(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(12)發(fā)明專利(22)申請(qǐng)日2025.05.09(43)申請(qǐng)公布日2025.06.06(83)生物保藏信息許博陽(yáng)所(普通合伙)51447A61P31/14(2006.01)A61P1/12(2006.01)(56)對(duì)比文件審查員李夢(mèng)華權(quán)利要求書(shū)1頁(yè)說(shuō)明書(shū)13頁(yè)序列表(電子公布)附圖4頁(yè)原表位與應(yīng)用位與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保體能夠結(jié)合G6、G8、G10型BRVA的VP7蛋白；所述單克隆抗體的抗原表位氨基酸序列為SEQIDNO:1.本發(fā)明的單克隆抗體及抗原表位肽具有廣譜21.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)：CCTCCNO:2.一種單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株制備得到。表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。(1)將權(quán)利要求2所述單克隆抗體與BRVAVP7蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)VP7蛋白與所述單克隆抗體的互作區(qū)域；(2)篩選具有高抗原性的表位序列并進(jìn)行驗(yàn)證。5.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株在制備預(yù)防和/或治療和/或檢測(cè)和/或診斷BRVA病毒感染制品中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備檢測(cè)和/或診斷和/或治療BRVA病毒感染制品中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求3所述抗原表位肽在制備預(yù)防BRVA病毒感染制品中的應(yīng)用。3一種BRVA病毒VP7蛋白的單克隆抗體及其抗原表位與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種BRVA病毒VP7蛋白的單克隆抗體及其抗原表位與應(yīng)用。背景技術(shù)的重要病原體，尤其在新生犢牛中引發(fā)嚴(yán)重疾病，導(dǎo)致顯著的經(jīng)濟(jì)損失。BRVA在我國(guó)牛群中的總體感染率為46%,危害嚴(yán)重。BRVA的基因組為分階段的雙股RNA病毒，易發(fā)變異，存在多種不同基因型毒株流行。迄今為止，在牛輪狀病毒中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)G型(G1~G3、G5、G6、G8、合種類繁多，不同基因型毒株交叉保護(hù)性較差，給疫病防控以及疫苗開(kāi)發(fā)帶來(lái)極大困難。我國(guó)目前尚無(wú)針對(duì)多基因型的廣譜中和抗體或疫苗上市，亟待研發(fā)針對(duì)多種基因型的廣譜疫[0003]BRVA的VP7蛋白是決定病毒G型的主要表面抗原，含有中和抗原表位，是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而，由于不同G型BRVAVP7蛋白的氨基酸序列同源性變化較大(68.0%~73.1%)(李凡，周芳，岳華，等.A群牛輪狀病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017,38(6):4.),且至少存在4個(gè)高度保守(90%以上)的肽段，這增加了鑒定出具有廣譜中和活性抗原表位的難度。發(fā)明內(nèi)容[0004]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明擬提供一種具有廣譜中和活性的單克隆抗體，可有效[0005]本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)：CCTCCNO:[0006]本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，所述單克隆抗體由上述所述的雜交瘤細(xì)胞株制備得到。[0007]在本發(fā)明中，所述單克隆抗體結(jié)合的抗原為BRVA病毒VP7蛋白。[0008]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述BRVA病毒的毒株類型包括G6、G8和G10型。[0009]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體結(jié)合的抗原表位的氨基酸序列包括如SEQIDNO:1所示的序列。[0011]在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述抗體包含如SEQIDNO:2所示輕鏈和如SEQIDNO:3所示的重鏈。CN120098121B4[0016]本發(fā)明提供了一種BRVA病毒VP7蛋白的抗原表位肽，所述BRVA病毒VP7蛋白的抗原表位的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。[0017]本發(fā)明提供了一種鑒定BRVA病毒VP7蛋白抗原表位的方法，包括以下步驟：[0018](1)將上述所述的單克隆抗體與BRVAVP7蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)VP7蛋白與所述單克隆抗體的互作區(qū)域；[0019](2)篩選具有高抗原性的表位序列并進(jìn)行驗(yàn)證。[0020]本發(fā)明提供了上述所述雜交瘤細(xì)胞株或上述所述單克隆抗體或上述所述抗原表位肽在制備預(yù)防和/或治療，和/或檢測(cè)，和/或診斷BRVA病毒感染制品中的應(yīng)用。[0021]本發(fā)明提供了一種預(yù)防和/或治療，和/或檢測(cè)，和/或診斷BRVA病毒感染的制品，包含上述所述的雜交瘤細(xì)胞株或上述所述的單克隆抗體或上述所述的抗原表位肽。[0022]本發(fā)明中，上述制品包括但不限于，BRVA病毒檢測(cè)試劑盒和BRVA疫苗。[0023]術(shù)語(yǔ)“廣譜”用于描述一種能夠針對(duì)多種不同亞型或株系的病原體提供保護(hù)效果的抗原表位、疫苗或治療方法。[0024]在本發(fā)明中，所述廣譜中和活性指對(duì)至少G6、G8、G10型BRVA毒株有效。[0025]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”表示得自基本上同源的抗體的群體的抗體，即，構(gòu)成所述群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了可能的變體抗體(例如，含有天然存在的突變或在單克隆抗體制品的生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生)以外，這樣的變體通常以微量存在。與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品不同，單克隆抗體制品的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。因而，修飾語(yǔ)“單克隆”指示所述抗體得自基本上同源的抗體群體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定方法生產(chǎn)所述抗體。例如，要根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)多種技術(shù)來(lái)制備，所述技術(shù)包括、但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文描述了這樣的方法和其它示例性的制備單克隆抗體的方法。[0026]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雜交瘤細(xì)胞”表示一種在制備單克隆抗體過(guò)程中，用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞融合而成的細(xì)胞，一般通過(guò)瘤細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)制備。[0027]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”是指抗體結(jié)合后，可通過(guò)顏色、化學(xué)反應(yīng)、激發(fā)光、質(zhì)譜等指示抗體位置或量的分子。包括例如：堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、熒光素酶、熒光素、熒光蛋白、同位素等。[0028]在本發(fā)明中，“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)”是指利用抗體分子能與抗原分子特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將游離的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白結(jié)合，并利用特殊的標(biāo)記物對(duì)其定性或定量分析的一種檢測(cè)方法。其原理是：抗原或抗體能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗體能與酶通過(guò)共價(jià)鍵形成酶結(jié)合物，同時(shí)保持各自的免疫5活性或酶活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，能通過(guò)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)確定免疫反應(yīng)的發(fā)生，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比。根據(jù)待檢測(cè)物質(zhì)以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法，雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法。其是將含有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗滌一次；加待測(cè)抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多余抗體洗除；加入與待測(cè)抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使形成“夾心”;加入該酶的底物，若看到有色的酶的抗原。[0029]在本發(fā)明中，“質(zhì)?！笔侵讣?xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的DNA分子，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，具有自主復(fù)制能力，使其在子代細(xì)胞中也能保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。[0030]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“載體”是指通過(guò)其可以將多核苷酸序列(例如外來(lái)基因)引入宿主細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)化宿主并促進(jìn)引入序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)的載體。載體包括質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體等。其中“病毒載體”,是由病毒基因組改造而成的載體，其通過(guò)病毒侵染將外來(lái)基因引入宿主細(xì)胞。[0032](1)廣譜中和活性：針對(duì)牛A群輪狀病毒(BRVA)的防控手段存在局限性，尤其是疫實(shí)了VP7蛋白中廣譜中和抗原表位的存在，突破了傳統(tǒng)疫苗和抗體針對(duì)單一毒株的限制，具有顯著的廣譜保護(hù)效果。[0033](2)精準(zhǔn)鑒定抗原表位：本發(fā)明通過(guò)分子對(duì)接和抗原性分析，成功鑒定出BRVAVP7蛋白的關(guān)鍵抗原表位(SEQIDNO:1),并驗(yàn)證了其在多種毒株中的中和活性。這種精準(zhǔn)的表位鑒定方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中表位篩選效率低、特異性差的問(wèn)題，為疫苗和診斷試劑的研發(fā)提供了明確的靶點(diǎn)。的單克隆抗體和抗原表位肽不僅可用于疫苗開(kāi)發(fā)，還可用于制備高靈敏度的檢測(cè)試劑盒，泛的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明[0035]圖1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VP7雙酶切電泳圖(左邊泳道為DNAmarke;右邊泳道為VP7重組質(zhì)粒);[0036]圖2為重組蛋白表達(dá)分析(M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:IPTG誘導(dǎo)前總蛋白；2:20℃上清；3:20℃沉淀；4:37℃上清；5:37℃沉淀);VP7蛋白);[0039]圖5為13株雜交瘤細(xì)胞株間接免疫熒光鑒定圖(A-M:依次為BRVA單克隆抗體A1-CN120098121B說(shuō)明書(shū)4/13頁(yè)6色代表對(duì)接互作區(qū)域);[0043]圖9為SDS圖(左：多克隆抗體反應(yīng)；右：?jiǎn)慰狗磻?yīng))。民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎生[0049]1實(shí)驗(yàn)方法[0051]參照國(guó)內(nèi)流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1](GenBank登錄號(hào)：細(xì)胞，挑取單克隆菌落，菌落PCR方法鑒定，將陽(yáng)性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限[0053]CATATGGTGAACCTGCCAATCACTGGTAGCATGGACACTGCTTACGCAAACCN120098121B說(shuō)明書(shū)5/13頁(yè)7[0054]表達(dá)的氨基酸序列(SEQIDNO:5):后離心收集上清，將收集到的上清分別進(jìn)行SDS,使用多功能免染蛋白印跡系統(tǒng)拍照分析G6型BRVAVP7重組蛋白的表達(dá)形式。[0062]收集誘導(dǎo)后粗蛋白，加入PBS緩沖液重懸，使用超聲破碎儀使其充分溶解，離心收Ni-NTA,使用25mLBindingbuffer清洗平衡純化柱；然后將粗蛋白加入中，并收集鎳離子純化柱流出液體為上樣流出液；再次平衡鎳離子純化柱；清洗雜蛋白：用25mLWashingbuffer清洗鎳離子純化柱，并收集流出液體為洗雜流出；洗脫目的蛋白：25SDS檢測(cè)后純度高呈單一目的條帶的重組蛋白組份使用復(fù)性液進(jìn)行透析，每隔6劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)測(cè)定BRVAVP7重組蛋白濃度。維素膜，5%脫脂奶粉37℃搖床孵育2h,TBST每次15min洗三遍后，加入一抗(1:1000倍稀釋的兔抗G6P[1]型BRVA陽(yáng)性血清)孵育過(guò)夜，TBST每次15min洗三遍，加入二抗(1:5000稀鑒定BRVAVP7重組蛋白反應(yīng)原性。6/13頁(yè)6/13頁(yè)8[0066]2.1BRVAVP7基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定[0067]如圖1所示，在約826與5000bp出現(xiàn)一暗一亮2個(gè)條帶，片段大小與預(yù)期一致，測(cè)序[0069]重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)SDS檢測(cè)，在約33kDa處有特異性條帶，重組蛋白為包涵體表達(dá)，且重組菌在37℃比20℃表達(dá)量更高(見(jiàn)圖2)。[0070]2.3BRVAVP7重組蛋白的純化與濃度[0071]純化的G6型BRVAVP7重組蛋白經(jīng)SDS顯示呈單一電泳條帶，大小約為33kDa,蛋白純度大于99%(見(jiàn)圖3)。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度為3mg/mL,每升菌液可得到9.509mg純化重組蛋白。[0072]2.4BRVAVP7重組蛋白反應(yīng)原性檢測(cè)清抗體結(jié)合，在約34kDa處可見(jiàn)特異反應(yīng)條帶(見(jiàn)圖4),證實(shí)G6型BRVAVP7重組蛋白具有反應(yīng)原性。[0074]實(shí)施例2:BRVAVP7蛋白廣譜中和單克隆抗體的制備[0077]將BRVAVP7重組抗原皮下免疫BALB/c小鼠后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合后，進(jìn)行雜交瘤的克隆化，再用間接ELISA方法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選，OD450≥0.19則判定為陽(yáng)性。[0078]1.2單克隆抗體的鑒定[0079]用間接免疫熒光方法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行鑒定。待MA-104細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)到90%以上則可進(jìn)行接毒，并設(shè)置陰性對(duì)照孔，加入丙酮進(jìn)行固定，加入BSA封入兔抗BRVAVP6重組蛋白的陽(yáng)性血清作為一抗和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗反應(yīng)后用DAPI染色，最后用倒置顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。[0080]1.3單克隆抗體的中和活性測(cè)定[0081]用微量中和試驗(yàn)，測(cè)定單克隆抗體對(duì)3個(gè)BRVA毒株(G6P[1]型毒株(10-5.561TCID50/0.1mL)、G8P[1]型(10-5.362TCID50/0.1mL)及G10P[11]型毒株(10-4.12TCID50/0.1mL))的中和活性，并計(jì)算出單克隆抗體對(duì)不同毒株0.025mL;將滴定毒力的病毒原液用營(yíng)養(yǎng)液稀釋為200TCID50后，每孔加入0.025mL;充分混后的96孔板內(nèi)加入細(xì)胞懸液，每孔0.025mL,并設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照孔；混合后量37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱觀察；后觀察細(xì)胞的CPE,后用Reed-muech法計(jì)算50%血清中和終點(diǎn)，其中和效價(jià)大于等于1:4,即可證明其具有中和活性。[0083]2.1雜交瘤細(xì)胞株建立[0084]經(jīng)過(guò)ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞系，獲得了13株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。其編9克隆編號(hào)[0087]2.2間接免疫熒光鑒定[0088]結(jié)果如圖5所示，13株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均對(duì)G6P[1]型BRVA毒株具有反應(yīng)原[0089]2.3單克隆抗體的中和活性測(cè)定性，中和活性最低達(dá)到1:150;但是，盡管A3株單克隆抗體對(duì)G6、G8、G10型BRVA毒株均表現(xiàn)出較高的中和效價(jià)，但通過(guò)交叉中和試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，A2株對(duì)不同毒株的中和活性更穩(wěn)定且廣譜性更優(yōu)，因此后續(xù)研究選擇A2株進(jìn)行表位鑒定與應(yīng)用開(kāi)發(fā)。[0091]表2單克隆抗體的中和活性1實(shí)驗(yàn)方法1.1抗體基因的提取、擴(kuò)增以及構(gòu)建單鏈抗體(scFv)分子模型從產(chǎn)生廣譜中和活性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞A2中提取總mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑NO:6和SEQIDNO:7),擴(kuò)增編碼單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)(VL和VH)的基因。引物序列如表3所示。[0097]利用MEGA7軟件翻譯出輕重鏈氨基酸序列，用Gly-GGly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser((GGGGS)?)串聯(lián)構(gòu)建單鏈抗體(single-chainfragmentvariable,scFv),模擬其蛋白分子模型，用于后續(xù)引物名稱引物序列[0100]1.2分子對(duì)接預(yù)測(cè)抗原表位白分子對(duì)接程序進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)VP7蛋白與單克隆抗體的互作區(qū)域，確定可能的的表位序列。對(duì)預(yù)測(cè)表位進(jìn)行抗原性(/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)分析，選取具有較高抗原性的表位進(jìn)行驗(yàn)證。11[0102]2結(jié)果分析[0103]2.1抗體基因的提取、擴(kuò)增以及構(gòu)建單鏈抗體(scFv)分子模型[0104]成功擴(kuò)增出輕鏈V區(qū)基因(VL),由于重鏈V區(qū)(VH)擴(kuò)增困難，遂進(jìn)行宏基因組測(cè)序，得到A2mAb的VL和VH基因?qū)⑵浞g成氨基酸序列(分別為SEQIDNO:2和SEQIDNO:3),VL/VH氨基酸序列QSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQNAKXLPEGVPSRFSASGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQNPFTFGSGTKLEIKRADAAQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYAINWVGWINTYTGEPTHDNDFKGRFAFSSETSASTAYLQTYFCTRGGRGPYFLYWGQGTLVTVSAAKTTPPSQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSEKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISIPPPKEQMAKDKVSLTC[0107]2.2分子對(duì)接預(yù)測(cè)表位[0108]將A2_scFv與BRVAVP7蛋白分子通過(guò)ZDOCK剛性蛋白分子對(duì)接程序進(jìn)行分子對(duì)接(圖7),預(yù)測(cè)表位后，并對(duì)其進(jìn)行抗原性分析，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為2的表位序列具有較高抗原性(表[0109]表5編號(hào)序列長(zhǎng)度1923456[0111]實(shí)施例4:預(yù)測(cè)表位廣譜中和活性的鑒定CN120098121B說(shuō)明書(shū)10/13頁(yè)12[0112]1實(shí)驗(yàn)方法[0114]1.1.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建浴鍋中放置60s,立即轉(zhuǎn)移至冰上靜置2min,向EP管中加入1mLLB液體培養(yǎng)基后將感受箱正置培養(yǎng)30min后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。[0121]挑取LB平板上的單菌落于5mL液體LB,置于37℃臺(tái)式恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速設(shè)置2000Maker25KDa和30KDa之間，其大小符合預(yù)期大小(22KDa),將表達(dá)成功的重組XXX-Fe。蛋白膠經(jīng)ImageJ軟件分析，根據(jù)灰度值確定蛋白誘導(dǎo)的最佳條件為IPTG濃度0.5mM,16℃誘導(dǎo)12h。[0125]對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行兩次破碎，若重組蛋白在第一次破碎后的上清即為可溶形式表達(dá)；若存在于第二次破碎后的上清即為包涵體形式表達(dá)。利用優(yōu)化的重組蛋白表達(dá)條件誘導(dǎo)表達(dá)50mL菌液，8000rpm離心10min后棄掉上清，加入15mLPBS重懸，通過(guò)超聲破碎儀器對(duì)菌體進(jìn)行破碎，程序?yàn)椋汗β?00w,時(shí)間10min,超聲開(kāi)啟5s,停止3s;破碎結(jié)束后，12000rpm離心15min,收集上清蛋白進(jìn)行可溶表達(dá)形式鑒定；將離心后沉淀加入等體積(15mL)Bindingbuffer重懸后于12000rpm離心15min,收集上清蛋白進(jìn)行包涵體表達(dá)形式鑒定。經(jīng)鑒定，16℃0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的XXX-Fe為可溶表達(dá)。[0126]1.1.6XXX-Fe蛋白的純化[0127]按照鎳瓊脂糖親和層析蛋白純化說(shuō)明書(shū)使用方法以5mLHisCap6FF鎳離子純化柱進(jìn)行純化，具體步驟如下：[0129](2)按1.1.4中條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白后，12000rpm離心15min,收集菌泥，按照10:3比例用PBS進(jìn)行重懸，破碎后再次離心收集上清；[0130](3)用10倍柱體積純水清洗HisCap6FF鎳離子純化柱；[0131](4)用5倍柱體積BindingBuffer平衡HisCap6FF鎳離子純化柱；[0132](5)取(3)中離心后上清液通過(guò)0.45μm孔徑濾器過(guò)濾后，上柱；[0133](6)用5倍柱體積BindingBuffer平衡HisCap6FF鎳離子純化柱；[0134](7)用10倍柱體積WashingBuffer清洗HisCap6FF鎳離子純化柱中雜蛋白；[0135](8)用5倍柱體積ElutionBuffer洗脫HisCap6FF鎳離子純化柱中目的蛋白；[0136](9)收集洗脫液中蛋白，利用12%的分離膠進(jìn)行SDS驗(yàn)證其純度。[0137]1.2XXX-Fe蛋白的活性分析[0138]以5%脫脂奶為封閉液，置于37℃,轉(zhuǎn)速為40rpm的臺(tái)式恒溫?fù)u床，水平搖晃孵育2h,用TBST洗滌3次(1次/5min);分別以Anti-BRVAVP7蛋白多克隆抗體和A2mAb為一抗，4℃水平緩慢搖晃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次(1次/5min);以HRP標(biāo)記的GoatAnti-rabbitIgG作為二抗，37℃水平搖晃孵育2h,TBST洗滌3次(1次/5min);使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物顯[0139]1.3重組蛋白的免疫原性評(píng)價(jià)[0140](1)XXX_Fe疫苗的制備[0141]取1.1中已純化的XXX-Fe,與動(dòng)物免疫佐劑MontanideISA206佐劑按照1:1的比例進(jìn)行混勻與乳化，當(dāng)乳化至將重組蛋白與佐劑的混合物不分層，滴加入清水后不迅速擴(kuò)散為乳化完全。[0142](2)動(dòng)物分組及免疫[0143]將制備好的XXX_Fe疫苗分別按照200μg/只的量皮下多點(diǎn)免疫新西蘭大耳白兔作為疫苗組，以免疫M(jìn)ontanideISA206佐劑作為對(duì)照組(每組2只，分別記為A和B)。共對(duì)動(dòng)