(jì)的兩種引物需要與已知序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，而后向兩側(cè)延伸合成未知序列，因此合成的引物分別是“5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'”和“5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'”，C錯(cuò)誤；對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根據(jù)限制酶產(chǎn)生的黏性末端，推測(cè)該DNA單鏈序列可能為“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”，D正確。3.不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法，如圖所示。不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100，PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。下列相關(guān)說法錯(cuò)誤的是（）A.用不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，不需要知道基因的全部序列B.進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致D.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離解析：C不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯(cuò)誤。4.（2024·河北正定一中高三月考）人類猴痘由Yaba猴病毒（雙鏈DNA病毒）引起，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）可用于Yaba猴病毒的快速檢測(cè)。進(jìn)行qPCR時(shí)，在反應(yīng)體系加入TaqMan探針，TaqMan探針兩端連有熒光基團(tuán)（R）和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團(tuán)（Q），完整的TaqMan探針不發(fā)出熒光，當(dāng)探針被水解后R基團(tuán)會(huì)發(fā)出熒光（如圖所示），隨循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加。（1）采用qPCR檢測(cè)Yaba猴病毒需在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，反應(yīng)體系中還需提供DNA模板、原料、引物、TaqMan探針、TaqDNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR過程中，TaqDNA聚合酶的兩個(gè)作用是催化合成DNA子鏈；催化探針?biāo)?。?）qPCR檢測(cè)病毒的核酸一般具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，這與反應(yīng)體系中加入的引物和探針有關(guān)。但有時(shí)也可能會(huì)出現(xiàn)“假陰性”的結(jié)果?？赡艿脑蛴腥硬灰?guī)范；取樣所獲樣本量不足；病毒發(fā)生了基因突變（答出兩點(diǎn)）。（3）在PCR反應(yīng)體系中一般都要加入Mg2＋，原因是TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活。為了探究Mg2＋對(duì)PCR擴(kuò)增效果的影響，科研人員在PCR反應(yīng)體系中加入不同濃度的Mg2＋進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖所示，據(jù)此可得出的結(jié)論有在不含Mg2＋的緩沖液中靶基因幾乎無(wú)法擴(kuò)增；在不同濃度的Mg2＋緩沖液中靶基因的擴(kuò)增效果不同；在實(shí)驗(yàn)濃度下，4mM為最佳濃度。5.（2024·江蘇如皋模擬）巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用兩組不同的引物實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增。第一組外引物擴(kuò)增出的DNA片段（中間產(chǎn)物）長(zhǎng)度超出目標(biāo)區(qū)域，第二組內(nèi)引物稱為巢式引物，其結(jié)合部位在中間產(chǎn)物內(nèi)部的目標(biāo)區(qū)域，從而擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，具體過程如圖所示。請(qǐng)回答下列問題。（1）巢式PCR反應(yīng)體系中需加入DNA模板、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、原料（4種脫氧核苷酸）、引物、Mg2＋、緩沖液等。（2）巢式PCR過程中反應(yīng)溫度最低的一步是復(fù)性。巢式PCR中外引物的第一階段擴(kuò)增和內(nèi)引物的第二階段擴(kuò)增通常在不同的離心管中進(jìn)行，可防止內(nèi)引物在第一階段PCR中與模板結(jié)合。（3）若直接用圖中的內(nèi)引物對(duì)模板DNA擴(kuò)增，則內(nèi)引物與模板的非目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的概率會(huì)上升（填“上升”或“下降”），不易得到目標(biāo)產(chǎn)物。巢式PCR獲得的產(chǎn)物特異性高（填“高”或“低”）。解析：（1）PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)包括三個(gè)基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的復(fù)性、引物的延伸。PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、TaqDNA聚合酶、原料（4種脫氧核苷酸）、模板DNA、Mg2＋。（2）PCR過程包括過程高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸。故巢式PCR過程中反應(yīng)溫度最低的一步是復(fù)性。巢式PCR兩次擴(kuò)增所用的引物是不同的，因此兩個(gè)階段反應(yīng)不在同一試管完成的主要原因是防止內(nèi)引物在第一階段PCR中與模板結(jié)合。（3）巢式PCR通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA片段，第二對(duì)引物的功能是特異性的擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段。第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，從而提高反應(yīng)的特異性獲得的產(chǎn)物特異性更高。若直接用圖中的內(nèi)引物對(duì)模板DNA擴(kuò)增，則內(nèi)引物與模板的非目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的概率會(huì)上升，不易得到目標(biāo)產(chǎn)物。6.（2024·江蘇常州模擬）重疊延伸PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)的衍生，它依據(jù)需要連接的基因中核苷酸序列（或基因片段）設(shè)計(jì)出多對(duì)具有互補(bǔ)末端的引物，先分段對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物混合，其中的重疊鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實(shí)現(xiàn)不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的目的，如圖1所示。請(qǐng)分析并回答下列問題：（1）圖1中的過程②在2個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，原因是引物互補(bǔ)影響PCR結(jié)果。經(jīng)過程②后，體系中存在不同長(zhǎng)度的DNA片段，獲取所需DNA的方法是（瓊脂糖凝膠）電泳分離。①中引物2和引物3的游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。（2）圖1中的過程⑥不需要（填“需要”或“不需要”）另加引物，原因是兩條DNA的交錯(cuò)部分即可作為其延伸的引物。進(jìn)行②⑥⑧⑩過程時(shí)，需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，⑩過程除圖示條件還需要加入原料（四種脫氧核苷酸）、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。（3）重疊延伸PCR技術(shù)可用于基因的定點(diǎn)突變?；蚨c(diǎn)突變是根據(jù)目的基因（如圖2蛋白A基因）的序列，設(shè)計(jì)4條單鏈寡核苷酸片段為引物（圖2中的引物A→D），原理是取引物A、B進(jìn)行PCR1反應(yīng)，以及引物C、D進(jìn)行PCR2反應(yīng)，然后將需要的兩個(gè)片段混合、延伸并大量擴(kuò)增。圖2引物B和引物C中的∧、∨代表突變堿基，引物B和引物C堿基序列間存在的關(guān)系是互補(bǔ)。解析：（1）分析題圖1可知，擴(kuò)增外顯子A需要用引物1和引物2，擴(kuò)增外顯子B需要引物3和引物4，由于引物2和引物3互補(bǔ)，所以需要在兩個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行。DNA分子在瓊脂糖凝膠中時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子泳動(dòng)速度不一樣。由圖1可知，①中引物2和引物3的游離部分分別與外顯子B、外顯子A的部分序列同源。（2）由于引物2有一部分與外顯子A重疊，還有一部分與外顯子B重疊，可作為其延伸的引物，故圖1中的過程⑥不需要另加引物。進(jìn)行②⑥⑧⑩過程就屬于DNA分子的復(fù)制了，所以DNA分子復(fù)制時(shí)需要四種脫氧核苷酸，由于整個(gè)過程在PCR儀器中，所以需要耐高溫的DNA聚合酶。（3）基因定點(diǎn)突變是根據(jù)目的基因的序列，使基因上的某堿基缺失、增添或替換，故圖2引物B和引物C中的“A”代表突變堿基，分析圖2可知，引物B和引物C堿基序列間存在的關(guān)系互補(bǔ)。7.（2021·海南選擇考）CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù)，Cas9基因表達(dá)的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向?qū)NA（sgRNA）引導(dǎo)下，切割DNA雙鏈以敲除目標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示。（1）過程①中，為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對(duì)含有特定sgRNA編碼序列的DNA進(jìn)行酶切處理，然后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過的質(zhì)粒上，插入時(shí)所需要的酶是DNA連接酶。（2）過程②中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（3）過程③～⑤中，sgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體，該復(fù)合體中的sgRNA可識(shí)別并與目標(biāo)DNA序列特異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。隨后，Cas9蛋白可切割目標(biāo)DNA特定的核苷酸序列。（4）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除一個(gè)長(zhǎng)度為1200bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是DNA分子雜交技術(shù)，基因敲除成功的判斷依據(jù)是不出現(xiàn)雜交帶。（5）某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒，隨后將其導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞，通過基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構(gòu)建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡(jiǎn)述CRISPR/Cas9重組