題目：產(chǎn)MonacolinK紅曲霉菌株的篩選保種和形態(tài)學(xué)鑒定、ITS序列鑒定 目錄摘要 IV關(guān)鍵詞 IV前言 11.方法和材料 21.1 材料 21.1.1紅曲來(lái)源 21.1.2培養(yǎng)基 21.1.3實(shí)驗(yàn)所用儀器 31.2實(shí)驗(yàn)方法 31.2.1菌種純化分離方法 31.2.2紅曲霉固態(tài)發(fā)酵及發(fā)酵樣品的制備 31.2.3通過(guò)液相色譜法測(cè)定其中的MonacolinK含量 41.2.4菌種培養(yǎng)方法 41.2.5培養(yǎng)特征觀察 51.2.6顯微形態(tài)觀察 52.結(jié)果 52.1紅曲菌的分離 52.2發(fā)酵及檢測(cè)結(jié)果 62.3紅曲菌的形態(tài)鑒定 72.3.1形態(tài)學(xué)結(jié)果 72.3.2顯微觀察。（見(jiàn)表3與圖5） 82.4紅曲菌的分子鑒定 102.4.1瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下: 102.4.2紅曲霉ASP-1菌株的ITS序列測(cè)序。 102.5菌種保藏 123.討論 124.結(jié)論 12參考文獻(xiàn) 13致謝 19誠(chéng)信聲明 20畢業(yè)論文使用授權(quán)聲明 21產(chǎn)MonacolinK紅曲霉菌株的篩選保種和形態(tài)學(xué)鑒定、ITS序列鑒定摘要目的:本研究旨在通過(guò)微生物分離純化技術(shù)從紅曲酒糟中篩選出高產(chǎn)MonacolinK紅曲霉菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和ITS序列鑒定，了解其種屬類(lèi)別。為進(jìn)一步紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MonacolinK工藝優(yōu)化提供優(yōu)良菌株。方法:設(shè)計(jì)曲霉篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)委托方提供的樣品進(jìn)行菌株分離篩選；利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)和液相色譜層析技術(shù)篩選出生產(chǎn)MonacolinK的紅曲霉菌；利用真菌鑒定培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)MonacolinK的霉菌進(jìn)行形態(tài)檢測(cè)和顯微觀察;對(duì)產(chǎn)MonacolinK的菌株進(jìn)行ITS序列測(cè)定，進(jìn)一步確定菌株種屬關(guān)系。結(jié)果:從所提供的紅曲酒糟中分離紅曲菌，最終確認(rèn)得到紅曲霉菌純培養(yǎng)菌株1株，命名為ASP-1。在加入自制營(yíng)養(yǎng)液的白米上25℃培養(yǎng)14天，通過(guò)液相色譜儀檢測(cè)此發(fā)酵品中MonacolinK含量，確定其含量穩(wěn)定在0.3%-0.5%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在三種霉菌標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基（MEA、CYA、G25N）上，培養(yǎng)條件為25℃培養(yǎng)，分別在第4天和第7天觀察其菌落的形態(tài)特征，參照真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行種的鑒定，判斷這1株紅曲菌為紅曲菌屬(Monascus)中的為紅色紅曲菌種（M.ruber），通過(guò)在三種不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)比較，觀察到紅曲菌ASP-1在麥芽瓊脂培養(yǎng)基（MEA）上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于查氏培養(yǎng)基（CYA）和25%甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(G25N）。根據(jù)ITS區(qū)基因序列對(duì)分離得到的紅曲菌ASP-1，依如下步驟進(jìn)行分子鑒定：核酸提取，PCR擴(kuò)增，ITS測(cè)序，序列比對(duì)。序列分析結(jié)果判斷紅曲菌ASP-1與已知紅色紅曲菌親緣關(guān)系較近，將這1菌株紅曲菌ASP-1歸結(jié)到紅色紅曲菌，這與形態(tài)鑒定結(jié)果是一致的。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)通過(guò)霉菌篩選鑒定手段并結(jié)合固態(tài)發(fā)酵技術(shù)優(yōu)選出一株高產(chǎn)MonacolinK的紅紅色紅曲霉菌，成功的完成了產(chǎn)MonacolinK紅曲霉菌的篩選鑒定，為進(jìn)一步固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)大生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)提供了一株菌源。關(guān)鍵詞紅曲霉;MonacolinK；篩選鑒定;固態(tài)發(fā)酵ProductionofMonacolinKMonascusstrainScreeningforconservationandmorphologicalidentification,ITSsequenceidentificationAbstractObject:Thisstudywasdesignedtoscreenhigh-yieldMonacolinKMonascusstrainsformorphologicalidentificationandITSsequenceidentification.ItprovidesexcellentstrainsforfurtherproductionofMonacolinKbyredyeastsolidfermentation.Methods:TheAspergillusscreeningexperimentwasdesignedtoisolateandscreenthesamplesprovidedbytheclient;theMonacolinKproducingMonacolinKwasscreenedbysolid-statefermentationtechnologyandliquidchromatography;thefungusidentificationmediumwasusedtomoldMonacolinK-producingmold.Morphologicaldetectionandmicroscopicobservation;thestrainsproducingMonacolinKweresubjectedtoITSsequencedeterminationtofurtherdeterminethespeciesrelationship.Results:TheMonascusstrainwasisolatedfromtheprovidedredyeastricewine,anditwasfinallyconfirmedthatonestrainofthepureculturestrainofMonascuswasobtainedandnamedasASP-1.Thericewasaddedtotheself-madenutrientsolutionfor24daysat25°C,andthecontentofMonacolinKinthefermentedproductwasdeterminedbyliquidchromatographytodeterminethatthecontentwasstableat0.3%-0.5%,whichcanbeusedinsubsequentexperiments.Themorphologicalcharacteristicsofthecolonieswereobservedonthefourmoldstandardidentificationmedium(MEA,CYA,G25N)underthecultureconditionsof25°Conthe4thand7thday,andthespeciesidentificationwascarriedoutaccordingtothefungalidentificationmanual.ItwasjudgedthatthisstrainofMonascuswasaredrubellaspecies(M.ruber)inMonascus.Bycomparingthecolonymorphologyonthreedifferentmedia,itwasobservedthatMonascussp.Itgrewwellonmaltagarmedium(MEA)anditsgrowthratewassignificantlybetterthanthatofChad'smedium(CYA)and25%glycerolnitrateagarmedium(G25N).AccordingtotheITSregiongenesequence,theisolatedAspergillusnigerASP-1wassubjectedtomolecularidentificationasfollows:nucleicacidextraction,PCRamplification,ITSsequencing,andsequencealignment.TheresultsofsequenceanalysisindicatedthattherelationshipbetweenMonascussp.ASP-1andtheknownredMonascuswasclose.ThestrainofMonascussp.ASP-1wasattributedtoMonascusrubrum,whichwasconsistentwiththemorphologicalidentification.Conclusion:AstrainofMonacolinKwithhighyieldofMonacolinKwasselectedbymoldscreeningandidentificationmethod,andtheselectionandidentificationofMonacolinKMonascuswassuccessfullycompleted,whichprovidedfurtheroptimizationexperimentsforsolid-statefermentationandexpandedproductionexperiments.Astrainofbacteria.KeywordsMonascus;MonacolinK;screeningandidentification;solidstatefermentation前言紅曲是紅曲霉菌(Monascus)的菌絲體在谷物上附著生長(zhǎng)而成的紅曲米。傳統(tǒng)紅曲分為兩大類(lèi)，一種稱(chēng)為色曲，可作為為純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。紅曲色素作為重要要的純天然染色品，因其制造成本低、安全可靠、發(fā)酵周期較短且不受時(shí)節(jié)的影響等優(yōu)勢(shì)，在全國(guó)范圍內(nèi)已成為生產(chǎn)量和使用量最大的天然色素品種。目前紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品中的紅曲色素已被我國(guó)列入食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)（GB2760-2011)，紅曲色素及加工產(chǎn)品在我國(guó)每年的銷(xiāo)售額可達(dá)200億元人民幣[1]。另一種為功能性紅曲，兩種紅曲用途不同，其有效成分不同，功能性紅曲含有洛伐他汀，而色曲幾乎不含有[2]。導(dǎo)致兩種紅曲有效成分顯著不同主要因素有兩種：第一，菌株不同，色曲主要是利用高產(chǎn)紅曲色素的紅曲霉菌株進(jìn)行生產(chǎn)，功能性紅曲主要利用能產(chǎn)生洛伐他汀的紅曲霉菌株進(jìn)行生產(chǎn)；第二，制作工藝不同，色曲是傳統(tǒng)的敞開(kāi)式發(fā)酵，制作過(guò)程清潔度不高，發(fā)酵產(chǎn)物中幾乎不含洛伐他汀，而功能性紅曲采用密閉式發(fā)酵，發(fā)酵每個(gè)步驟要求無(wú)菌，最后的發(fā)酵產(chǎn)物中含有洛伐他汀[3,4]。綜上所述，紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素以及其他次身代謝產(chǎn)物如Monacolin類(lèi)降壓、降脂活性物質(zhì)，在食品藥品行業(yè)展現(xiàn)出了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，致使紅曲菌的研究和開(kāi)發(fā)利用日益受到國(guó)際菌物類(lèi)研究學(xué)者們的高度重視。紅曲在我國(guó)發(fā)酵史上有悠久歷史，它用處繁多，如今常拿來(lái)著色和藥用。近40年來(lái)，伴隨著對(duì)紅曲霉菌的進(jìn)一步深究，科學(xué)家門(mén)發(fā)現(xiàn)在紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中有多種有益的次身代謝產(chǎn)物，如糖化酶、MonacolinK、γ-氨基丁酸等，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物有巨大的應(yīng)用潛力，適用于食品及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[5,6]。自從1979年以后，日本科學(xué)家遠(yuǎn)藤章在紅曲的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)Monacolin類(lèi)化合物它們可顯著抑制體內(nèi)膽固醇的合成，這當(dāng)中以MonacolinK的活性最為明顯。在這之后功能性紅曲的探索研究就成為了熱點(diǎn)。通過(guò)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明了紅曲中的某些物質(zhì)能有效降低體內(nèi)的膽固醇含量以及TG、LDL，同時(shí)升高HDL水平，因此有明顯的降低膽固醇及降血脂功能[7,8,9]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者在紅曲菌相關(guān)研究上，大都側(cè)重于有益的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，有害代謝產(chǎn)物如橘霉素的控制，以及功能紅曲的工業(yè)條件優(yōu)化，而對(duì)紅曲菌的鑒定和分類(lèi)的探索較少，到目前為止紅曲菌屬在真菌類(lèi)中的系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)及紅曲菌屬內(nèi)的分種依舊沒(méi)有固定標(biāo)準(zhǔn)[10,11,12]，這不利于對(duì)紅曲菌種的資源保護(hù)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。紅曲霉菌的親緣鑒定主要利用核糖體DNA（rDNA）,這是根據(jù)核糖體基因(rDNA)的基因序列在進(jìn)化過(guò)程中具有強(qiáng)保守性,可反映物種間的親緣關(guān)系，因此紅曲霉的分子鑒定可以采用ITS(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列測(cè)定，可用于紅曲菌屬內(nèi)種間的鑒別和分類(lèi)[13,14]。選用新的生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以及菌株篩選純化創(chuàng)新來(lái)開(kāi)發(fā)富含MonacolinK的功能性紅曲已經(jīng)成為近年來(lái)紅曲技術(shù)的研究熱點(diǎn)[15,16,17]。因此，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)霉菌篩選技術(shù)對(duì)所得到紅曲酒糟進(jìn)行篩選純化，其次結(jié)合功能性紅曲紅曲固態(tài)發(fā)酵和檢測(cè)技術(shù)對(duì)純化紅曲菌進(jìn)行MonacolinK含量檢測(cè)，了解該紅曲菌產(chǎn)MonacolinK情況，緊接著通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定手段對(duì)所純化的紅曲菌進(jìn)行形態(tài)觀察和親緣鑒定，結(jié)合真菌手冊(cè)對(duì)比評(píng)價(jià)，了解所篩選紅曲菌的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)型，為接下來(lái)的功能性發(fā)酵條件優(yōu)化做準(zhǔn)備。1.方法和材料1.1 材料1.1.1紅曲來(lái)源收集云南地區(qū)的紅曲酒糟1種，以及購(gòu)買(mǎi)自微生物保藏中心的能產(chǎn)生洛伐他汀紅曲霉菌1株，命名為T(mén)TT。1.1.2培養(yǎng)基（1）紅曲霉生長(zhǎng)培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g;葡萄糖20g;瓊脂15g,PH自然。（2）三種紅曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基：培養(yǎng)基配方查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(CYA)K2HPO41.0g；查氏濃縮液10.0mL；酵母抽提粉5.0g；蔗糖30.0g；瓊脂15.0g；無(wú)菌水1000mL。查氏濃縮液配方:NaNO330.0g；KCl5.0g；MgSO4·7H2O5.0g；FeSO4·7H2O0.1g；ZnSO4·7H2O0.1g；CuSO4·5H2O0.05g；無(wú)菌水100mL。麥芽汁瓊脂（MEA）麥芽抽提粉20g、蛋白胨1g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml。甘油硝酸鹽瓊脂(G25N)CYA培養(yǎng)基加25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油（3）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵專(zhuān)用營(yíng)養(yǎng)液：甘油3g、黃豆粉20g、乙醇0.3g、NaNO30.1g、MgSO40.2g、KH2PO40.3g、自來(lái)水72g。普通大米研磨成較小米粒，按每50g米/35ml營(yíng)養(yǎng)液配制培養(yǎng)基。（4）實(shí)驗(yàn)主要試劑：實(shí)驗(yàn)主要試劑生產(chǎn)廠家酵母提取物柯達(dá)公司麥芽抽提粉柯達(dá)公司MonacolinK瓊脂粉無(wú)水葡萄糖三磷酸甘油成都市科隆化學(xué)品有限公司1.1.3實(shí)驗(yàn)所用儀器實(shí)驗(yàn)儀器生產(chǎn)廠家霉菌培養(yǎng)箱ThermoCompany微波爐格蘭仕G70F20CN3L-C2(B0）-20℃低溫冰箱海爾公司倒置光學(xué)顯微鏡OlympusCompany電子天平DenverInstrumentCompany磁力攪拌儀江蘇國(guó)華儀器廠立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠FM-120D制冰機(jī)日本SANYO公司攪拌機(jī)上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠液相色譜儀德國(guó)Leica公司生物安全柜上海精宏公司搖床海門(mén)其林貝爾公司超純水系統(tǒng)MilliporeCompany微量移液器德國(guó)Eppendorf公司電磁爐北京六一儀器廠1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1菌種純化分離方法采用平板劃線分離法。（1）稱(chēng)取10g紅曲酒糟，40℃烘干6小時(shí)，在超凈工作臺(tái)中用研缽研成粉末；（2）無(wú)菌條件下,將粉末各自取2g加于8ml無(wú)菌水中帶玻璃珠的無(wú)菌水三角瓶中,振蕩打散孢子,使之形成孢子懸浮液;將懸浮液以10倍稀釋法至10-7；（3）取10-5,10-6,10-7三個(gè)稀釋度的稀釋液各0.2mL,涂布于PDA平皿;于32℃培養(yǎng)4～6d,待形成單菌落用于形態(tài)觀察接種。1.2.2紅曲霉固態(tài)發(fā)酵及發(fā)酵樣品的制備（1）配制發(fā)酵專(zhuān)用營(yíng)養(yǎng)液：甘油3g、黃豆粉20g、乙醇0.3g、NaNO30.1g、MgSO40.2g、KH2PO40.3g、自來(lái)水72ml，調(diào)pH值至pH=6.0；（2）將購(gòu)買(mǎi)所得的普通大米研磨成較小米粒，按每50g米/35ml營(yíng)養(yǎng)液配制培養(yǎng)基，混勻后121℃/20min高壓滅菌；（3）無(wú)菌條件下，將已滅菌的自來(lái)水和已滅菌的玻璃珠導(dǎo)入三角瓶固體培養(yǎng)皿，將菌絲震蕩洗滌下來(lái)，然后導(dǎo)入滅菌的血清瓶中，一次用5ml移液槍導(dǎo)入15ml孢子懸液到已滅菌的固體中，震蕩混勻；（4）將培養(yǎng)基放置在25℃霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)14天，定時(shí)觀察并震蕩，防止凝固成塊而缺氧。1.2.3通過(guò)液相色譜法測(cè)定其中的MonacolinK含量（1）樣品制備。將紅曲米粉碎，并充分混合均勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取500mg試樣于50ml的容量瓶中，加入30ml的75%乙醇，震蕩搖勻，常溫下超聲破碎45min，加75%乙醇接近初始刻度，再超聲破碎15min，之后冷卻到常溫，共超聲破碎60min。再用75%的乙醇定容到50ml，取樣1ml以3500r/min的旋轉(zhuǎn)速度離心十分鐘，取上清液經(jīng)0.45um微孔濾膜過(guò)濾，濾液待用。（2）標(biāo)準(zhǔn)品制備。（3）液相色譜檢測(cè)。色譜柱：C18柱250mm*4.6mm柱溫：20℃~25℃紫外檢測(cè)器：238nm檢測(cè)波長(zhǎng)流動(dòng)相：甲醇：水：磷酸=385：115：0.14（體積分?jǐn)?shù)）流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備配置濃度為0.1、1、10、30、75、150、300ug/洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流通相洗脫平衡色譜柱，待基線穩(wěn)定后將濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得出洛伐他汀溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)r>0.999時(shí)，表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)操作。（5）色譜分析將處理好的紅曲樣品取5ul進(jìn)行進(jìn)樣，與洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)照進(jìn)行定性，得出的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積對(duì)比進(jìn)行定量。（6）計(jì)算X=(H1*c*50)/(H2*M)X=樣品中洛伐他汀的百分含量H1=樣品中洛伐他汀的峰面積H2=標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積C=標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度50=樣品的體積，為50mlM=樣品的質(zhì)量，單位為g用高效液相色譜分離出閉環(huán)和開(kāi)環(huán)的洛伐他汀，并用紫外檢測(cè)器在238nm下檢測(cè)，利用被測(cè)組分與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，利用被測(cè)組分峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積置比進(jìn)行定量。1.2.4菌種培養(yǎng)方法按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)菌株,用于觀察形態(tài)特征。（1）用接種環(huán)在紅曲試管斜面上取少量菌絲劃線在pda平板培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)。（2）挑取單個(gè)菌落分別于MEA、CYA、G25N平板培養(yǎng)基上劃線，于25°C倒置培養(yǎng)．分別于4、7d后，觀察紅曲霉菌形態(tài)特征。1.2.5培養(yǎng)特征觀察（菌株通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng),觀察并記錄MEA、CYA、G25N平皿菌落培養(yǎng)特征:包括菌落大小、菌落質(zhì)地、菌落顏色和菌落背面狀態(tài)等。1.2.6顯微形態(tài)觀察采用載片培養(yǎng)及其觀察方法。（1）在90mm培養(yǎng)皿底部放一張圓形濾紙，然后放兩個(gè)50ml離心管瓶蓋，兩瓶蓋上放一塊潔凈的載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上培養(yǎng)皿蓋，然后用包布包扎滅菌，烘干后備用；（2）將已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下倒入另一培養(yǎng)皿中，待其凝固后，用無(wú)菌刀片小心切取約1cm×1cm的薄片，移到載玻片上；（3）菌株經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)后,將菌體制做成切片,于倒置顯微鏡下40倍、100倍下放大觀察,記錄菌種的顯微形態(tài)特征:包括菌絲、子囊果、分生孢子等。1.2.7ITS序列鑒定將兩株純化得到的菌株送交TaKaRa公司，提取HOP-1以及ASP-1兩株紅曲霉菌株的基因組DNA，用SeqForward引物進(jìn)行ITS擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序：（1）變性（2）PCR目的片段。（3）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（4）PCR產(chǎn)物純化。（5）測(cè)序1.2.8菌種保存方法采用菌絲速凍法。（1）無(wú)菌條件下，將已滅菌的20%甘油加80%純水混合液和已滅菌的玻璃珠導(dǎo)入三角瓶固體培養(yǎng)皿。（2）將菌絲震蕩洗滌下來(lái)，然后導(dǎo)入滅菌的血清瓶中，一次用1ml移液槍導(dǎo)入細(xì)胞凍存管，放置20℃冰箱進(jìn)行保存。2.結(jié)果2.1紅曲菌的分離從紅曲酒糟中通過(guò)分離、純化和初步鑒定，獲得1株紅曲霉菌株，命名為ASP-1。（見(jiàn)圖1）：圖1、A是ASP-1生長(zhǎng)三天時(shí)正面圖；B是ASP-1生長(zhǎng)七天時(shí)正面圖2.2發(fā)酵及檢測(cè)結(jié)果我們?cè)谙嗤瑢?shí)驗(yàn)條件下對(duì)ASP-1紅曲菌進(jìn)行兩次固態(tài)發(fā)并檢測(cè)兩次發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀出峰情況并計(jì)算洛伐他汀含量。紅曲菌ASP-1在通過(guò)14天25℃固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行高效液相色譜分析檢測(cè)，可觀察到在15-16min時(shí)色譜圖出現(xiàn)開(kāi)環(huán)洛伐他汀波峰，17-18min出現(xiàn)閉環(huán)洛伐他汀波峰。（見(jiàn)圖2）圖2、ASP紅曲霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物液相色譜圖在高效液相條件下進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到篩選所得的紅曲菌ASP-1固態(tài)發(fā)酵制備的紅曲米中，MonacolinK的含量穩(wěn)定在0.3%-0.5%。2.3紅曲菌的形態(tài)鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)結(jié)果紅曲霉菌ASP-1在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5天后，觀察其特征。（見(jiàn)表1與圖3）表1、紅曲霉ASP-1在PDA培養(yǎng)基第6天形態(tài)菌株編號(hào)6天菌落大小正面形態(tài)正面顏色背面形態(tài)背面顏色正面褶皺隆起邊緣裂開(kāi)ttt1~2cm凸起菌身橘黃色菌絲淡黃平坦橘黃色無(wú)有光滑無(wú)圖3、A、B為紅曲菌ASP-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6天后正反面形態(tài)紅曲霉菌ASP-1在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到第6天，從初期為米白色轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色，顏色逐漸變深，菌身呈絨氈狀，背面呈輻射狀，菌落邊緣光滑，氣生菌絲濃密且顏色較淺。紅曲菌ASP-1在三種標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，觀察其各自特征。（見(jiàn)表2與圖4）表2、紅曲菌ASP-1在三種標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng)第6天形態(tài)培養(yǎng)基正面顏色正面菌落形態(tài)背面顏色菌落直徑大小邊緣正面褶皺或裂開(kāi)MEA菌身橘黃色，氣生菌絲淺黃偏白隆起橘黃色10~18mm光滑無(wú)CYA白色隆起中央粉紅色，邊緣白色10~13mm光滑無(wú)G25n白色隆起中央淡黃色，邊緣白色6~10mm光滑無(wú)圖4、紅曲菌ASP-1在三種標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)基上培養(yǎng)第6天形態(tài)（從左到右分別為MEA、CYA、G25N）紅曲霉ASP-1在麥芽瓊脂培養(yǎng)基（MEA）上生長(zhǎng)最快，菌落大小最大菌落狀態(tài)最接近PDA培養(yǎng)基上橘黃色形態(tài)菌，氣生菌絲偏白；在查氏酵母瓊脂培養(yǎng)基（CYA）上生長(zhǎng)狀態(tài)次之，菌落大小處于中等，菌落邊緣培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，菌絲偏米白色，菌身為酒紅色；在G25N培養(yǎng)基紅曲菌ASP-1生長(zhǎng)緩慢，菌落大小最小，菌身與菌絲均為米白色。2.3.2顯微觀察。（見(jiàn)表3與圖5）表3、ASP-1的顯微形態(tài)菌株名稱(chēng)菌絲子囊果子囊孢子分生孢子ASP-1菌絲直徑2~5μｍ，有些無(wú)色透明，有些含色素，無(wú)隔膜。閉囊殼近球形無(wú)孔口，無(wú)色或褐色或紅色，不易觀察到子囊、子囊孢子。直徑16~25μｍ。不易觀察，部分可見(jiàn)為橢圓形或卵形，分生孢子球大都為球形和倒梨形，著生于菌絲頂端或側(cè)面小梗頂端，光滑、無(wú)色或褐色，分生孢子排列多呈單生或短鏈狀，直徑6~9μｍ。圖5、紅曲菌ASP-1的載片培養(yǎng)觀察顯微鏡下觀察ASP-1紅曲菌菌株：可見(jiàn)其菌絲分支甚繁不規(guī)律，有橫隔，多核，無(wú)色透明或含深淺不同黃色、褐色色素，有的含油滴；分生孢子球主要呈球形和倒梨形，大多著生在菌絲頂部或兩側(cè)小梗的頂端，形態(tài)光滑、橘黃色或褐色，大都單生或短鏈狀排列分布；子囊果為閉囊形態(tài)，球形無(wú)孔口，大都呈褐色或橘黃色，不易觀察到內(nèi)部的子囊孢子。2.4紅曲菌的分子鑒定2.4.1瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下:圖6、ASP-1紅曲菌及TTT紅曲菌ITS序列擴(kuò)增電泳圖從瓊脂糖凝膠電泳圖中可看出ASP-1紅曲菌與購(gòu)買(mǎi)所得的TTT紅曲菌擴(kuò)增的大量ITS序列。2.4.2紅曲霉ASP-1菌株的ITS序列測(cè)序。紅曲霉TTT菌株的ITS序列共492個(gè)堿基；紅曲霉ASP-1菌株的ITS序列共523個(gè)堿基。紅曲霉菌株TTT的ITS序列為：CCGTGATTATTGTACCTCCTGTTGCTTCGGCGCGGCCCCCCGGGGCCCGCCGGAGACATCTTCTCGAACGCTGTCTTTGAAAAGGATTGCTGTCTGAGTAAACATACCAAATCGGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACTGCCCCTCAAGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCCGCCGTCCCCTGCGCCTCCGGGCAAGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGTGGCGGCGCCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCAGTAGGTCGGGCCGGGGCCTTTGCCCTCTCCAACCTTTTTTTCCTTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG共計(jì)492個(gè)堿基。紅曲霉菌株ASP-1的ITS序列為：GCGGGTCCCCTTCGTGGGACCCAACCTCCCACCCGTGATTATTGTACCTCCTGTTGCTTCGGCGCGGCCCCCCGGGGCCCGCCGGAGACATCTTCTCGAACGCTGTCTTTGAAAAGGATTGCTGTCTGAGTAAACATACCAAATCGGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACTGCCCCTCAAGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCCGCCGTCCCCTGCGCCTCCGGGCAAGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGTGGCGGCGCCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCAGTAGGTCGGGCCGGGGCCTTTGCCCTCTCCAACCTTTTTTTCCTTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA共523個(gè)堿基。通過(guò)將兩組序列在DNAman軟件上進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果為兩株紅曲菌共同序列共491個(gè)堿基。經(jīng)過(guò)NCBIBlast比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖7），與數(shù)據(jù)庫(kù)中紅色紅曲菌種序列高度重合（同源性100%）。因此，將ASP-1、TTT兩株菌株鑒定為到紅曲霉菌的屬的紅色紅曲霉菌種。圖7、來(lái)自DNAman的ITS序列對(duì)比結(jié)果圖8、來(lái)自NCBIBlast的種屬對(duì)比結(jié)果2.5菌種保藏對(duì)篩選出的紅曲霉菌ASP-1進(jìn)行形態(tài)鑒定和分子鑒定前后階段，對(duì)該菌進(jìn)行了先后3次保種，分為Ⅰ代、Ⅱ代、Ⅲ代，并將第Ⅲ代保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNO.14786。3.討論紅曲菌種是十分珍貴的微生物資源，紅曲霉菌作為功能性紅曲發(fā)酵的靈魂，對(duì)紅發(fā)酵影響甚大，會(huì)導(dǎo)致各種紅曲次級(jí)代謝產(chǎn)物含量變化。為了解紅曲菌的特性以及進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)生MonacolinK，先從紅曲中篩選出紅曲霉菌。在篩選出產(chǎn)MonacolinK的紅曲霉菌后即可進(jìn)行功能紅曲的固態(tài)發(fā)酵[18,19]。值得注意的是，傳統(tǒng)意義上的紅曲發(fā)酵技術(shù)在通風(fēng)情況、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵濕度等實(shí)驗(yàn)條件上無(wú)法進(jìn)行有效控制，所發(fā)酵的紅曲米有效物質(zhì)含量不高，桔霉素等毒性產(chǎn)物污染情況嚴(yán)重[20]。有研究提出，在紅曲霉菌的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK在紅曲菌生產(chǎn)發(fā)酵的后期才會(huì)最大化的進(jìn)行積累[21]。于此同時(shí)培養(yǎng)基中的淀粉原料會(huì)被紅曲霉菌分泌的淀粉酶分解液化，導(dǎo)致培養(yǎng)基中通風(fēng)情況惡化，紅曲霉菌菌絲細(xì)胞壁受到葡萄糖液的侵染，使紅曲菌在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)和阻礙新陳代謝[22,23]。因此利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)及現(xiàn)代分子學(xué)方法，在菌株來(lái)源和發(fā)酵條件等方面進(jìn)行改善是目前功能性紅曲的主要研究方向[24]。另外桔霉素的發(fā)現(xiàn)使功能性紅曲米的安全性遭受質(zhì)疑。桔霉素也是紅曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有很強(qiáng)的腎毒性，會(huì)致癌和誘導(dǎo)基因的突變。由桔霉素造成的影響已經(jīng)變成了目前國(guó)際上功能性紅曲的食品藥品應(yīng)用的瓶頸。本實(shí)驗(yàn)旨在篩選出一株產(chǎn)MonacolinK的紅曲菌，這將解決紅曲發(fā)酵在源頭上由于菌源低產(chǎn)或不產(chǎn)MonacolinK而使發(fā)酵無(wú)法順利進(jìn)行的問(wèn)題。這將為接下來(lái)我們的發(fā)酵條件優(yōu)化打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。到目前為止，我們雖已解決了菌源問(wèn)題，但在紅曲發(fā)酵方面仍還存在許多問(wèn)題[25]，使我們篩選出的產(chǎn)MonacolinK紅曲菌發(fā)酵所得的洛伐他汀含量達(dá)到甚至超過(guò)國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(QB/T2847-2007)洛伐他汀達(dá)到0.4%以上將是接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)。因此，接下來(lái)本課題組實(shí)驗(yàn)的重心將轉(zhuǎn)移至功能性紅曲發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的條件優(yōu)化?？紤]到紅曲米發(fā)酵工藝中廣泛采用的是固態(tài)發(fā)酵。相較于紅曲的液體發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵，有產(chǎn)量大，投資小，技術(shù)成熟的優(yōu)勢(shì)[26]。下一步的研究重點(diǎn)是通過(guò)現(xiàn)代化的科學(xué)技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而有效生產(chǎn)富含活性成分MonacolinK而不含桔霉素的功能性紅曲米。4.結(jié)論本課題首先通過(guò)對(duì)購(gòu)買(mǎi)所得紅曲酒糟中紅曲菌進(jìn)行篩選分離，得到紅曲霉菌株的純培養(yǎng)命名為ASP-1，緊接著采用包括紅曲菌標(biāo)準(zhǔn)鑒定培養(yǎng)法和顯微觀察等傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定方法對(duì)所得到的紅曲菌ASP-1進(jìn)行鑒別，直觀的根據(jù)紅曲菌ASP-1的菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地以及顯微狀態(tài)下的孢子、菌絲、子囊果等特征確定了紅曲菌ASP-1是屬于紅曲菌屬(Monascus)中的紅色紅曲菌種（M.ruber）。然而由于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類(lèi)鑒定方法主觀性影響大、周期長(zhǎng)、受環(huán)境因素影響大等缺點(diǎn)，且分子學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步為物種的進(jìn)化、親緣關(guān)系判別以及系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)的研究提供了有效手段，所以在此基礎(chǔ)上同時(shí)采用對(duì)紅曲菌核糖體基因ITS區(qū)的序列進(jìn)行分析以建立另一種快速有的紅曲鑒定方法的方法，通過(guò)對(duì)紅曲菌ASP-1的進(jìn)行ITS序列檢測(cè)，并與購(gòu)買(mǎi)所得紅色紅曲菌TTT進(jìn)行序列比對(duì)，證明了我們純化所得的紅曲菌ASP-1歸屬于紅色紅曲菌種。我們明確了供試菌株的分類(lèi)及其之間的系統(tǒng)發(fā)育來(lái)源，再通過(guò)了解其生物學(xué)特性，我們之后又設(shè)計(jì)了一套固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)方案，對(duì)所篩出的菌株產(chǎn)MonacolinK水平進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其MonacolinK的含量穩(wěn)定在0.3%-0.5%。最終證實(shí)紅曲菌ASP-1為高產(chǎn)MonacolinK的紅曲菌株。這為接下來(lái)的功能性紅曲的發(fā)酵條件優(yōu)化做好準(zhǔn)備，并為紅曲菌MonacolinK的生產(chǎn)利用提供一定的依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1]孫艷君，胡中澤，高冰.紅曲霉的分離鑒定及紅曲色素的測(cè)定.中國(guó)釀造，2011，1:52-54[2]李鐘慶，郭芳.紅曲菌的形態(tài)與分類(lèi)學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005[3]陳運(yùn)中.紅曲活性成分的結(jié)構(gòu)與功能評(píng)價(jià)[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.[4]黃群，麻成金，余佶．產(chǎn)MonacolinK紅曲霉篩選及響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件[J]．食品科學(xué)，2011，2(21):177-182.[5]紅曲霉菌屬菌種資源描述規(guī)范.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院[6]黃穎穎，楊成龍.分子標(biāo)記技術(shù)在紅曲霉分類(lèi)鑒定中的研究進(jìn)展.福建輕紡,2013,9(9):27-34[7]楊成龍,陳章娥,吳小平,鄧思珊,黃穎穎,陸東和.基因組ITS序列分析鑒定紅曲霉菌株[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)2015，29(2):0252-259[8]郭芳，李鐘慶.四種紅曲菌各自固有的分子生物學(xué)和生物化學(xué)特性[J]微生物學(xué)雜志,2007,27(1):69-71[9]QBT2847-2007功能性紅曲米（粉）[10]魏培蓮,周立平,毛建衛(wèi).高產(chǎn)降膽固醇活性物質(zhì)的紅曲霉菌種選育研究[J].氨基酸和生物資源,2002,24(3):18-22[11]郝常明.紅曲制品中的橘霉素問(wèn)題及應(yīng)對(duì)措施[J].中國(guó)食品添加劑，2002,1:30-33[12]于秀英，張寧.分子標(biāo)記在真菌系統(tǒng)分類(lèi)與鑒定中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,24(4):411-415[13]TsuyoshiMIYAKE,KumikoUCHITOMI,Ming-YongZHANG,IsatoKONO,NobuyukiNOZAKI,HiroyukiSAMMOTO&KenjiINAGAKI.EffectsofthePrincipalNutrientsonLovastatinProductionbyMonascuspilosus,Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,2006,70:5,1154-1159[14]Albert,A.W.,Chen,J.,Hunt,V.,Huff,J.,Hoffman,C.,Rothrock,J.,Lopez,M.,Josua,H.,Harris,E.,Patchett,A.,Monaghan,R.,Currie,S.,Stapley,E.,AlbersSchonberg,G.,Hensens,O.,Hirshfield,J.,Hoogsteen,K.,Liesch,J.,andSpringer,J.,Mevinolin:ahighlypotentcompetitiveinhibitorofhydroxymethylglutaryl-coenzymeAreductaseandacholesterol-loweringagent.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3957-3961(1980)[15]許贛榮,陳蘊(yùn),顧玉梅,等.低產(chǎn)桔霉素紅曲霉菌種篩選[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2000,19(4):358-360[16]許贛榮.紅曲霉菌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2002,(S):7-21[17]羅仁才,等.功能性紅曲中MonacolinK總量的測(cè)定方法[J].衛(wèi)生研究,2003,32(2):157-158[18]朱華,許贛榮,陳蘊(yùn).HPLC法測(cè)定紅曲中酸型與內(nèi)酯型MonacolinK[J].無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(3):46-52[19]虞慧玲,許贛榮,陳蘊(yùn).紅曲桔霉素樣品預(yù)處理的探討[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(6):55-59[20]傅劍云,夏勇,孟佳.紅曲對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠體重及血脂水平的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù),2002,5(1):57~59[18]梁劍光,朱玲,穆陸,徐正軍.氨基酸對(duì)于Monascusruber生物合成MonacolinK影響的研究[J].氨基酸和生物資源,2006(04):25-29[22]童群義.紅曲霉產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2003,24(10):163-167[23]劉昕.一種紅曲菌快速固體培養(yǎng)方法.GN中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利公報(bào),2003.[24]王立新,莫海濤.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的研究[J].中國(guó)抗生素雜志,1999,24(2):96[25]趙樹(shù)欣,陳云,許春英,等.界面上紅曲霉的生長(zhǎng)及MonacolinK的產(chǎn)生[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(5):11-14、[26]陸磊，劉秀河.功能性紅曲米發(fā)酵工藝及控制[J].山東食品發(fā)酵.2013,4(171):16-17對(duì)紅曲的研究探討的綜述摘要：通過(guò)了解目前功能性紅曲研究的發(fā)展進(jìn)程，對(duì)產(chǎn)MonacolinK功能性紅曲篩選、鑒定技術(shù)以及固態(tài)發(fā)酵、MonacolinK檢測(cè)工藝進(jìn)行探論。指出目前現(xiàn)代化的發(fā)酵工藝、高度優(yōu)化的發(fā)酵條件以及菌株來(lái)源篩選改造等技術(shù)來(lái)生產(chǎn)MonacolinK是功能紅曲研究改造趨勢(shì)，同時(shí)指出紅曲霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法以及篩選產(chǎn)MonacolinK紅曲菌株的快速方法和精確方法。關(guān)鍵詞：功能性紅曲；MonacolinK；發(fā)展進(jìn)程；研究趨勢(shì)前言紅曲在我國(guó)發(fā)酵史上有悠久歷史，他用處繁多，如今常拿來(lái)著色和藥用。自從1979年以后，因?yàn)槿毡究茖W(xué)家遠(yuǎn)藤章在紅曲的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)Monacolin類(lèi)化合物它們可顯著抑制體內(nèi)膽固醇的合成，這當(dāng)中中以MonacolinK的活性最為明顯。在這之后功能性紅曲的探索研究就成為了熱點(diǎn)。通過(guò)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明了紅曲中的某些物質(zhì)能有效降低體內(nèi)的膽固醇含量以及TG、LDL，同時(shí)升高HDL水平，因此有明顯的降低膽固醇及降低血脂作用。但是桔霉素的發(fā)現(xiàn)使功能性紅曲米的安全性遭受質(zhì)疑。桔霉素是紅曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有很強(qiáng)的腎毒性，會(huì)致癌和誘導(dǎo)基因的突變。桔霉素造成的挑戰(zhàn)已想在已經(jīng)變成了我國(guó)功能性紅曲的食品應(yīng)用的瓶頸。因此，選用新的生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以及菌株篩選純化創(chuàng)新來(lái)開(kāi)發(fā)富含MonacolinK的功能性紅曲將成為紅曲研究技術(shù)的制高點(diǎn)。固態(tài)發(fā)酵傳統(tǒng)紅曲的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝歷史悠久，這種流傳下來(lái)發(fā)酵技術(shù)主要用于釀酒行業(yè)和染色行業(yè)。傳統(tǒng)的紅曲生產(chǎn)固態(tài)發(fā)酵主要以粳米為發(fā)酵的培養(yǎng)基，通過(guò)將紅曲菌接種最終發(fā)酵成為紅曲米。該發(fā)酵技術(shù)工藝落后，勞動(dòng)強(qiáng)度大，紅曲米產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定，很容易受到微生物的污染。上世紀(jì)80年代后，科學(xué)家和紅曲生產(chǎn)者逐漸將通風(fēng)池法試用于紅曲發(fā)酵生產(chǎn)，之后不論是紅曲米的產(chǎn)量還是質(zhì)量都有很大的提高。在次之后，由于盤(pán)曲機(jī)的在紅曲固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用使得紅曲米迎來(lái)了自動(dòng)化生產(chǎn)，進(jìn)一步使紅曲米的質(zhì)量顯著提升，并且減少了微生物的的污染風(fēng)險(xiǎn)。然而，這種設(shè)備前期投資龐大，往往僅適用于那些大型的紅曲生產(chǎn)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)意義上的紅曲發(fā)酵技術(shù)在通風(fēng)情況、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵濕度等實(shí)驗(yàn)條件上無(wú)法進(jìn)行有效控制，所發(fā)酵的紅曲米有效物質(zhì)含量不高，桔霉素等毒性產(chǎn)物污染情況嚴(yán)重。于是有學(xué)者提出，在紅曲霉菌的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK在紅曲菌生產(chǎn)發(fā)酵的后期才會(huì)最大化的進(jìn)行積累。于此同時(shí)，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的淀粉原料會(huì)被紅曲霉菌分泌的淀粉酶分解液化，導(dǎo)致培養(yǎng)基中通風(fēng)情況惡化，紅曲霉菌菌絲細(xì)胞壁受到葡萄糖液的侵染，使紅曲菌在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)和阻礙新陳代謝。因此，現(xiàn)代發(fā)酵工藝的要點(diǎn)在于控制發(fā)酵過(guò)程中微生物質(zhì)量和濕度，通氣情況，發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基含水量等參數(shù)，進(jìn)而提高次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的含量，降低桔霉素的含量。相關(guān)研究表明，紅曲霉菌的固態(tài)發(fā)酵比液體發(fā)酵具有顯著的優(yōu)勢(shì)。在相同實(shí)驗(yàn)條件下液態(tài)發(fā)酵中次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的含量是固態(tài)發(fā)酵的二十分之一或更低。因此，為了提高紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK含量而降低桔霉素含量，應(yīng)該在熟練掌握固態(tài)發(fā)酵工藝流程的基礎(chǔ)上，優(yōu)化的反應(yīng)體系，以達(dá)到高效低耗的生產(chǎn)。同時(shí)，有研究表明在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基以45%-50%初始含水量為最佳條件。水含量過(guò)高，糖化酶活性將升高，會(huì)提升培養(yǎng)基的糖化率，這會(huì)抑制紅曲米中次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的積累。固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度對(duì)于紅曲霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的產(chǎn)生也是十分關(guān)鍵的。恒溫培養(yǎng)相較于變溫培可提高紅曲色素產(chǎn)量，而變溫培養(yǎng)可積累更多次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK。實(shí)驗(yàn)研究表明，先在32℃培養(yǎng)7天后，改變溫度至25℃，再連續(xù)培養(yǎng)14天，可提高紅曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK含量。作為好氧菌的紅曲霉菌，其菌絲體的生長(zhǎng)和繁殖以及次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的產(chǎn)生均依賴(lài)氧氣。因此，適當(dāng)通氣對(duì)紅曲米次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK和桔霉素積累有直接影響。提高通氣量對(duì)菌絲的形成和次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK的產(chǎn)生有顯著提高，然而還會(huì)促進(jìn)桔霉素的積累。因此，在滿(mǎn)足生產(chǎn)MonacolinK的氧容量需求下，可以通過(guò)降低通氣來(lái)減少桔霉素等毒性產(chǎn)物的積累。紅曲米發(fā)酵工藝中廣泛采用的是固態(tài)發(fā)酵。相較于紅曲的液體發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵，有產(chǎn)量大，投資小，技術(shù)成熟的優(yōu)勢(shì)。未來(lái)的研究重點(diǎn)是通過(guò)現(xiàn)代化的科學(xué)技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而有效生產(chǎn)富含活性成分MonacolinK等生理活性物質(zhì)而不含桔霉素的功能性紅曲米。菌株篩選紅曲霉在微生物系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)上歸屬于散囊菌目的子囊菌曲霉科。主要生長(zhǎng)在樹(shù)木、潮濕土壤。紅曲菌在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）上生長(zhǎng)最為良好，菌落初為白色，老熟后變成橘黃色、紫色。有研究者從大曲中通過(guò)霉菌分離技術(shù)篩選出一株紅曲霉菌，所分離的紅曲菌株有極強(qiáng)的產(chǎn)脂能力。這使篩選產(chǎn)MonacolinK的功能性紅曲霉菌株逐漸才成為紅曲研究熱點(diǎn)。而通過(guò)菌種的物理化學(xué)誘變篩選出特異性菌種是提高紅曲菌MonacolinK分泌的含量并抑制桔霉素產(chǎn)生的一條重要途徑。有學(xué)者對(duì)紅曲菌出發(fā)菌株進(jìn)行物理射線、硝酸二乙酯、溴化鋰等誘變劑的多次誘變反應(yīng)后，獲得4株生產(chǎn)MonacolinK能力較強(qiáng)的菌株，當(dāng)中有一株紅曲菌的MonacolinK產(chǎn)量比出發(fā)菌株提升50倍。對(duì)紅曲菌出發(fā)菌株采用Nd:YAG激光進(jìn)行誘變反應(yīng)，篩選出一株紅曲菌，其淀粉酶酶活力和分泌紅曲色素能力降低，然而MonacolinK產(chǎn)量顯著提高，這為功能性紅曲的菌株優(yōu)化指明了方向[13]。MonacolinK的檢測(cè)MonacolinK的測(cè)定方法目前主要包括紫外分光光度法、薄層層析法、高效液相色譜法(HPLC法)等，而通過(guò)將C18柱作為分離柱，配合紫外法檢測(cè)，并利用乙腈或甲醇加磷酸超和純水水溶液作為流動(dòng)相的HPLC檢測(cè)法是MonacolinK含量測(cè)定的最常用方法。紅曲菌產(chǎn)生中的次級(jí)代謝產(chǎn)物MonacolinK主要存在兩種形式，分別為開(kāi)環(huán)的酸式結(jié)構(gòu)和閉環(huán)的內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)。由于紅曲發(fā)酵品加工過(guò)程中溫度的提升，閉環(huán)的酸式結(jié)構(gòu)的洛伐他汀會(huì)脫水向開(kāi)環(huán)的內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，我們所需的有生理活性的MonacolinK就是開(kāi)環(huán)內(nèi)脂式。由此，生產(chǎn)加工工藝不同，發(fā)酵品中兩種MonacolinK的結(jié)構(gòu)成分含量會(huì)因?yàn)樯a(chǎn)工藝不同而存在差異。關(guān)于產(chǎn)MonacolinK紅曲霉菌的的快速篩查，有些技術(shù)如薄層層析、HPLC及RP-HPLC等檢測(cè)方法雖然精確度高，但檢測(cè)過(guò)程比較煩瑣。有研究者發(fā)現(xiàn)在用薄層析法測(cè)定紅曲霉代謝物中MonacolinK時(shí)，用發(fā)酵濾液粗提濃縮物、最終提取結(jié)晶點(diǎn)樣，結(jié)果幾乎一致。因此篩選產(chǎn)MonacolinK紅曲霉工作中，只要用發(fā)酵濾液的粗提濃縮物進(jìn)行薄層層析定性或定量檢測(cè)即可進(jìn)行快速初篩。當(dāng)前，檢測(cè)紅曲中的MonacolinK含量主要通過(guò)HPLC檢測(cè)法。主要依據(jù)美國(guó)藥典中土曲霉開(kāi)環(huán)內(nèi)脂MonacolinKHPLC檢測(cè)法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，然而，這僅適用于紅曲發(fā)酵品中的開(kāi)環(huán)內(nèi)脂形式的MonacolinK的檢測(cè)。因此，有學(xué)者通過(guò)先利用NaOH將紅曲發(fā)酵品堿化處理，再利用濃鹽酸使PH處于5左右，使閉環(huán)酸式MonacolinK全部轉(zhuǎn)化為開(kāi)環(huán)內(nèi)脂式，最后利用HPLC法測(cè)定了紅曲發(fā)酵品中MonacolinK的含量。目前，國(guó)內(nèi)功能性紅曲市場(chǎng)混亂不堪，許多不良商家采用摻入化學(xué)合成的洛伐它汀的方法造假。當(dāng)前依然沒(méi)有出臺(tái)任何國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)可以用于檢測(cè)紅曲發(fā)酵品中兩種不同結(jié)構(gòu)的的含量。有研究將紅曲發(fā)酵品pH設(shè)置在5-6之間，讓兩種結(jié)構(gòu)形式的洛伐他汀在檢測(cè)中不會(huì)相互轉(zhuǎn)化，然后分別在標(biāo)準(zhǔn)條件用HPLC法測(cè)定了紅曲發(fā)酵品中開(kāi)環(huán)內(nèi)酯式和閉環(huán)酸式MonacolinK的含量，這個(gè)方法對(duì)于鑒別功能性紅曲發(fā)酵品質(zhì)量水平有重要意義。紅曲霉菌的鑒定紅曲霉菌屬菌種是一類(lèi)重要的微生物菌種資源,是微生物多樣性的組成部分，為真菌學(xué)研究、教學(xué)及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供菌種資源。紅曲霉菌屬菌種具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，廣泛應(yīng)用于釀造酒醋、發(fā)酵紅曲食品、色素染料、醫(yī)藥和保健品行業(yè)，但同時(shí)紅曲霉菌在代謝過(guò)程中會(huì)形成有害物質(zhì)，如桔霉素。通過(guò)《紅曲霉菌屬菌種資源描述規(guī)范》要求在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件采用（標(biāo)準(zhǔn)（或通用）培養(yǎng)條件包括標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間）培養(yǎng)菌種,用于形態(tài)觀察。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為：查氏酵母膏瓊脂（CYA）、麥芽瓊脂（MEA）、25%甘油硝酸鹽瓊脂（G25N）；在25℃的培養(yǎng)溫度和4-7天的培養(yǎng)時(shí)間下倒置培養(yǎng)，并依次在4、7天后，觀察描述紅曲霉菌的形態(tài)特征。觀察的紅曲霉菌特征包括:菌落的直徑大小、菌落的菌絲及菌身顏色、菌落的形態(tài)質(zhì)地、滲出液的有無(wú)和菌落背面顏色及質(zhì)地等?？偨Y(jié)目前，在菌株源頭的選育工作上應(yīng)多下功夫,篩出高產(chǎn)Monacolink的紅曲菌種利用誘變和現(xiàn)代分子技術(shù)(細(xì)胞融合和基因編輯)改變紅曲菌編碼Monacolink和橘霉素的基因序列，以提高M(jìn)onacolink含量、減少橘霉素的生成;在發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的上,控制通氣量、含水量、培養(yǎng)基成分來(lái)截?cái)嗪铣砷倜顾氐姆磻?yīng)途徑，減少橘霉素的合成,并提高M(jìn)onacolink含量；在功能性紅曲發(fā)酵品的生理活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)提取上,可以就生理活性產(chǎn)物的提取和含量測(cè)定進(jìn)行更深入的探究。這是國(guó)內(nèi)外功能性紅曲研究的主要方向。在中國(guó)，目前已經(jīng)擁有的老年人超過(guò)1．2億（超過(guò)65歲），這使得動(dòng)脈血管硬化、冠心病、高血壓、腦溢血等的患病人人群十分龐大，乃至難以控制。所以，有減壓，降脂作用的天然紅曲發(fā)酵品在我國(guó)食品醫(yī)藥市場(chǎng)中有極好的前景。因此，優(yōu)良的產(chǎn)Monacolink紅曲菌源的選育培養(yǎng)和高效的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)是目前紅曲技術(shù)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。參考文獻(xiàn)[1]楊成龍,陳章娥,吳小平,鄧思珊,黃穎穎,陸東和.基因組ITS序列分析鑒定紅曲霉菌株[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)2015，29(2):0252-259[2]黃群，麻成金，余佶．產(chǎn)MonacolinK紅曲霉篩選及響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件[J]．食品科學(xué)，2011，2(21):177-182.[3]Xucong,WENGXing,ZHANGWen.MicrobialdiversityoftraditionalfermentationstartersforHongQuglutinousricewineasdeterminedbyPCR-mediatedDGGE[J].FoodControl,2012,28(2):34-37[4]孫艷君，胡中澤，高冰.紅曲霉的分離鑒定及紅曲色素的測(cè)定.中國(guó)釀造，2011，1:52-54[5]紅曲霉菌屬菌種資源描述規(guī)范.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院[6]黃穎穎，楊成龍.分子標(biāo)記技術(shù)在紅曲霉分類(lèi)鑒定中的研究進(jìn)展.福建輕紡,2013,9(9):27-34[7]李鐘慶，郭芳.紅曲菌的形態(tài)與分類(lèi)學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005[8]郭芳，李鐘慶.四種紅曲菌各自固有的分子生物學(xué)和生物化學(xué)特性[J]微生物學(xué)雜志,2007,27(1):69-71[9].HassanH.Medium-chainfattyacidsaffectcitrininproductioninthefilamentousfungusMonascusrubber[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2000,(66):11