(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN120210391A(71)申請人中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所地址100193北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(72)發(fā)明人何曉紅王明坤羅苗馬月輝趙玉和田(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002專利代理師黃爽(54)發(fā)明名稱與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及遺傳育種領(lǐng)域，尤其涉及一種與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述SNP分子標(biāo)記位為山羊第8號染色體標(biāo)記所在的山羊參考基因組版本號為ARS1。本發(fā)明提供的位于山羊JAK2基因上的SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)與山羊體長、體高和體重3個體型性狀相關(guān)，可以作為檢測山羊體型性狀的分子標(biāo)記。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記不受山羊的年齡、性別等限制，可21.與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述SNP分子標(biāo)記含有如SEQIDNO:1所示序列的第101位的多態(tài)性為G/A的核苷酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，具有所述多態(tài)性的位點(diǎn)的基因型為GG或GA對應(yīng)大體型個體，具有所述多態(tài)性的位點(diǎn)的基因型為AA,對應(yīng)于小體型個體；所述體型性狀選自體重、體高或體長中的一種或多種。3.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述SNP分子標(biāo)記的引物或含有所述引物的檢測試劑或試劑盒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，所述引物包括如SEQIDNO:2所示的上游引物和如SEQIDNO:3所示的下游引物。5.權(quán)利要求1或2所述SNP分子標(biāo)記或權(quán)利要求3或4所述引物或含有所述引物的檢測試劑或試劑盒的以下任一應(yīng)用：(1)用于山羊體型性狀選育；(2)用于具有大體型性狀山羊個體的早期預(yù)測；(3)用于山羊品種的遺傳改良；6.一種檢測山羊體型性狀的方法，其特征在于，所述方法包括：提取待測山羊的基因組進(jìn)一步地，分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括：檢測待測山羊在如權(quán)利要求1或2中所述SNP分子標(biāo)記的基因型；基因型檢測結(jié)果為GG或GA的待測山羊，相較于基因型檢測結(jié)果為AA的待測山7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,55℃或60℃退火30s,72℃延伸1-2min,共30-35個循環(huán)；72℃保溫2min。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與山羊體型性狀相背景技術(shù)[0002]Janus激酶2(Januskinase2,JAK2)是一種蛋白質(zhì)編碼基因。該基因編碼一種非受體酪氨酸激酶，可以與生長激素(GHR)、催乳素(PRLR)、瘦素(LEPR)、促紅細(xì)胞生成素(EPOR)、血小板生成素受體(MPL/TPOR)等多種受體結(jié)合，在細(xì)胞因子和生長因子信號傳導(dǎo)中起核心作用，對肢體發(fā)育障礙、心血管系統(tǒng)以及骨髓增生性疾病的發(fā)生和組織器官發(fā)育至關(guān)重要。目前，已有研究人員利用全基因組重測序數(shù)據(jù)對波爾山羊進(jìn)行選擇信號分析，篩選與肌肉發(fā)育相關(guān)候選基因，結(jié)果顯示，包括JAK2等多個候選基因和信號通路與肌肉發(fā)育相關(guān)。對大體型與小體型山羊品種的分析發(fā)現(xiàn)JAK2基因的多態(tài)性與山羊的體型大小相關(guān)。同時，根據(jù)多組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，JAK2基因在山羊和綿羊的主動脈中高表達(dá)，其次在肌肉中也表達(dá)。[0003]山羊(Caprahircus)是世界上最重要的畜種之一，大約在10500到9900年前被馴化。山羊?yàn)槿祟愄峁┝巳狻⒔q、奶和皮等重要生產(chǎn)資料，在人類生產(chǎn)活動中發(fā)揮著重要的作用。中國有著悠久的山羊馴化歷史和豐富的山羊品種資源。山羊是適應(yīng)性最強(qiáng)和地理分布最廣泛的家畜，在嚴(yán)寒的青藏高原、寒冷干燥的東北、高溫高濕的南方、干燥炎熱的沙漠和喀斯特山區(qū)都有不同品種的山羊分布。為了融入不同的環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)，山羊受到長期的自然選擇和人工選擇，并根據(jù)不同的自然環(huán)境和人類的定向選擇，逐步形成具有不同外貌特征、體型和不同遺傳特性的品種。中國地方山羊品種具有性成熟早、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼和[0004]分子標(biāo)記輔助選擇(MolecularMarker-assistedSelection,MAS)育種的發(fā)展使得DNA分子標(biāo)記技術(shù)在山羊遺傳多樣性研究中發(fā)揮了重要作用。為了更好地開發(fā)和利用優(yōu)良品種的經(jīng)濟(jì)特性，以及保護(hù)和合理利用品種資源，開發(fā)山羊特異的分子標(biāo)記是必要的。這些標(biāo)記可以應(yīng)用于大體型山羊的選育，并為大體型山羊的分子育種提供理論基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明的目的是提供一種與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，所述SNP分子標(biāo)記位于山羊基因組8號染色體第39264302bp處，多態(tài)性為G/A;所述SNP分子標(biāo)記對應(yīng)的山羊參考基因組版本號為ARS1。[0007]進(jìn)一步地，所述SNP分子標(biāo)記含有如SEQIDNO:1所示序列的第101位的多態(tài)性為G/A的核苷酸序列(n=g或a);具有所述多態(tài)性的位點(diǎn)的基因型為GG或GA對應(yīng)大體型個體，具有所述多態(tài)性的位點(diǎn)的基因型為AA,對應(yīng)于小體型個體；所述體型性狀選自體重、體高或體長中的一種或多種。4[0008]第二方面，本發(fā)明提供與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的以下任一應(yīng)用：(1)用于山羊體型性狀選育；(2)用于具有大體型性狀山羊個體的早期預(yù)測；(3)用于山羊品種的遺傳改良；(4)用于JAK2基因分型，所述JAK2基因在NCBI上(參考基因組ARS1版本)的參考序[0009]第三方面，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的引物或含有所述引物的檢測試劑或試劑盒的以下任一應(yīng)用：(1)用于山羊體型性狀選育；(2)用于具有大體型性狀山羊個體的早期預(yù)測；(3)用于大體型性狀山羊品系的鑒定；(4)用于山羊品種的遺傳改良；(5)用于JAK2基因分型，所述JAK2基因(參考基因組ARS1版本)在NCBI上的參考序[0010]優(yōu)選地，所述引物包括如SEQIDNO:2所示的上游引物和如SEQIDNO:3所示的下游引物。[0012]第四方面，本發(fā)明提供一種檢測山羊體型性狀的方法，所述方法包括：提取待測山因型檢測結(jié)果為GG或GA的待測山羊，相較于基因型檢測結(jié)果為AA的待測山羊而言，具備更[0013]優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,55℃或60℃退火30s,72℃延伸1-2min,共30-35個循環(huán)；72℃保溫2min。[0014]借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：本發(fā)明提供了一種與山羊的多種體型性狀密切相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其位于山羊基因組第8號染色體第39264302bp處，通過對該分子標(biāo)記的基因型進(jìn)行檢測可以實(shí)現(xiàn)山羊體型性狀(該標(biāo)記與山羊體長、體高和體重3個體型性狀相關(guān))的鑒定，為大體型山羊的選育提供有效的檢測手段。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可以用于優(yōu)質(zhì)肉羊新品種的培育，為山羊體型性狀的遺傳改良提供了有效的基因工程手段，在山羊養(yǎng)殖業(yè)中具有重要的應(yīng)用價值。[0015]本發(fā)明提供的分子標(biāo)記不受山羊的年齡、性別等限制，可用于選育優(yōu)異體型山羊品種，大大加快了優(yōu)異體型山羊品種的育種進(jìn)程。附圖說明[0016]圖1為本發(fā)明較佳實(shí)施例中大體型組山羊和小體型組山羊的體重、體高和體長表[0017]圖2為本發(fā)明較佳實(shí)施例中山羊體型性狀全基因組SNP效應(yīng)分布曼哈頓圖；其中，A5選出的選擇信號曼哈頓圖，其中框內(nèi)表示本發(fā)明SNP分子標(biāo)記所在基因組位置。[0018]圖3為本發(fā)明較佳實(shí)施例中體型性狀候選基因篩選；其中，A為中大體高組和小體高組間三種選擇信號分析方法中共同篩選出的基因，其中三種方法共同鑒定到98個受選擇基因，B為與體高顯著相關(guān)基因、與體長顯著相關(guān)基因和與體重顯著相關(guān)基因的維恩圖。有1[0019]圖4為本發(fā)明較佳實(shí)施例中SNP位點(diǎn)在小體型組與大體型組間基因型分布。具體實(shí)施方式[0020]本發(fā)明提供一種與山羊體型性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用，所述SNP分子標(biāo)記位于山羊第8號染色體第39264302bp處；所述位點(diǎn)上存在G/A突變，與山羊體型性狀具有顯著的相關(guān)性，該基因存在GG、GA和AA三種基因型，GG或GA基因型的個體體型顯著高于AA基因第一方面，本發(fā)明提供一種分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于山羊基因組8號染色體第39264302bp處，多態(tài)性為G/A;所述SNP分子標(biāo)記所在的山羊參考基因組版本號為ARS1。[0022]進(jìn)一步地，所述分子標(biāo)記位于核酸的第101位，所述核酸具有如SEQIDNO:1所示[0023]進(jìn)一步地，所述分子標(biāo)記為GG或GA基因型的山羊，相較于基因型AA的山羊具備更[0024]第二方面，本發(fā)明提供如下引物對(SEQIDNO:2-3):[0025]第四方面，本發(fā)明提供所述的分子標(biāo)記，或所述的引物組合，或所述的試劑盒在檢測山羊的體型性狀中的應(yīng)用。[0026]本發(fā)明進(jìn)一步提供所述的分子標(biāo)記，或所述的引物組合，或所述的試劑盒在山羊育種中的應(yīng)用。緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。獲得所述待測山羊的基因組DNA,采用所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測所述待測山羊在所述分子標(biāo)記的基因型，根據(jù)基因型檢測結(jié)果判斷所述待測山羊的體型性狀。[0029]根據(jù)基因型檢測結(jié)果判斷所述待測山羊的體型性狀包括：基因型檢測結(jié)果為GG與GA的待測山羊，相較于基因型檢測結(jié)果為AA基具備更優(yōu)的體型性狀，即更大的體重、更高的體高以及更長的體長。[0030]本發(fā)明所述體型性狀包括體重、體高或體長中的一種或多種。[0031]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。[0032]實(shí)施例1基因組遺傳變異的獲得61、以國家種質(zhì)資源庫為基礎(chǔ)，采集大體型組和小體型組山羊品種的耳組織樣品或者血樣(包含16個品種127只),提取總DNA,并對DNA進(jìn)行質(zhì)控，并送測序公司進(jìn)行高深度全基因組重測序(華大基因，T7平臺),平均測序深度為10×左右。收集相應(yīng)山羊品種的體型性能測定等表型數(shù)據(jù)。[0033]2、將測序公司下機(jī)的fastq文件進(jìn)行整理。剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量較差的reads。通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控與過濾后，得到較高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。使用BWA(Version0.7.15)軟件的MEM算法將CleanData比對到最新山羊參考基因組(ARS1)上得到最初的bam文件，使用SAMtools(Version1.9)軟件對bam文件進(jìn)行排序并去除PCR重復(fù)。[0034]3、首先使用GATK(Version4.1.4.0)軟件的HaplotypeCaller模塊對所有個體進(jìn)行變異檢測，并生成gvcf文件，利用GATK軟件的CombineGVCFs功能合并所有個體的gvcf文件，最終利用GenotypeGVCFs進(jìn)行基因分型。僅使用常染色體進(jìn)行后續(xù)分析，采用SelectVariants功能對生成的vcf文件進(jìn)行初始過濾。SNP過濾條件：QD60.0,MQ3.0,過濾(QD<-2.0||ReadPosRankSum<-8.0||FS>60.0||12.5||QUAL<30)。質(zhì)控后，最終有112頭國內(nèi)外山羊品種個體以及16744201個SNPs位點(diǎn)用于后續(xù)全基因組選擇信號分析。[0035]大體型組山羊和小體型組山羊的體重、體高和體長表型統(tǒng)計(jì)圖見圖1。[0036]實(shí)施例2分子標(biāo)記的篩選1、本研究群體為112頭國內(nèi)地方山羊品種個體，樣品來自國家畜禽種質(zhì)資源庫。[0037]2、使用FsT、π-RATIO和Tjimas'D三種方法來篩選基因組受選擇區(qū)域。首先，使用VCFtools(Version0.1.16)軟件，計(jì)算大體高組與小體高組的Fs(窗口長度100kb,步長為件，計(jì)算大體高組與小體高組的π-RATIO(--window-pi10000);最后使用VCFtools的前5%的窗口作為潛在受選擇的區(qū)域。使用R(Version4.3.2)中的ggplot2(Version3.4.4)軟件對分析結(jié)果進(jìn)行可視化(圖2)。三種方法分別注釋出1078、996和1003個基因(圖3中A),其中98個基因?yàn)槿N方法共同識別的基因。[0038]同時對體重性狀和體長性狀使用與體高分析同樣的三種選擇信號分析方法進(jìn)行基因篩選。體重性狀分析中，高組包括5個品種55只個體，分別為：遼羊、內(nèi)蒙古絨山羊(阿爾巴斯型)、徐淮山羊、都安山羊信號分析方法共同識別到106個基因。接著將三個性狀注釋的顯著相關(guān)基因進(jìn)行重疊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同定位到JAK2(圖3中B),其中體高組信號最高。可視化結(jié)果表明，在8號染色體中，39.6MB-39.7MB區(qū)域內(nèi)，該基因區(qū)域在大體高組與小體高組中受到選擇。7[0039]3、使用Plink(Version1.90)軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)的基因型在大體型組與小體型組間的差異顯著性，體型性狀包括體重、體長和體高，通過fisher檢驗(yàn)與卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明該位點(diǎn)在大體型與小體型組間的差異極顯著(P<0.01),表1為本發(fā)明位點(diǎn)不同基因型間體重的顯著性分析。[0040]表1本發(fā)明位點(diǎn)不同基因型間體重的顯著性分析優(yōu)勢比卡方檢驗(yàn)--費(fèi)希爾檢驗(yàn)[0041]實(shí)施例3引物設(shè)計(jì)上游引物：5'-GACTAAAAAAAGAGGCTGGTGG-3'(SEQIDNO:2)下游引物：5'-ATTCTTTCTTGGTAGAGAGCAC-3'(SEQIDNO:3)用于擴(kuò)增出待測SNP所在的核苷酸片段。1)提取待測山羊的基因組DNA;2)以基因組DNA為模板，利用SEQIDNO:2-3所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；和反向引物各1μl,10mmol/LdNTPMixturelμl,1.25U/25