(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN120210079A(21)申請?zhí)?02510695974.4(22)申請日2025.05.28(83)生物保藏信息CCTCCNO:M2025682202CCTCCNO:M2022881202(71)申請人南京農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞研究院地址572025海南省三亞市崖州灣科技城振州路梧桐產(chǎn)業(yè)園區(qū)9棟(72)發(fā)明人李偉姜文鎧肖路遙趙小淦(74)專利代理機構(gòu)北京領(lǐng)果世紀(jì)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司16221專利代理師劉元仁A23L33/135(2016.01)(54)發(fā)明名稱一種緩解急性醉酒的益生菌組合物及其制備方法和應(yīng)用(57)摘要本發(fā)明公開了一種緩解急性醉酒的益生菌組合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于益生菌應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種緩解急性醉酒的益生菌組合物，其特征在于，所述益生菌組合物包括副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360;所述副干酪乳桿菌STB保藏編號為CCTCCNO:M2022881;所述羅伊氏粘液乳桿菌組合組通過副干酪乳桿菌STB和羅伊氏粘液乳桿菌Care360總超21.一種緩解急性醉酒的益生菌組合物，其特征在于，所述益生菌組合物包括副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和羅伊氏粘液乳桿菌Care360Limosilactobacillus所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB于2022年6月14日保藏于中國所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360于2025年4月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為2.根據(jù)權(quán)利要求1所述益生菌組合物，其特征在于，所述益生菌組合物中所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和所述羅伊氏粘液乳桿菌CareLimosilactobacillusreuteriCare360的質(zhì)量比為1:1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述益生菌組合物，其特征在于，所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB的有效活菌數(shù)為2×10?~4.5×10?CFU/mL,所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的有效活菌數(shù)為3×10?~4.1×4.如權(quán)利要求1~3任一項所述益生菌組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB接種于MRS液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵，得副干酪乳桿菌發(fā)酵液；(2)羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360接種于MRS液(3)步驟(1)所得副干酪乳桿菌發(fā)酵液，離心，得副干酪乳桿菌菌泥，副干酪乳桿菌菌泥采用生理鹽水重懸，得副干酪乳桿菌菌懸液；(4)步驟(2)所得羅伊氏粘液乳桿菌發(fā)酵液，離心，得羅伊氏粘液乳桿菌菌泥，羅伊氏粘液乳桿菌菌泥采用生理鹽水重懸，得羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液；(5)步驟(3)所得副干酪乳桿菌菌懸液與步驟(4)所得羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液按照質(zhì)5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB的接種量按照MRS液體培養(yǎng)基的體積的2~6%計算；步驟(1)中所述發(fā)酵的溫度為37℃,發(fā)酵的時間為8~16h。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的接種量按照MRS液體培養(yǎng)基的體積的2~6%計算；步驟(2)中所述發(fā)酵的溫度為37℃,發(fā)酵的時間為8~16h。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述離心的溫度為0~4℃,離心的轉(zhuǎn)速為5000~7000rpm,離心的時間為4~6min;步驟(3)中所述副干酪乳桿菌菌懸液中有效活菌數(shù)為2×10?~4.5×10CFU/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述離心的溫度為0~4℃,離心的轉(zhuǎn)速為5000~7000rpm,離心的時間為4~6min;步驟(4)中所述羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液中有效活菌數(shù)為3×10?~4.1×108CFU/mL。9.如權(quán)利要求1~3任一項所述益生菌組合物在制備快速解酒護肝產(chǎn)品中的應(yīng)用。310.如權(quán)利要求4~8任一項所述制備方法制備所得益生菌組合物在制備快速解酒護肝產(chǎn)品中的應(yīng)用。4一種緩解急性醉酒的益生菌組合物及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于益生菌應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種緩解急性醉酒的益生菌組合物及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]我國的酒類消費額一直處在前列，據(jù)目前領(lǐng)域內(nèi)研究和調(diào)查報告顯示，由于過度飲用乙醇而造成肝臟損害的人群量不可忽視。就現(xiàn)今而言，酒類在大多數(shù)人群的日常生活中扮演著不可或缺的角色，基于此催生出如何解決人短時間攝入醉酒量酒類緊急緩解醉酒的問題。另外，大多數(shù)人對乙醇的分解代謝速率較低，從而加重了乙醇對機體健康損害的發(fā)生概率。研究表明，短期內(nèi)飲用酒類醉酒后不僅會造成機體產(chǎn)生多種不適的癥狀，同時也會增加誘發(fā)潛在的患炎等病癥風(fēng)險。近年來，市面上出現(xiàn)大量產(chǎn)品多集中于治療或緩解急性或慢性酒精性肝損傷，主要包括抗氧化劑、抗炎藥物、保肝藥物以及益生菌等，但這些藥物存在副作用大、療效有限和效果有限等問題。[0003]近幾年領(lǐng)域內(nèi)有數(shù)量不少的專利中提到使用益生菌來緩解酒精性肝損傷和酒后不適癥狀。例如，公開號為CN117987307A,名稱為《一株能緩解急性酒精性肝損傷的酸魚乳acidipiscis)具有顯著的乙醇耐受性，能夠緩解酒精性肝損傷；公開號為CN117801991A,名稱為《用于緩解酒后不適癥狀的益生菌后生元組合物及用途》則提到使用動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)ProSci-246的益生菌后生元組合物來緩解酒后不適癥狀；公開號為CN114426942A,名稱為《一種重組乳酸乳球菌、微膠囊及其應(yīng)用》提到通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組乳酸乳球菌，表達(dá)乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH),以分解酒精，減少酒精對肝臟和腸道的損傷；公開號為CN116622559A,名稱為《一種產(chǎn)乙醛脫氫酶的干酪乳桿菌、解酒益生菌組合物及其制備方法》提到使用產(chǎn)乙醛脫氫酶的干酪乳備解酒益生菌組合物，具有解酒和保肝護肝的作用；公開號為CN117801991A,名稱為《用于緩解酒后不適癥狀的益生菌后生元組合物及用途》提到使用益生菌的滅活菌體、菌體成分及其代謝產(chǎn)物(后生元)來緩解酒后不適癥狀，如延長酒精耐受時間、縮短醉酒時間等。[0004]盡管益生菌在解酒領(lǐng)域顯示出一定的效果，但現(xiàn)有技術(shù)中單一菌株的效果有限。例如，公開號為CN116622559A,名稱為《一種產(chǎn)乙醛脫氫酶的干酪乳桿菌、解酒益生菌組合物及其制備方法》提到現(xiàn)有技術(shù)中通常需要多種益生菌或與中藥成分配合才能達(dá)到較好的解酒效果，而單一菌株的效果尚未得到充分驗證，現(xiàn)有的解酒產(chǎn)品雖然能夠緩解部分酒后不適癥狀，但解酒效果仍然不夠顯著,尤其是在急性酒精性肝損傷的情況下，現(xiàn)有的益生菌組合物可能無法完全緩解酒精對肝臟的損傷，酗酒者腸道菌群嚴(yán)重紊亂，現(xiàn)有的益生菌產(chǎn)品雖然能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，但效果有限，無法完全恢復(fù)腸道菌群的平衡，尤其是在長期酗酒的情況下；公開號為CN117987307A,名稱為《一株能緩解急性酒精性肝損傷的酸魚乳桿菌及應(yīng)用》提到現(xiàn)有的藥物治療雖然具有一定的抗炎抗氧化作用，但藥物的攝入可能帶來副作5用，甚至加重肝臟負(fù)擔(dān)，因此，開發(fā)安全有效的解酒方法仍然是一個挑戰(zhàn)；公開號為CN114426942A,名稱為《一種重組乳酸乳球菌、微膠囊及其應(yīng)用》提到現(xiàn)有的解酒產(chǎn)品雖然能夠縮短飲酒后的恢復(fù)時間，但解酒速度仍然較慢，尤其是在大量飲酒后，現(xiàn)有的益生菌產(chǎn)品無法迅速分解酒精，導(dǎo)致醉酒時間較長?，F(xiàn)有的益生菌解酒產(chǎn)品在緩解急性醉酒方面并未存在較為細(xì)致的相關(guān)研究，亟需開發(fā)一種更有效、實用的益生菌組合物。發(fā)明內(nèi)容[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種緩解急性醉酒的益生菌組合物及其制備方法和應(yīng)用，益生菌組合組通過副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360組合，能夠有效緩解急性[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種緩解急性醉酒的益生菌組合物，所述益生菌組合物包括副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和羅伊氏粘液乳桿菌所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB于2022年6月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCCNO:所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360于2025年4月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為[0007]優(yōu)選的，所述益生菌組合物中所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB和所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的質(zhì)量比為1:1。[0008]優(yōu)選的，所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacas×10?~4.5×10?CFU/mL,所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的有效活菌數(shù)為3×10?~4.1×10?CFU/mL。[0009]本發(fā)明還提供了所述益生菌組合物的制備方法，包括以下步驟：(1)副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB接種于MRS液體培養(yǎng)基中，(2)羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360接種于(3)步驟(1)所得副干酪乳桿菌發(fā)酵液，離心，得副干酪乳桿菌菌泥，副干酪乳桿菌菌泥采用生理鹽水重懸，得副干酪乳桿菌菌懸液；(4)步驟(2)所得羅伊氏粘液乳桿菌發(fā)酵液，離心，得羅伊氏粘液乳桿菌菌泥，羅伊氏粘液乳桿菌菌泥采用生理鹽水重懸，得羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液；(5)步驟(3)所得副干酪乳桿菌菌懸液與步驟(4)所得羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液按照質(zhì)量比1:1混合，即得益生菌組合物。[0010]優(yōu)選的，步驟(1)中所述副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB的接種量按照MRS液體培養(yǎng)基的體積的2~6%計算；步驟(1)中所述發(fā)酵的溫度為37℃,發(fā)酵的時間6為8~16h。[0011]優(yōu)選的，步驟(2)中所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的接種量按照MRS液體培養(yǎng)基的體積的2~6%計算；步驟(2)中所述發(fā)酵的溫度為37℃,發(fā)酵的時間為8~16h。[0012]優(yōu)選的，步驟(3)中所述離心的溫度為0~4℃,離心的轉(zhuǎn)速為5000~7000rpm,離心的時間為4~6min;步驟(3)中所述副干酪乳桿菌菌懸液中有效活菌數(shù)為2×10?~4.5×10?CFU/[0013]優(yōu)選的，步驟(4)中所述離心的溫度為0~4℃,離心的轉(zhuǎn)速為5000~7000rpm,離心的時間為4~6min;步驟(4)中所述羅伊氏粘液乳桿菌菌懸液中有效活菌數(shù)為3×10?~4.1×[0014]本發(fā)明還提供了所述益生菌組合物在制備快速解酒護肝產(chǎn)品中的應(yīng)用。[0015]本發(fā)明還提供了所述制備方法制備所得益生菌組合物在制備快速解酒護肝產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明首次使用羅伊氏粘液乳桿菌Care360Limosilactobacillusreuteri均具有高耐胃酸、耐膽鹽的特性，能夠在腸道中存活并產(chǎn)生大量乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，從而有效分解酒精及其代謝產(chǎn)物乙醛，進而緩解急性醉酒帶來的不適癥狀以及減少由此誘發(fā)的炎癥的可能性。通過將高產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360和高耐胃酸、耐膽鹽的副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB組合搭配，這一搭配具有緩解急性醉酒的作用，能夠協(xié)同緩解急性醉酒和預(yù)防過度飲酒的帶來的機體炎癥等損傷。該菌搭配緩解急性醉酒更加貼合實際使用的場景，能夠更加真實的反映其解酒的作用，進一步提高乳桿菌組合對急性醉酒的保護效果。附圖說明[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖2為羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360進化圖3為不同菌株乙醇脫氫酶活力熱圖；圖4為不同菌株乙醛脫氫酶活力熱圖；圖5為不同菌株耐受乙醇的活菌數(shù)圖；圖6為不同菌株耐受乙醛的活菌數(shù)圖；圖7為不同處理組小鼠耐受乙醇時間圖；圖8為不同處理組小鼠血乙醇水平圖；7圖9為不同處理組小鼠血乙醛水平圖；圖10為不同處理組小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶活力圖；圖11為不同處理組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力圖；圖12為不同處理組小鼠肝臟乙醇脫氫酶活力圖；圖13為不同處理組小鼠肝臟乙醛脫氫酶活力圖；圖14為不同處理組小鼠肝臟還原型谷胱甘肽含量圖；圖15為不同處理組小鼠肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活力圖；圖16為不同處理組小鼠肝臟丙二醛含量圖；圖17為不同處理組小鼠肝臟過氧化氫酶活力圖；圖18為不同處理組小鼠肝臟總抗氧化能力圖；圖19為不同處理組小鼠肝臟總超氧化物歧化酶活力圖。具體實施方式[0019]現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實施方案的更詳細(xì)的描述。[0020]應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在范圍內(nèi)。[0021]除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。[0022]在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對本發(fā)明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實施方式對技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明說明書和實施例僅是示例性的。意指包含但不限于。副干酪乳桿菌STBLactobacillusparacaseiSTB(副干酪乳桿菌STB)和羅伊氏粘液乳桿菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360(羅伊氏粘液乳桿菌Care360)分類和種類鑒定。在分支結(jié)點為99%,說明STB與Lactobacillusparacasei親緣關(guān)系很近。因此最終確定菌株STB為副干酪乳桿菌STB。TACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC8CGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACACGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTTCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGAC20016處于同一進化分支，所在分支結(jié)點為100%,說明Care360與Limosilactobacillusreuterisubsp.reuteri親緣關(guān)系很近。因此最終確定菌株Care360為羅伊氏粘液乳桿菌CCATAATGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCACGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGCTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAAATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATTTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTTCCGAAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGGATACCGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACTTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTAC9[0029]實施例2一、高活力胞內(nèi)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的乳桿菌篩選。[0030]1、菌株來源。[0031]所使用的菌株均來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實驗室儲備的菌種庫。[0032]2、培養(yǎng)基的配制。[0033]所用的培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，成分如下：蛋白胨10.0g,葡萄糖20.0g,牛肉膏10.0g,酵母浸膏5.0g,無水醋酸鈉5.0g,檸檬酸三銨2.0g,K?HPO?2.0g,MgSO?·7H?00.58g,MnSO?·4H?00.25g,吐溫-801.0mL,蒸餾水1000.0mL,調(diào)節(jié)pH至6.8,121℃滅菌20min。次離心，棄上清收集菌體，稱取菌體鮮重，加入生理鹽水(質(zhì)量濃度為0.85%的氯化鈉水溶液)重懸菌體，冰浴中400W功率超聲破碎30min,工作1s停止2s后鏡檢是否細(xì)胞破碎完全。8000rpm、4℃離心10min,收集上清液，即為粗酶液。放入4℃冰盒中暫存，盡快進行活性測定。按照乙醇脫氫酶(ADH)測試盒(品目號：A083-2-1,南京建成生物工程研究所)使用說明L混合液至96孔板，340nm處讀吸光度A1,迅速將反應(yīng)液置于37℃水浴鍋中水浴10min后取出，340nm處讀吸光度A2,計算△A=A2-A1,每組試驗平行三次。其中A3為空白樣品反應(yīng)前的1,南京建成生物工程研究所)中提取液，冰浴中400W功率超聲破碎30min,工作1s停止2s后冰盒中暫存，盡快進行活性測定。按照試劑盒使用說明配制工作液，并按要求加入待測樣品。樣品與工作液混合均勻后，取200μL至96孔板，340nm處讀吸光度A1,37℃溫浴5min,340nm處讀吸光度A2,計算△A=A2-A1,每組三個平行。[0038]ALDH(U/g鮮重)=(322×△A)/W;[0039]二、體外耐乙醇和乙醛能力測試。[0040]將“一、高活力胞內(nèi)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的乳桿菌篩選”中篩選出的8株乳酸菌分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，活化傳代兩次(將冷凍保存的乳桿菌按照體積比計算接種量為4%,接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h,取活化后的菌液按照積比計算接種量為4%,再次接入新的活化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h,得乳桿菌的二次活化發(fā)酵液),再以4%的接種量分別接入15%、10%、5%、0%乙醇濃度和100×(100mL中加入42μL0.4%乙醛溶液)、50×、10×、0×乙醛濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h后，在無菌條件下取1mL活化后的樣品加入到9mL0.85%無菌生理鹽水中，稀釋成10?1濃度的稀釋液，從稀釋液中吸取1mL加入裝有9mL0.85%無菌生理鹽水的試管中稀釋為10?2濃度的稀釋液。如此依次稀釋，得到10?3、10??、10??、10??、10??、10?8倍數(shù)的稀釋液。選取10??、10??、10??、10??濃度的稀釋液，各吸取0.2mL分別均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板中，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h,對各菌株的耐[0042]益生菌發(fā)酵：將二次活化(將冷凍保存的乳桿菌按照體積比計算接種量為4%,接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h,取活化后的菌液按照體積比計算接種量為4%,再次接入新的活化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h,得乳桿菌的二次活化發(fā)酵液)的副干酪乳桿菌STB和羅伊氏粘液乳桿菌Care360的活化液按照MRS液體培養(yǎng)基總體積的4%接種量，分別均接種至MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下發(fā)酵12h,得到發(fā)酵液。[0044]組合物制備：將兩種益生菌發(fā)酵液分別，4℃,6000rpm條件下離心5min,倒去上清，再用生理鹽水混勻重懸菌泥在4℃,6000rpm條件下離心5min,重復(fù)2次，繼而再用生理鹽水混勻制備菌懸液，最后按體積1:1比例將兩種益生菌混合(副干酪乳桿菌STB的有效活菌數(shù)為3.25×10CFU/mL,所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360的有效活菌數(shù)為3.55×10?CFU/mL)。[0045]四、乳桿菌搭配組合物動物體內(nèi)的緩解急性醉酒效果驗證。[0046]1)醉酒方案的確定：從超市購買的紅星二鍋頭(清香型酒，56%vol)被選擇用于小鼠醉酒實驗。[0047]為建立安全穩(wěn)定的急性醉酒模型，9周齡雄性BALB/c小鼠體重25±2g,隨機分為3組(每組n=8),分別給予4mg/g的標(biāo)準(zhǔn)。簡單地說，老鼠的背部被放在地上，腹部和四肢朝上。如果小鼠在30s內(nèi)不能翻身，則認(rèn)為其失去了正常的翻正反射。將翻正反射消失的時間點定義為醉酒點，將第一次飲酒到醉酒之間的時間點定義為酒精耐受時間。三組小鼠的酒精耐受時間均小于20min,為了排除個體差異的影響，我們定義1h內(nèi)沒有喪失翻正反射的小鼠被認(rèn)為沒有急性醉酒?？紤]到;[0048]表1建立急性醉酒模型;對應(yīng)二鍋頭體積小鼠數(shù)目888[0049]2)動物實驗：取9周齡雄性BALB/c,小鼠體重25±2g,隨機分為8種處理組(每種處理組n=8)隨機均分為空白對照組、植物乳植桿菌STB9b菌液組、副干酪乳桿菌STB菌液組、羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組、植物乳植桿菌STB9b菌液+副干酪乳桿菌STB菌液組、植物乳植桿菌STB9b菌+羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組、副干酪乳桿菌STB菌+羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組和植物乳植桿菌STB9b菌液+副干酪乳桿菌STB菌液組+羅伊氏粘液[0050]實驗前禁食不禁水3h,最后再禁食禁水1h,空白對照組小鼠服用等量體積(0.01mL/gBW)生理鹽水后2h再灌白酒；植物乳植桿菌9b菌液組小鼠灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(0D?0=1.0)的(0.01mL/gBW)生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；副干酪乳桿菌STB11菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(OD?0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(0D?0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；植物乳植桿菌9b菌液+副干酪乳桿菌STB菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(0D60=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；植物乳植桿菌9b菌+羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(OD600=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；副干酪乳桿菌STB+羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(0D?0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒；植物乳植桿菌9b菌液+副干酪乳桿菌STB菌液組+羅伊氏粘液乳桿菌Care360菌液組小鼠每次灌胃服用菌數(shù)1×10?cfu/mL(OD600=1.0)的(0.01mL/gBW的生理鹽水菌懸液后2h再灌白酒。[0052]觀察小鼠活動情況，以小鼠后腹拖地、爬行不穩(wěn)、閉眼懶動等為睡眠(醉酒)指標(biāo)，[0053]對急性醉酒小鼠血液中乙醇、乙醛等濃度的影響：灌胃處理后2h,摘眼球取血，收集血液，將血液在室溫下3000×g,離心15min,得到血清，利用乙醇含量檢測試劑盒(品目號：BC6030,北京索萊寶科技有限公司)、乙醛含量測定試劑盒(品目號：BL1839B,蘭杰柯科技有限公司)測定小鼠血清中乙醇、乙醛含量，使用相應(yīng)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒(品目1,南京建成生物工程研究所)檢測血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。[0054]對急性醉酒小鼠肝臟中乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)等活力的影響：各組摘除眼球采血完成后，頸椎脫臼處死后，立即解剖，快速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗并用濾紙吸干，剪取少量肝臟以生理鹽水為勻漿介質(zhì)制備10%肝勻漿，3000×g離心15min取上清，根據(jù)ADH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)、ALDH檢測試劑盒(南京建胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)(抗氧化指標(biāo))等含量。[0056]1)體外實驗中，如圖3、圖4、圖5和圖6所示，對乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活力較高的菌株進行篩選，得到8株相關(guān)酶活力較優(yōu)異的乳桿菌。進而，繼續(xù)測定上述8株乳桿菌的體外耐受乙醇和乙醛的能力，最后得出兩株產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活力較高且耐受乙醇和乙醛能力較強的乳桿菌。[0057]2)結(jié)合大多數(shù)人群實際日常生活中的飲酒場景，使用上述得到的兩株菌和一株自身擁有較強耐酸、胃腸消化的菌株進行搭配組合，進一步探究其在小鼠醉酒的緩解效果。就最直觀的數(shù)據(jù)而言，如圖7所示，基于小鼠灌酒后到徹底醉酒的耐受時間來看，單獨使用3株菌灌胃于小鼠發(fā)現(xiàn)植物乳植桿菌9b處理組的耐受時間最長，但菌株組合搭配灌胃小鼠，羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合處理小鼠的耐受時間最長。下一步，在對小鼠灌胃處理2h后，通過眼球取血和解剖，對小鼠血清和肝臟的相關(guān)指標(biāo)進行測定，對比完全未經(jīng)處理、未灌酒的小鼠組和灌胃生理鹽水后再灌酒組，如圖8和圖9所示，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中乙醇和乙醛含量，也是大致符合耐受時間結(jié)果的趨勢，單一菌株處理中植物乳植桿菌9b的含量相對更低，羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合處理的含量相對最低；如圖10和圖11所示，同時小鼠血清中AST、ALT活力是反映小鼠肝臟受損程度的指標(biāo)，也得到了大致類似的結(jié)果。此外，本實驗也更加的檢測了小鼠肝臟中的部分指標(biāo)，如圖12和圖13所示，就最相關(guān)的肝臟中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶活力的結(jié)果而言，也是，單一菌株處理中植物乳植桿菌9b的含量相對更低，羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌搭配組合處理的含量相對最低，這可能是灌胃的乳桿菌自身的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶對小鼠攝入的乙醇和乙醛降解，發(fā)揮代償作用。明發(fā)現(xiàn)一種對緩解急性醉酒有著較優(yōu)秀效果的羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合，對應(yīng)對人群中更加普遍的飲酒需求給出更加具有應(yīng)用場景的實例和參考。[0059]動物實驗結(jié)果表明，羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合物對小鼠清醒至醉酒的時間相比與未服用益生菌的小鼠有著顯著的延長。本發(fā)明羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合菌選取《可用于食品的菌種名單》,因而不存在與市面上已有的解酒藥物般的副作用。本發(fā)明益生菌組合物通過特定的益生菌菌株及其代謝損傷。本發(fā)明益生菌組合物具有顯著的抗氧化和抗炎作用，能夠減少由過度飲酒而引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。[0060]該乳桿菌在體外和體內(nèi)實驗中均表現(xiàn)出顯著的降解乙醇和乙醛的能力或效果，其活性優(yōu)于現(xiàn)有大多數(shù)乳桿菌。[0061]本發(fā)明所述羅伊氏粘液乳桿菌Care360和副干酪乳桿菌STB搭配組合物通過抑制ROS(活性氧)和促進抗氧化物酶的活力