(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(72)發(fā)明人陳啟和張圣良劉東紅蘆紅云徐恩波(74)專利代理機構(gòu)北京高沃律師事務(wù)所11569一種以米粒為支架一步法培養(yǎng)大黃魚細胞本發(fā)明提供了一種以米粒為支架一步法培大黃魚成肌細胞和/或前體脂肪細胞在米粒支架21.大米作為支架在大黃魚細胞制備細胞培養(yǎng)肉中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述大米中直鏈淀粉占總淀粉的質(zhì)量百分比為70%~95%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述大米的種類包括以下至少一種：東北大4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述大米包括不經(jīng)浸泡處理的大米和/或經(jīng)過水浸泡處理的大米；所述經(jīng)過水浸泡處理的大米為水浸泡48h以內(nèi)的大米。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項所述應(yīng)用，其特征在于，所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃前體脂肪細胞。6.一種以大米為支架制備細胞培養(yǎng)肉的方法，其特征在于，包括以下步驟：將大黃魚細胞接種至大米表面進行增殖培養(yǎng)，待細胞匯合度達到75%~85%進行分化培7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述大米中直鏈淀粉占總淀粉的質(zhì)量百分比為70%~95%。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)用細胞培養(yǎng)基為含體積百分比所述分化培養(yǎng)用分化培養(yǎng)基為含體積濃度6%~10%FBS、8~12ng/mLbFGF、4~6μM所述增殖培養(yǎng)或分化培養(yǎng)的溫度為25~30℃;所述分化培養(yǎng)的時間為20~240h;所述增殖培養(yǎng)時，大黃魚細胞的接種密度為10?~10?個/mL細胞培養(yǎng)基；所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃前體脂肪細胞。9.一種權(quán)利要求6~8任意一項所述方法制備得到的細胞培養(yǎng)肉。10.一種動植物復(fù)合食品，其特征在于，原料包括權(quán)利要求9所述細胞培養(yǎng)肉。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以米粒為支架一步法培養(yǎng)大黃魚細胞為動植物復(fù)合食品的方法。背景技術(shù)[0002]隨著經(jīng)濟社會發(fā)展，人類對肉類的需求越來越大，而傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式已經(jīng)難以滿足人類的需求，并且傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式需要消耗大量糧食、水資源和占用土地資源，還會造成嚴(yán)重污染環(huán)境。細胞培養(yǎng)肉(Culturedmeat)通過提取動物肌肉干細胞進行體外培養(yǎng)，進而分化成肌纖維。細胞培養(yǎng)肉涉及到干細胞的分離與純化、干細胞的增殖與分化等過程，生產(chǎn)過程中僅需要培養(yǎng)基、一定的溫度和濕度、二氧化碳等來提供營養(yǎng)和生長所需的環(huán)境，不會造成環(huán)境污染，不需要消耗傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)中所需要的飼料和水，并且占地面積小，節(jié)約了空間成本，是未來人造肉的主要研究發(fā)展方向。[0003]魚肉具有肉質(zhì)細嫩鮮美、營養(yǎng)豐富的特點，是一些維生素、礦物質(zhì)的良好來源。但是魚肉依賴于人工養(yǎng)殖和自然捕撈，費時費力。因此，開發(fā)魚細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)細胞培養(yǎng)魚肉以滿足人類需求是解決魚資源快速獲得的一種手段。基于此獲取合適的細胞培養(yǎng)支架是細胞培養(yǎng)肉工廠化生產(chǎn)中的重要一環(huán)。因此，如何獲取一種適用于魚類肌肉干細胞體外培養(yǎng)的安全性、可持續(xù)性的健康天然支架材料是目前需要解決的問題。發(fā)明內(nèi)容[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種以米粒為支架一步法培養(yǎng)大黃魚細胞為動植物復(fù)合食品的方法，通過選擇富含直鏈淀粉的稻米為支架載體，接種大黃魚成肌細胞進行培養(yǎng)和分化，得到具有魚肉營養(yǎng)和風(fēng)味的動植物復(fù)合食品。[0005]本發(fā)明提供了大米作為支架在大黃魚細胞制備細胞培養(yǎng)肉中的應(yīng)用。[0006]優(yōu)選的，所述大米中直鏈淀粉占總淀粉的質(zhì)量百分比為70%~95%。[0007]優(yōu)選的，所述大米的種類包括以下至少一種：東北大米、長粒香米和泰國茉莉香[0008]優(yōu)選的，所述大米包括不經(jīng)浸泡處理的大米和/或經(jīng)過水浸泡處理的大米；所述經(jīng)過水浸泡處理的大米為水浸泡48h以內(nèi)的大米。[0009]優(yōu)選的，所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃前體脂肪細胞。[0010]本發(fā)明提供了一種以大米為支架制備細胞培養(yǎng)肉的方法，包括以下步驟：將大黃魚細胞接種至大米表面進行增殖培養(yǎng)，待細胞匯合度達到75%~85%進行分[0011]優(yōu)選的，所述大米中直鏈淀粉占總淀粉的質(zhì)量百分比為70%~95%。[0012]優(yōu)選的，所述增殖培養(yǎng)用細胞培養(yǎng)基為含體積百分比9%~11%%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；4所述分化培養(yǎng)用分化培養(yǎng)基為含體積濃度6%~10%FBS、8~12ng/mLbFGF、4~6μM所述增殖培養(yǎng)或分化培養(yǎng)的溫度為25~30℃;所述分化培養(yǎng)的時間為20~240h;所述增殖培養(yǎng)時，大黃魚細胞的接種密度為10?~10?個/mL細胞培養(yǎng)基；所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃前體脂肪細胞。[0013]本發(fā)明提供了一種所述方法制備得到的細胞培養(yǎng)肉。[0014]本發(fā)明提供了一種動植物復(fù)合食品，原料包括上述技術(shù)方案所述細胞培養(yǎng)肉。[0015]本發(fā)明提供了大米作為支架在大黃魚細胞制備細胞培養(yǎng)肉中的應(yīng)用。本發(fā)明以大米作為細胞培養(yǎng)肉支架，相較于其他天然支架材料，米粒不含過敏源、營養(yǎng)豐富、表面富含多孔結(jié)構(gòu)且半結(jié)晶和結(jié)晶區(qū)域交叉排列，有利于大黃魚細胞的生長，且成本低廉，是一種安全、健康和可持續(xù)性的天然支架材料，使用時無需任何處理，操作簡單，為之后的細胞培養(yǎng)肉的規(guī)?；a(chǎn)提供了保障。實施例結(jié)果表明，所述大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞不僅能在大米粒上生長，而且使制備的細胞培養(yǎng)肉既具有稻米香味，還具有魚肉營養(yǎng)和風(fēng)味?？梢姟１景l(fā)明提供的方法將大黃魚細胞接種到稻米上增殖和分化，可生產(chǎn)出營養(yǎng)豐富、口感優(yōu)良的新型細胞培養(yǎng)肉，從而豐富動植物復(fù)合食品的原料，為未來文化食品的發(fā)展提供了一種新的思路。[0016]本發(fā)明提供的應(yīng)用，進一步限定了大米中直鏈淀粉的含量。米粒的硬度是影響細胞生長的關(guān)鍵因素之一。實驗表明，不同種類的大米粒作為支架一定程度上影響著大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞的生長和分化性能，且直鏈淀粉含量越豐富，大米粒的硬度越高，越有利于大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞的增殖，例如泰國茉莉香米中直鏈淀粉含量最高，大黃魚細胞在泰國茉莉香米的生物量最高；長粒香米中直鏈淀粉含量次之，東北大米的直鏈淀粉含量較低，對應(yīng)的大黃魚細胞生物量相對較低。[0017]本發(fā)明提供的應(yīng)用，進一步限定了大米的浸泡時間。不同浸泡時間通過影響米粒的硬度從而影響大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞在米粒上的生長情況。實驗結(jié)果表明，浸泡4h、24h和48h的硬度沒有顯著差別，但是浸泡72h后，光顯微鏡下觀察細胞在浸泡4h、24h和48h的米粒上的數(shù)量沒有顯著差別，但是浸泡72h的米粒上細胞顯著減少。附圖說明[0018]圖1為大黃魚成肌細胞在不同品種稻米米粒上的生長情況圖；圖2為大黃魚DNA檢測結(jié)果，其中A為大黃魚成肌細胞分別在東北大米、長粒香泰國茉莉香米上的DNA總含量測定結(jié)果，B為大黃魚成肌細胞分別在長粒香米和泰國茉莉香米相對于在東北大米上的DNA相對表達量；圖3為不同品種稻米檢測結(jié)果，其中A為通過X射線測量不同米粒的結(jié)晶度結(jié)果；B為通過質(zhì)構(gòu)儀測定不同米粒的硬度結(jié)果；C為不同米粒的拉曼光譜測定結(jié)果；D為不同米粒的直鏈淀粉含量結(jié)果；圖4為不同浸泡時間對大黃魚成肌細胞在泰國茉莉香米上生長的影響結(jié)果，其中A為在泰國茉莉香米浸泡4h、24h、48h和72h后大黃魚成肌細胞在其上生長的熒光顯微圖片；B為在泰國茉莉香米浸泡4h、24h、48h和72h后大黃魚成肌細胞在其上生長的DNA總含量；C為5質(zhì)構(gòu)儀測量泰國茉莉香米在浸泡4h、24h、48h和72h后硬度結(jié)果；圖5為免疫熒光染色檢測米粒上分化后的分化標(biāo)志蛋白結(jié)蛋白結(jié)果，其中A為大黃魚成肌細胞在米粒上分化后的分化標(biāo)志蛋白結(jié)蛋白免疫熒光染色圖片；B為大黃魚前體脂肪細胞在米粒上分化后的分化標(biāo)志蛋白的免疫熒光染色圖片；圖6為本發(fā)明制備的大黃魚肌組織的細胞培養(yǎng)肉的檢測結(jié)果，其中，A為不同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉的營養(yǎng)成分；B為不同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉的風(fēng)味測定結(jié)果。具體實施方式[0019]本發(fā)明提供了大米作為支架在大黃魚干細胞制備細胞培養(yǎng)肉中的應(yīng)用。所述大米的形態(tài)優(yōu)選為大米粒。所述大米為天然支架材料，無需經(jīng)過任何處理，且所述大米[0021]在本發(fā)明中，所述大米中直鏈淀粉占總淀粉的質(zhì)量百分比為70%~95%,可以為75%~85%。所述大米的種類優(yōu)選包括以下至少一種：東北大米、長粒香米明一個實施例中，實驗表明，大黃魚成肌細胞在不同米粒上生長情況有差別，與蘇北大米和圓糯米相比，大黃魚成肌細胞在東北大米、長粒香米和泰國茉莉香米上大量生長。通過測定不同品種米粒的理化性質(zhì)，結(jié)果表明結(jié)晶度在三種米粒中沒有顯著差別，硬度和直鏈淀粉含量呈正比，且泰國茉莉香米的直鏈淀粉含量和硬度最高，長粒香米次之，東北大米相對較低。該結(jié)果表明米粒的硬度可能是影響細胞生長的關(guān)鍵因素。[0022]在本發(fā)明中，所述大米優(yōu)選包括不經(jīng)浸泡處理的大米和/或經(jīng)過水浸泡處理的大米。所述經(jīng)過水浸泡處理的大米優(yōu)選為PBS水溶液浸泡48h以內(nèi)的大米。在本發(fā)明另一個實施例中，為了進一步探究米粒硬度對大黃魚肌肉干細胞的影響，分別將米粒用水浸泡4h、24h、48h和72h,測定米粒硬度，以及用于培養(yǎng)大黃魚肌肉干泡4h、24h、48h的米粒硬度上沒有達到顯著性差別，同時細胞生長數(shù)量沒有顯著差別，而用水浸泡72h的米粒硬度較其他組顯著下降，同時細胞生長數(shù)量也相應(yīng)顯著下降。這進一步證實了硬度是影響細胞生長的關(guān)鍵因素之一。[0023]在本發(fā)明中，所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞。所述大黃魚成肌細胞經(jīng)增殖和分化形成為肌肉細胞，形成肌肉組織。大黃魚前體脂肪細胞經(jīng)增殖和分化形成為脂肪細胞，可形成脂肪組織。所述成肌細胞來源于大黃魚軸上肌。所述前體脂肪細胞來源于腹膜脂肪組織。[0024]在本發(fā)明中，所述細胞培養(yǎng)肉是指在米粒上生長，通過吸收利用米粒中營養(yǎng)成分(碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪含量)使成肌細胞和/或前體脂肪細胞增殖和分化，最終形成富含肌組織和脂肪組織的魚肉米粒。[0025]本發(fā)明提供了一種以大米為支架制備細胞培養(yǎng)肉的方法，包括以下步驟：將大黃魚細胞接種至大米表面進行增殖培養(yǎng)，待細胞匯合度達到75%~85%進行分[0026]在本發(fā)明中，所述大黃魚細胞包括大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞。所述大黃魚肌肉干細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞的種類同上述技術(shù)方案，在此不做贅述。6[0027]在本發(fā)明中，所述大米中直鏈淀粉和硬度以及種類同上述技術(shù)方案記載，在此不做贅述。所述大米在接種前，優(yōu)選進行消毒。所述消毒的方法優(yōu)選為體積濃度75%酒精浸泡2h。所述消毒后，優(yōu)選對消毒后的大米進行洗滌，以便去除酒精殘留。所述洗滌用溶液優(yōu)選為PBS溶液。所述洗滌的次數(shù)為2~4次，優(yōu)選為3次。所述洗滌的時間優(yōu)選為4~6min/次，可以為5min/次。[0028]在本發(fā)明中，所述增殖培養(yǎng)時，大黃魚細胞的接種密度優(yōu)選為10?~10?個/mL細胞培養(yǎng)基，可以為10?~10?個/mL細胞培養(yǎng)基。所述增殖培養(yǎng)用細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含體積百分比9%所述增殖培養(yǎng)或分化培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25~30℃,可以為26~28℃。所述增殖培養(yǎng)的時間優(yōu)選為20~96h,可以為4h。所述分化培養(yǎng)用分化培養(yǎng)基優(yōu)選為6%~10%FBS、8~12ng/mLbFGF、優(yōu)選為144~240h,可以為168h。所述增殖培養(yǎng)或分化培養(yǎng)優(yōu)選在含有5%CO?的低溫培養(yǎng)箱[0029]本發(fā)明提供了一種所述方法制備得到的細胞培養(yǎng)肉。[0030]在本發(fā)明中，所述細胞培養(yǎng)肉是大黃魚成肌細胞和/或大黃魚前體脂肪細胞在大米粒支架上，增殖和分化形成肌肉組織和/或脂肪組織的細胞培養(yǎng)肉。所述細胞培養(yǎng)肉中碳水化合物含量低于裸米(未接種細胞的大米),這是因為細胞在生長過程中消耗了米粒中的碳水化合物，且肌組織的細胞培養(yǎng)基比脂肪組織的細胞培養(yǎng)肉的碳水化合物含量更低，這可能是因為肌組織的細胞培養(yǎng)肉代謝率更高，碳水化合物消耗更高。所述肌組織的細胞培養(yǎng)肉中蛋白質(zhì)含量高于脂肪組織的細胞培養(yǎng)肉。此外，本發(fā)明制備的細胞培養(yǎng)肉的風(fēng)味較裸米發(fā)生變化，脂肪組織的細胞培養(yǎng)肉富含與脂肪相關(guān)的化合物，如蠟、黃油和脂肪。肌組織的細胞培養(yǎng)肉富含與牛肉、肉類和杏仁相關(guān)的化合物。[0031]本發(fā)明提供了一種動植物復(fù)合食品，原料包括上述技術(shù)方案所述細胞培養(yǎng)肉。[0032]在本發(fā)明中，所述動植物復(fù)合食品是指以所述細胞培養(yǎng)肉為原料或部分原料經(jīng)過[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種以米粒為支架一步法培養(yǎng)大黃魚細胞為動植物復(fù)合食品的方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。[0034]實施例1大黃魚成肌細胞在不同品種的米粒上的生長情況將不同大米品種(東北大米、長粒香米、圓糯米、蘇北大米和泰國茉莉香米)的米粒在紫外燈下先用75%酒精浸泡2h后再用PBS清洗三次，每次5min,之后將其放置于48孔板中，每個孔洞放置一粒米，然后將含1×10?個大黃魚成肌細胞懸液接種于米粒上，培養(yǎng)4天后用活細胞染料Calcein-AM進行染色，并在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。[0035]結(jié)果如圖1所示，大黃魚成肌細胞在東北大米、長粒香米和泰國茉莉香米上生長良好。[0036]分別使用dsDNA試劑盒(YALEPIC°,YNQ24091)和熒光定量PCR法(用TRIzol提取細7actin(RTF:TCCTCGGTATGGAAT,RTR:GAGTATTTACGCTCA),最后通過熒光檢測分析目標(biāo)產(chǎn)物來測定米粒上大黃魚成肌細胞的DNA總量和相對DNA含量來定量比較這三種米粒上細胞的生長情況。[0037]結(jié)果如圖2所示，與東北大米相比，成肌細胞在泰國茉莉香米上生長的最好，長粒香米效果其次。[0038]實施例2三種米粒的理化性質(zhì)的比較使用X射線和質(zhì)構(gòu)儀測量了東北大米、長粒香和泰國茉莉香米三種米粒的硬度。[0039]X射線結(jié)果如圖3中A和表1所示，長粒香米和泰國茉莉香米的結(jié)晶度沒有顯著差東北大米相對結(jié)晶度(%)A型結(jié)構(gòu)的D值(均值)[0041]質(zhì)構(gòu)檢測結(jié)果如圖3中B所示，泰國茉莉香米的硬度最高，長粒香米次之，東北大米最低。[0042]之后通過使用拉曼光譜來分析3種米粒的直鏈淀粉含量。結(jié)果如圖3中C和D所示。泰國茉莉香米的直鏈淀粉含量最高，長粒香米次之，東北大米最低，此結(jié)果與質(zhì)構(gòu)檢測數(shù)據(jù)一致。[0043]這些結(jié)果表明，米粒的硬度可能是影響細胞生長的關(guān)鍵因素。后續(xù)將通過改變泰國茉莉香米的硬度來證實這一猜想。[0044]實施例3米粒不同浸泡時間對成肌細胞生長的影響將泰國茉莉香米分別在PBS水溶液中浸泡4h、24h、48h和72h,通過不同浸泡時間來改變米粒的硬度并使用質(zhì)構(gòu)儀來測量。的硬度顯著降低了。[0046]之后將1×10?個成肌細胞接種于米粒上，分別培養(yǎng)4h、24h、48h和72h后用活細胞染料進行染色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。胞顯著減少。[0048]同時也測量了上述處理的米粒上的DNA總量，結(jié)果如圖4中B所示，浸泡4h、24h和48h的細胞數(shù)沒有顯著差別，但是浸泡72h的細胞數(shù)顯著降低。同時此結(jié)果說明米粒的硬度是影響細胞生長的關(guān)鍵因素之一。[0049]實施例4大黃魚成肌細胞在米粒上的分化特征將1×10?個成肌細胞和前體脂肪細胞懸液分別接種在泰國茉莉香米上進行培養(yǎng)，首先使用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，分別換為成肌細胞分化培養(yǎng)基和前體脂肪細胞分化培養(yǎng)8基分化7天，之后對分化后的肌細胞進行結(jié)蛋白染色，脂肪細胞進行BODIPY染色。染色后使用激光共聚焦顯微鏡對其進行拍照。[0050]結(jié)果如圖5所示，成肌細胞成功分化為肌細胞，前體脂肪細胞成功分化為脂肪細不同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉的營養(yǎng)和風(fēng)味分別將成肌細胞、前體脂肪細胞和肌肉干細胞聯(lián)合前體脂肪細胞接種到米粒上進營養(yǎng)成分基本術(shù)語2.2.8;蛋白質(zhì)：GB5009.5-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定第一法凱氏定氮法；脂肪：GB5009.6-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定第一法索氏抽提法測定裸米和不同細胞組織米粒的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪含量，評價細胞組織對營養(yǎng)價值的影響。[0052]如圖6中A和表2所示，不同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉的營養(yǎng)物質(zhì)含量低于裸米，這可能是由于細胞在生長過程中消耗了米粒的營養(yǎng)物質(zhì)。但是當(dāng)比較不同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉時，發(fā)現(xiàn)肌組織的細胞培養(yǎng)肉比脂肪組織的細胞培養(yǎng)肉的碳水化合物少9.1g。這可能由于與前體脂肪細胞相比，成肌細胞的代謝率更高，導(dǎo)致碳水化合物消耗更多。肌組織米粒的蛋白質(zhì)含量比脂肪組織米粒高0.3g,這是由于成肌細胞的增殖和分化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量增[0053]表2同細胞組織的細胞培養(yǎng)肉的營養(yǎng)物質(zhì)含量結(jié)果(每100g營養(yǎng)成分)碳水化合物(g)蛋白質(zhì)(g)脂肪(g)[0054]使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了不同細胞組織米粒樣品的氣味特征。色譜-質(zhì)譜分析采用無分裂模式，將柱箱溫度提高4℃/min,在240℃下保持20min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間與質(zhì)譜在色譜庫中搜索的數(shù)據(jù)進行比對，確定GC分析分離的峰組分。根據(jù)[0055]結(jié)果如圖6中B所示