雙靶點美金剛衍生物與西達本胺：設(shè)計、合成及活性研究的深度剖析一、引言1.1研究背景在全球范圍內(nèi)，神經(jīng)退行性疾病與癌癥已成為嚴重威脅人類健康的兩大主要疾病類型。神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）等，其發(fā)病率隨著人口老齡化的加劇而不斷攀升。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示，全球約有5000萬人患有癡呆癥，其中阿爾茨海默病患者占比高達60%-70%，預計到2050年，這一數(shù)字將激增至1.52億。這些疾病不僅給患者自身帶來了嚴重的認知和運動功能障礙，使其生活質(zhì)量急劇下降，也給家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟與照護負擔。癌癥同樣是人類健康的巨大挑戰(zhàn)，每年全球新增癌癥病例數(shù)以千萬計，死亡人數(shù)眾多。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，當年全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。不同類型的癌癥，如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等，嚴重威脅著人們的生命安全，給患者及其家庭帶來了身心的雙重折磨。在神經(jīng)退行性疾病的治療領(lǐng)域，美金剛占據(jù)著重要地位。美金剛是一種電壓依賴性、中等程度親和力的非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑。在正常生理狀態(tài)下，NMDA受體參與學習、記憶等重要的神經(jīng)生理過程。然而，在神經(jīng)退行性疾病中，如阿爾茨海默病，大腦中谷氨酸能系統(tǒng)功能失調(diào)，導致谷氨酸過度釋放，使NMDA受體過度激活。過度激活的NMDA受體引發(fā)鈣離子大量內(nèi)流，造成神經(jīng)元的興奮性毒性損傷，這是神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡和認知功能下降的重要病理機制之一。美金剛能夠阻斷NMDA受體，抑制谷氨酸濃度病理性升高導致的神經(jīng)元損傷，從而對神經(jīng)退行性疾病起到一定的治療作用。目前，美金剛已被廣泛用于中重度至重度阿爾茨海默型癡呆的治療，在改善患者認知功能、延緩疾病進展方面發(fā)揮了積極作用。西達本胺則在癌癥治療領(lǐng)域具有關(guān)鍵價值，它是一種苯甲酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi），可靶向針對亞型HDAC1、HDAC2、HDAC3和Ⅱb類的HDAC10。在正常細胞中，組蛋白的乙酰化與去乙?；幱趧討B(tài)平衡，這一平衡對于基因的正常表達調(diào)控至關(guān)重要。而在腫瘤細胞中，這種平衡被打破，組蛋白去乙?；傅漠惓８弑磉_導致組蛋白過度去乙酰化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，使得許多與細胞增殖、分化、凋亡相關(guān)的基因表達受到抑制，進而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。西達本胺通過抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，使組蛋白乙酰化水平升高，恢復相關(guān)基因的正常表達，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。2014年，西達本胺被我國CFDA批準上市，用于治療復發(fā)及難治性外周T細胞淋巴瘤，為淋巴瘤患者帶來了新的治療希望，之后其適應(yīng)癥也在不斷拓展研究中。1.2研究目的與意義盡管美金剛和西達本胺在各自的治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了一定的療效，但現(xiàn)有藥物在治療效果、副作用等方面仍存在諸多不足。對于美金剛，單一靶點的作用模式限制了其對神經(jīng)退行性疾病復雜病理機制的全面干預，導致部分患者的治療效果并不理想，且長期使用可能引發(fā)一定的不良反應(yīng)。在癌癥治療中，西達本胺雖然對特定類型的癌癥有效，但同樣面臨著耐藥性、藥物副作用以及對部分癌癥類型療效欠佳等問題。這些現(xiàn)狀迫切需要研發(fā)出療效更優(yōu)、副作用更小的新型藥物。本研究旨在設(shè)計并合成新型的雙靶點美金剛衍生物，通過引入新的作用靶點，使其不僅能夠作用于NMDA受體，還能針對神經(jīng)退行性疾病中的其他關(guān)鍵病理機制發(fā)揮作用，如調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、抑制tau蛋白過度磷酸化等。通過這種多靶點的協(xié)同作用，期望能夠更全面地干預疾病進程，提高對神經(jīng)退行性疾病的治療效果，為患者提供更有效的治療手段。同時，對西達本胺及其衍生物進行研究，通過結(jié)構(gòu)修飾與優(yōu)化，探索其潛在的新活性和作用機制，以提高西達本胺的抗癌活性、擴大其抗癌譜，克服耐藥性問題，降低毒副作用，從而提升癌癥治療的效果與安全性。對雙靶點美金剛衍生物和西達本胺及其衍生物的研究具有深遠的科學意義與臨床價值。從科學研究角度來看，這有助于深入揭示神經(jīng)退行性疾病和癌癥的發(fā)病機制，為藥物研發(fā)提供更深入的理論基礎(chǔ)，拓展藥物作用靶點的研究領(lǐng)域。在臨床應(yīng)用方面，研發(fā)出的新型藥物若能成功上市，將為神經(jīng)退行性疾病和癌癥患者帶來新的治療選擇，改善患者的生活質(zhì)量，延長患者的生存期，具有巨大的社會效益。此外，這些研究成果還有助于推動我國創(chuàng)新藥物研發(fā)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提升我國在國際醫(yī)藥領(lǐng)域的競爭力，為攻克這兩大嚴重威脅人類健康的疾病難題做出積極貢獻。1.3研究內(nèi)容與創(chuàng)新點本研究內(nèi)容主要涵蓋雙靶點美金剛衍生物和西達本胺及其衍生物兩大板塊。在雙靶點美金剛衍生物的研究中，首先基于美金剛的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)退行性疾病的多病理機制，運用計算機輔助藥物設(shè)計技術(shù)，如分子對接、虛擬篩選等，設(shè)計新型雙靶點美金剛衍生物。在設(shè)計過程中，充分考慮衍生物與NMDA受體以及其他潛在靶點（如炎癥相關(guān)受體、tau蛋白激酶等）的結(jié)合模式與親和力，通過對美金剛母核進行合理的結(jié)構(gòu)修飾，引入特定的官能團或結(jié)構(gòu)片段，以期望獲得具有良好雙靶點活性的分子結(jié)構(gòu)。完成設(shè)計后，開展雙靶點美金剛衍生物的合成工作。根據(jù)設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)，選擇合適的起始原料和合成路線，利用有機合成化學中的經(jīng)典反應(yīng)，如取代反應(yīng)、加成反應(yīng)、縮合反應(yīng)等，進行衍生物的合成。在合成過程中，對反應(yīng)條件進行細致優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)物比例、催化劑種類及用量等，以提高反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性，確保能夠高效、高質(zhì)量地獲得目標衍生物。合成得到衍生物后，對其進行全面的活性評價。采用多種細胞模型，如原代神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞等，通過細胞活力檢測、LDH釋放檢測、免疫熒光染色等實驗方法，評價衍生物對神經(jīng)元的保護作用、對神經(jīng)炎癥的抑制作用以及對tau蛋白磷酸化水平的影響。在動物實驗方面，構(gòu)建阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的動物模型，如APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠、Aβ注射誘導的大鼠模型等，通過行為學測試（如Morris水迷宮實驗、新物體識別實驗等）、組織病理學分析（如HE染色、免疫組化染色等）、生化指標檢測（如炎癥因子含量檢測、氧化應(yīng)激指標檢測等），深入評估衍生物在體內(nèi)的治療效果和作用機制。在西達本胺及其衍生物的研究中，對西達本胺現(xiàn)有的合成工藝進行深入研究與改進。分析現(xiàn)有合成路線中的優(yōu)缺點，針對反應(yīng)步驟繁瑣、原料成本高、副反應(yīng)多等問題，探索新的合成方法和反應(yīng)條件。例如，嘗試采用新的催化劑、優(yōu)化反應(yīng)溶劑體系、改進反應(yīng)順序等，以簡化合成步驟，提高原料利用率，降低生產(chǎn)成本，同時減少合成過程中產(chǎn)生的廢棄物，實現(xiàn)綠色化學合成。對西達本胺進行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計并合成一系列衍生物。依據(jù)藥物化學原理，通過在西達本胺分子的關(guān)鍵位置引入不同的取代基，如烷基、芳基、雜環(huán)基等，改變其電子云分布和空間結(jié)構(gòu)，從而探索結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。運用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等現(xiàn)代分析技術(shù)對合成的衍生物進行結(jié)構(gòu)表征，確保結(jié)構(gòu)的準確性。同樣對西達本胺衍生物開展全面的活性評價。使用多種腫瘤細胞系，如肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MCF-7、結(jié)直腸癌細胞HCT116等，通過MTT法、克隆形成實驗、流式細胞術(shù)等方法，檢測衍生物對腫瘤細胞增殖、凋亡、周期分布的影響。進行動物體內(nèi)抗腫瘤實驗，構(gòu)建腫瘤移植模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，觀察衍生物對腫瘤生長的抑制作用，測定腫瘤體積和重量的變化，并通過免疫組化等方法分析其作用機制，包括對腫瘤組織中相關(guān)信號通路蛋白表達的影響。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在雙靶點設(shè)計思路和對西達本胺的研究兩個方面。在雙靶點美金剛衍生物的設(shè)計中，突破了美金剛單一作用靶點的局限，創(chuàng)新性地將其與神經(jīng)退行性疾病中的其他關(guān)鍵病理靶點相結(jié)合，為開發(fā)更有效的神經(jīng)退行性疾病治療藥物提供了全新的思路和方法。這種雙靶點協(xié)同作用的設(shè)計有望更全面地干預疾病進程，提高治療效果，為該領(lǐng)域的藥物研發(fā)開辟新的方向。在西達本胺的研究中，對其合成工藝進行改進，致力于解決現(xiàn)有工藝中存在的不足，提高合成效率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，增強西達本胺在市場上的競爭力。對西達本胺衍生物的探索，通過系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)修飾和活性評價，深入研究其構(gòu)效關(guān)系，有望發(fā)現(xiàn)具有更高抗癌活性、更廣泛抗癌譜、更低毒副作用的新型衍生物，為癌癥治療藥物的研發(fā)提供新的候選藥物和研究方向，推動癌癥治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、雙靶點美金剛衍生物的設(shè)計與理論基礎(chǔ)2.1美金剛的結(jié)構(gòu)與作用機制美金剛，化學名稱為1-氨基-3,5-二甲基金剛烷胺，是金剛烷胺的衍生物，其分子式為C_{12}H_{21}N，化學結(jié)構(gòu)中包含一個金剛烷的核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由四個互鎖環(huán)己烷環(huán)組成，呈現(xiàn)出穩(wěn)定的三維晶格構(gòu)象，在R3和R3'處被甲基碳取代，在R5處含有胺取代物，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了美金剛特殊的物理和化學性質(zhì)，也為其與生物靶點的相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。美金剛主要作用于N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，是一種電壓依賴性、中等程度親和力的非競爭性拮抗劑。在正常生理狀態(tài)下，NMDA受體對于大腦與脊柱之間神經(jīng)元傳遞電信號起著關(guān)鍵作用，它的正常功能參與了學習、記憶、神經(jīng)元發(fā)育等重要生理過程。其激活需要同時結(jié)合谷氨酸和甘氨酸，并且需要膜去極化以解除鎂離子對離子通道的阻滯，從而允許鈣離子和鈉離子內(nèi)流，鉀離子外流，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和可塑性。然而，在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病的病理狀態(tài)下，大腦中的谷氨酸能系統(tǒng)功能失調(diào)，導致谷氨酸大量釋放。過量的谷氨酸會使NMDA受體過度激活，引起鈣離子大量內(nèi)流。細胞內(nèi)鈣離子濃度的異常升高會激活一系列酶，如鈣蛋白酶、磷脂酶和一氧化氮合酶等，這些酶的激活會引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，包括產(chǎn)生大量的自由基，導致氧化應(yīng)激損傷；破壞細胞骨架，影響細胞的結(jié)構(gòu)和功能；激活細胞凋亡信號通路，最終導致神經(jīng)元的興奮性毒性損傷和死亡，這是阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元丟失和認知功能下降的重要病理機制之一。美金剛能夠與NMDA受體上的苯環(huán)己哌啶（PCP）位點結(jié)合，其結(jié)合具有電壓依賴性。當NMDA受體處于正常生理激活狀態(tài)時，美金剛對其影響較小，不會干擾正常的生理功能。但當谷氨酸濃度病理性升高，NMDA受體過度激活時，美金剛能夠迅速與PCP位點結(jié)合，阻斷離子通道，阻止過多的鈣離子內(nèi)流，從而抑制神經(jīng)元的興奮性毒性損傷，起到神經(jīng)保護作用。這種作用機制使得美金剛能夠在不影響正常神經(jīng)功能的前提下，對神經(jīng)退行性疾病中異常的神經(jīng)活動進行調(diào)節(jié)，為治療神經(jīng)退行性疾病提供了重要的理論依據(jù)。2.2雙靶點設(shè)計思路雙靶點藥物設(shè)計是基于對疾病復雜發(fā)病機制的深入理解而發(fā)展起來的一種新型藥物研發(fā)策略。傳統(tǒng)的單靶點藥物通常只針對疾病發(fā)病機制中的某一個關(guān)鍵靶點進行作用。然而，神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病，其發(fā)病機制是多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的結(jié)果。單一靶點藥物難以全面干預疾病進程，往往存在治療效果有限、易產(chǎn)生耐藥性等問題。雙靶點藥物則通過同時作用于兩個與疾病相關(guān)的靶點，利用兩個靶點之間的協(xié)同作用，更全面地調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的生理病理過程，從而有望提高藥物的療效，減少耐藥性的產(chǎn)生。在神經(jīng)退行性疾病中，除了NMDA受體過度激活引發(fā)的興奮性毒性損傷外，神經(jīng)炎癥也是重要的病理特征之一。神經(jīng)炎癥主要由小膠質(zhì)細胞的異常激活所介導。在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病狀態(tài)下，大腦中的淀粉樣蛋白（Aβ）沉積、tau蛋白異常聚集等病理變化會刺激小膠質(zhì)細胞，使其被過度激活。激活的小膠質(zhì)細胞會釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子會引發(fā)一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導致神經(jīng)元損傷、突觸功能障礙，進一步加重神經(jīng)退行性病變。選擇將神經(jīng)炎癥相關(guān)靶點與美金剛作用的NMDA受體相結(jié)合具有充分的依據(jù)。一方面，美金剛對NMDA受體的阻斷可以減輕興奮性毒性損傷，保護神經(jīng)元免受谷氨酸過度刺激導致的死亡。另一方面，針對神經(jīng)炎癥靶點進行干預，可以抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子對神經(jīng)元的損害，改善神經(jīng)微環(huán)境。這種雙靶點的協(xié)同作用能夠從多個角度對神經(jīng)退行性疾病的病理機制進行調(diào)控。通過抑制神經(jīng)炎癥，可以減輕炎癥對NMDA受體功能的影響，從而增強美金剛對NMDA受體的調(diào)節(jié)作用。反過來，美金剛對NMDA受體的阻斷也可能減少神經(jīng)元損傷后引發(fā)的炎癥反應(yīng)。兩者相互配合，有望更有效地保護神經(jīng)元，延緩神經(jīng)退行性疾病的進展。tau蛋白的異常磷酸化也是神經(jīng)退行性疾病的重要病理改變。在正常生理狀態(tài)下，tau蛋白主要分布于神經(jīng)元的軸突，它能夠與微管蛋白結(jié)合，促進微管的組裝和穩(wěn)定，維持神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中，tau蛋白會發(fā)生過度磷酸化。過度磷酸化的tau蛋白無法正常結(jié)合微管，導致微管解聚，破壞神經(jīng)元的細胞骨架結(jié)構(gòu)。這會影響神經(jīng)元內(nèi)的物質(zhì)運輸，導致神經(jīng)遞質(zhì)合成和釋放異常，進而引發(fā)神經(jīng)元功能障礙和死亡。同時，異常磷酸化的tau蛋白還會聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，進一步加重神經(jīng)病理損傷。將tau蛋白相關(guān)靶點與美金剛的NMDA受體靶點相結(jié)合同樣具有重要意義。美金剛對NMDA受體的調(diào)節(jié)可以改善神經(jīng)元的興奮性，減少因興奮性毒性導致的tau蛋白異常磷酸化的誘導因素。而針對tau蛋白相關(guān)靶點的干預，如抑制tau蛋白激酶的活性，可以直接減少tau蛋白的磷酸化水平，恢復tau蛋白與微管的正常結(jié)合，維持神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能。這種雙靶點作用模式能夠從不同層面抑制神經(jīng)退行性疾病的病理進程。通過抑制tau蛋白異常磷酸化，減少神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，可以降低神經(jīng)元對興奮性毒性的敏感性，從而增強美金剛對神經(jīng)元的保護作用。反之，美金剛減輕興奮性毒性損傷也有助于維持神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，減少tau蛋白的異常磷酸化，兩者協(xié)同作用，為治療神經(jīng)退行性疾病提供更全面的干預策略。2.3分子設(shè)計策略與方法在雙靶點美金剛衍生物的設(shè)計過程中，充分借助計算機輔助藥物設(shè)計（CADD）技術(shù)，該技術(shù)在現(xiàn)代藥物研發(fā)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠顯著提高研發(fā)效率，降低研發(fā)成本。通過計算機模擬，可以在虛擬環(huán)境中對大量化合物進行篩選和分析，快速獲得潛在的藥物分子結(jié)構(gòu)信息，為后續(xù)的實驗研究提供有力的指導。分子對接是CADD技術(shù)中的重要組成部分。其基本原理基于蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用力，包括靜電相互作用、氫鍵、范德華力等。在對雙靶點美金剛衍生物進行分子對接時，首先需要獲取準確的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息。對于NMDA受體，可從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取其高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。若缺乏晶體結(jié)構(gòu)，也可采用同源建模的方法構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。同時，利用化學繪圖軟件構(gòu)建美金剛衍生物的分子結(jié)構(gòu)，并進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，使其能量處于較低狀態(tài)。將構(gòu)建好的美金剛衍生物分子與NMDA受體結(jié)構(gòu)在分子對接軟件中進行對接操作。以常用的AutoDock軟件為例，在對接過程中，軟件會通過模擬退火算法等搜索算法，不斷調(diào)整小分子在蛋白質(zhì)活性口袋中的位置、方向和構(gòu)象，以尋找兩者之間的最佳結(jié)合模式。最終，通過評分函數(shù)對不同的對接復合物進行打分，評估其結(jié)合親和力。評分函數(shù)通常綜合考慮靜電作用能、范德華作用能、氫鍵能等多種能量因素，得分越高表示小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合越緊密，親和力越強。通過分子對接，可以直觀地觀察美金剛衍生物與NMDA受體的相互作用方式，分析哪些結(jié)構(gòu)部位對結(jié)合起到關(guān)鍵作用，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供重要依據(jù)。虛擬篩選是基于計算機模擬從大規(guī)?；衔飵熘袑ふ揖哂袧撛诨钚曰衔锏姆椒āＴ陔p靶點美金剛衍生物的研究中，虛擬篩選能夠快速從大量的化合物中篩選出可能與NMDA受體以及其他目標靶點具有良好結(jié)合活性的美金剛衍生物，大大縮小實驗研究的范圍。首先，構(gòu)建或選擇合適的化合物庫?；衔飵炜梢允巧虡I(yè)數(shù)據(jù)庫，如ZINC數(shù)據(jù)庫，其中包含了大量的有機化合物結(jié)構(gòu)信息；也可以根據(jù)研究需求，自行設(shè)計和構(gòu)建包含各種美金剛衍生物結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫。確定需要研究的蛋白質(zhì)靶標，即NMDA受體以及與神經(jīng)炎癥、tau蛋白相關(guān)的靶點。針對每個靶點，利用分子對接方法將化合物庫中的化合物逐一與靶點進行對接。對接過程中，設(shè)定合理的對接參數(shù)，確保對接結(jié)果的準確性和可靠性。根據(jù)對接評分，篩選出得分較高的化合物，這些化合物被認為具有潛在的活性。為了進一步提高篩選的準確性，可以結(jié)合藥物性質(zhì)和ADME（吸收、分布、代謝和排泄）規(guī)則對篩選出的化合物進行過濾。排除那些具有不良藥物性質(zhì)的化合物，如分子量過大、脂水分配系數(shù)不合理、存在毒性基團等。經(jīng)過虛擬篩選得到的化合物，雖然在虛擬環(huán)境中表現(xiàn)出潛在的活性，但仍需要通過實驗進行驗證。這些化合物將作為后續(xù)合成和活性評價的重要候選物，為雙靶點美金剛衍生物的研發(fā)提供了有價值的研究方向。三、雙靶點美金剛衍生物的合成路線與實驗3.1合成路線的選擇與優(yōu)化在雙靶點美金剛衍生物的合成過程中，對多種可能的合成路線進行了深入研究與對比。首先考慮以美金剛為起始原料，通過不同的反應(yīng)路徑引入針對神經(jīng)炎癥或tau蛋白相關(guān)靶點的結(jié)構(gòu)片段。路線一是利用美金剛的胺基與含有活性基團（如羧基、酰氯等）的化合物進行縮合反應(yīng)，從而引入新的結(jié)構(gòu)片段。該路線的優(yōu)點在于反應(yīng)原理較為簡單，縮合反應(yīng)在有機合成中是經(jīng)典反應(yīng)，條件相對成熟，容易操作。但在實際嘗試中發(fā)現(xiàn)，由于美金剛胺基的活性較高，在反應(yīng)過程中容易發(fā)生副反應(yīng)，如自身聚合等，導致目標產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，且副產(chǎn)物的分離較為困難，影響了產(chǎn)物的純度。路線二是先對美金剛的金剛烷結(jié)構(gòu)進行修飾，例如在特定位置引入鹵原子，然后通過親核取代反應(yīng)，將含有目標靶點作用結(jié)構(gòu)的親核試劑引入，從而構(gòu)建雙靶點衍生物。此路線的優(yōu)勢在于可以較為精準地控制新結(jié)構(gòu)片段的引入位置，有利于得到結(jié)構(gòu)明確的目標產(chǎn)物。然而，金剛烷結(jié)構(gòu)的修飾反應(yīng)條件較為苛刻，需要特定的催化劑和反應(yīng)環(huán)境，反應(yīng)的選擇性難以控制，容易生成多種位置異構(gòu)體，增加了產(chǎn)物分離和純化的難度，同時也降低了整體的反應(yīng)產(chǎn)率。路線三是采用逐步構(gòu)建的策略，從簡單的起始原料出發(fā)，先分別合成含有美金剛關(guān)鍵結(jié)構(gòu)片段和針對另一靶點的結(jié)構(gòu)片段，然后通過合適的連接反應(yīng)將兩者拼接起來。這種路線的好處是可以對每個結(jié)構(gòu)片段進行單獨的優(yōu)化和純化，減少副反應(yīng)的發(fā)生，有利于提高最終產(chǎn)物的純度。但該路線的缺點是反應(yīng)步驟較多，合成周期長，原料消耗大，成本較高，且每一步反應(yīng)的產(chǎn)率損失會累積，導致最終總產(chǎn)率不理想。綜合考慮各路線的優(yōu)缺點，選擇了路線一作為基礎(chǔ)路線，并對其進行優(yōu)化。為了抑制美金剛胺基的副反應(yīng)，對反應(yīng)條件進行了細致調(diào)整。在反應(yīng)溫度方面，通過多次實驗發(fā)現(xiàn)，將反應(yīng)溫度控制在較低的范圍（如0-5℃）時，美金剛胺基的自身聚合等副反應(yīng)明顯減少。這是因為低溫可以降低反應(yīng)活性，使反應(yīng)更傾向于與目標反應(yīng)物進行縮合反應(yīng)。對反應(yīng)物的比例進行了優(yōu)化。通過改變美金剛與含有活性基團化合物的摩爾比，發(fā)現(xiàn)當兩者摩爾比為1:1.2時，目標產(chǎn)物的產(chǎn)率較高。過多的含有活性基團的化合物可能會導致副反應(yīng)的增加，而過少則會使反應(yīng)不完全。在反應(yīng)溶劑的選擇上，嘗試了多種有機溶劑，如二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等。結(jié)果表明，DMF作為溶劑時，反應(yīng)的效果最佳。DMF具有良好的溶解性，能夠使反應(yīng)物充分溶解并均勻混合，同時它對反應(yīng)體系的穩(wěn)定性也有一定的促進作用，有利于提高反應(yīng)的選擇性和產(chǎn)率。為了進一步提高反應(yīng)的效率和產(chǎn)物的純度，還對催化劑進行了篩選。嘗試了不同類型的縮合劑，如二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）等。實驗結(jié)果顯示，使用EDC?HCl作為縮合劑時，反應(yīng)速率明顯加快，產(chǎn)率提高，且副產(chǎn)物較少。這是因為EDC?HCl能夠有效地活化羧基，促進縮合反應(yīng)的進行，同時其反應(yīng)條件溫和，對反應(yīng)物和產(chǎn)物的穩(wěn)定性影響較小。通過對合成路線的選擇和反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功提高了雙靶點美金剛衍生物的合成產(chǎn)率和純度，為后續(xù)的活性評價提供了充足且高質(zhì)量的樣品。3.2實驗材料與儀器在雙靶點美金剛衍生物的合成實驗中，使用了多種化學試劑。美金剛購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，其作為起始原料，是構(gòu)建雙靶點衍生物的核心結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。用于引入新結(jié)構(gòu)片段的化合物，如4-羧基苯硼酸（純度≥97%，Aladdin公司），在與美金剛進行縮合反應(yīng)時，為衍生物提供了與神經(jīng)炎癥靶點相互作用的潛在結(jié)構(gòu)單元。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl，純度≥98%，TCI公司）作為縮合劑，在美金剛與含羧基化合物的縮合反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠有效促進酰胺鍵的形成。N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，國藥集團化學試劑有限公司）作為反應(yīng)溶劑，對反應(yīng)物具有良好的溶解性，能為反應(yīng)提供均相的反應(yīng)環(huán)境。此外，還用到了三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）作為有機堿，在反應(yīng)中起到中和反應(yīng)生成的酸，促進反應(yīng)正向進行的作用。無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）用于干燥有機相，去除反應(yīng)體系中的水分，保證反應(yīng)的順利進行。實驗過程中使用了一系列儀器設(shè)備。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）用于在減壓條件下對反應(yīng)溶液進行濃縮，快速去除溶劑，得到粗產(chǎn)物。該儀器通過旋轉(zhuǎn)燒瓶，增大了溶液的蒸發(fā)面積，提高了蒸發(fā)效率，同時在減壓環(huán)境下，降低了溶劑的沸點，避免了高溫對產(chǎn)物的影響。真空干燥箱（DZF-6020型，上海一恒科學儀器有限公司）用于對產(chǎn)物進行干燥處理，去除殘留的溶劑和水分，保證產(chǎn)物的純度。它能夠在真空環(huán)境下，使水分和溶劑更易揮發(fā)，同時可以精確控制干燥溫度，確保產(chǎn)物在適宜的條件下干燥，避免因溫度過高導致產(chǎn)物分解。核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz，德國布魯克公司）用于對合成的衍生物進行結(jié)構(gòu)表征。通過測定氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR），可以獲得分子中氫原子和碳原子的化學環(huán)境信息，從而確定衍生物的結(jié)構(gòu)是否正確。例如，在1H-NMR譜圖中，不同化學環(huán)境的氫原子會在特定的化學位移處出現(xiàn)吸收峰，通過分析吸收峰的位置、積分面積和耦合常數(shù)等信息，可以推斷出分子中氫原子的連接方式和周圍化學環(huán)境。質(zhì)譜儀（ThermoScientificQ-ExactiveFocus，賽默飛世爾科技公司）用于進一步確認衍生物的分子量和結(jié)構(gòu)。它通過將分子離子化，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對其進行檢測和分析，能夠準確地測定分子的分子量，同時還可以提供分子的碎片信息，有助于深入了解分子的結(jié)構(gòu)和裂解方式。3.3合成實驗步驟與過程以設(shè)計的一種雙靶點美金剛衍生物（以美金剛與4-羧基苯硼酸通過酰胺鍵連接為例）的合成為例，詳細闡述合成實驗步驟與過程。在干燥的250mL圓底燒瓶中，加入1.5g（9.8mmol）美金剛和100mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），攪拌使其完全溶解。將圓底燒瓶置于冰浴中，冷卻至0-5℃。緩慢加入1.8g（9.4mmol）1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）和1.3g（8.2mmol）4-羧基苯硼酸，隨后滴加1.2mL（8.6mmol）三乙胺。滴加過程中，反應(yīng)液逐漸變渾濁，這是由于反應(yīng)體系中開始發(fā)生縮合反應(yīng)，生成了一些不溶性的中間體或副產(chǎn)物。滴加完畢后，保持冰浴條件繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時，以使反應(yīng)物充分混合并初步發(fā)生反應(yīng)。然后將反應(yīng)體系從冰浴中取出，置于室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時。在室溫反應(yīng)過程中，反應(yīng)液的顏色逐漸變?yōu)榈S色，渾濁度略有增加，這表明反應(yīng)在持續(xù)進行，生成了更多的目標產(chǎn)物以及可能的副產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入500mL冰水中，有大量淡黃色固體析出。這是因為目標產(chǎn)物在水中的溶解度較低，當反應(yīng)液倒入冰水中時，由于溶劑環(huán)境的改變，目標產(chǎn)物以及一些雜質(zhì)共同析出。使用布氏漏斗進行抽濾，收集析出的固體。抽濾過程中，固體被截留在濾紙上，而濾液則通過漏斗流入抽濾瓶中。用去離子水多次洗滌濾餅，每次洗滌用水量約為50mL，以去除固體表面吸附的雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料。洗滌至濾液呈中性為止，這可以通過pH試紙進行檢測。將洗滌后的固體轉(zhuǎn)移至250mL圓底燒瓶中，加入150mL二氯甲烷使其溶解。加入適量無水硫酸鎂干燥有機相，干燥時間約為1小時。無水硫酸鎂具有較強的吸水性，能夠吸收有機相中殘留的水分，使有機相達到干燥狀態(tài)。1小時后，通過過濾去除無水硫酸鎂，得到澄清的二氯甲烷溶液。將二氯甲烷溶液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄形瓶中，在40-50℃、減壓條件下進行濃縮。隨著旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的運行，二氯甲烷逐漸被蒸發(fā)除去，瓶內(nèi)溶液體積逐漸減少，最終得到淡黃色粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進行純化。選擇200-300目硅膠作為固定相，以二氯甲烷/甲醇（體積比為10:1）為洗脫劑。將粗產(chǎn)物用少量二氯甲烷溶解后，小心地加入到硅膠柱的頂部。開啟洗脫劑的流速，控制在每秒1-2滴。隨著洗脫劑的流下，不同的化合物在硅膠柱上由于與硅膠的吸附作用不同而逐漸分離。收集含有目標產(chǎn)物的洗脫液，通過TLC（薄層色譜）檢測確定目標產(chǎn)物的洗脫位置。TLC檢測時，使用二氯甲烷/甲醇（體積比為10:1）作為展開劑，在紫外燈下觀察斑點的位置。當目標產(chǎn)物的斑點與標準品的斑點在相同的Rf值（比移值）處出現(xiàn)時，表明收集到的洗脫液中含有目標產(chǎn)物。將含有目標產(chǎn)物的洗脫液合并，再次使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40-50℃、減壓條件下濃縮，除去洗脫劑。得到的產(chǎn)物置于真空干燥箱中，在50℃下干燥12小時，以徹底去除殘留的溶劑。最終得到白色固體狀的雙靶點美金剛衍生物，稱重，計算產(chǎn)率。通過核磁共振波譜儀（NMR）和質(zhì)譜儀（MS）對產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)表征，NMR分析結(jié)果顯示，在特定的化學位移處出現(xiàn)了與目標結(jié)構(gòu)中氫原子和碳原子相對應(yīng)的信號峰，如美金剛結(jié)構(gòu)部分的氫原子信號、苯硼酸結(jié)構(gòu)部分的氫原子信號以及酰胺鍵連接部分的相關(guān)信號等，與預期的結(jié)構(gòu)相符。MS分析結(jié)果表明，測得的分子量與目標化合物的理論分子量一致，進一步證實了合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)正確性。3.4產(chǎn)物的分離與純化在合成雙靶點美金剛衍生物后，為了獲得高純度的產(chǎn)物以進行后續(xù)的活性評價和結(jié)構(gòu)表征，采用了柱色譜和重結(jié)晶相結(jié)合的方法進行分離與純化。柱色譜是一種基于混合物中各組分在固定相和流動相之間分配系數(shù)差異而實現(xiàn)分離的技術(shù)。在本研究中，選用硅膠柱色譜法對反應(yīng)粗產(chǎn)物進行初步分離。硅膠作為常用的固定相，具有較大的比表面積和良好的吸附性能。其表面存在著硅醇基等活性基團，能夠與化合物分子通過氫鍵、范德華力等相互作用。不同結(jié)構(gòu)的化合物與硅膠的相互作用強弱不同，從而在柱色譜分離過程中實現(xiàn)分離。在裝柱過程中，將適量的200-300目硅膠與洗脫劑（二氯甲烷/甲醇，體積比為10:1）混合制成勻漿，然后緩慢倒入玻璃柱中，輕輕敲擊柱體，使硅膠均勻沉降，形成緊密且均勻的固定相床層。裝柱的質(zhì)量直接影響分離效果，若硅膠裝填不均勻，可能導致樣品在柱內(nèi)的流動路徑不一致，出現(xiàn)拖尾、交叉等現(xiàn)象，影響分離純度和效率。將反應(yīng)得到的粗產(chǎn)物用少量二氯甲烷溶解后，小心地通過滴管加至硅膠柱的頂部。確保樣品均勻地分布在硅膠柱的表面，避免樣品局部濃度過高或分布不均，否則會影響分離效果。開啟洗脫劑的流速，控制在每秒1-2滴。洗脫劑在重力作用下流經(jīng)硅膠柱，與硅膠表面的化合物發(fā)生相互作用。由于不同化合物與硅膠的吸附力不同，在洗脫劑的沖洗下，與硅膠吸附力較弱的化合物會先隨洗脫劑流出柱子，而吸附力較強的化合物則會在柱子中停留較長時間，從而實現(xiàn)不同化合物的分離。在洗脫過程中，通過薄層色譜（TLC）對洗脫液進行實時監(jiān)測。TLC是一種快速、簡便的分析方法，它利用化合物在固定相（如硅膠板）和流動相（與柱色譜洗脫劑相同）之間的分配差異，使不同化合物在硅膠板上展開形成不同的斑點。將TLC板浸入展開劑（二氯甲烷/甲醇，體積比為10:1）中，待展開劑前沿上升至距離板頂約1-2cm時，取出TLC板，晾干后在紫外燈下觀察。根據(jù)目標產(chǎn)物和雜質(zhì)在TLC板上的Rf值（比移值）差異，確定含有目標產(chǎn)物的洗脫液收集區(qū)間。Rf值是化合物在TLC板上移動距離與展開劑移動距離的比值，不同化合物具有特定的Rf值，可作為判斷化合物種類的依據(jù)之一。重結(jié)晶是利用固體物質(zhì)在不同溫度下在溶劑中的溶解度差異，通過溶解、結(jié)晶等操作來提純固體化合物的方法。將柱色譜初步分離得到的含有目標產(chǎn)物的洗脫液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40-50℃、減壓條件下濃縮，除去大部分洗脫劑，得到濃縮液。向濃縮液中加入適量的無水乙醚，無水乙醚能夠降低目標產(chǎn)物在溶液中的溶解度，促使其結(jié)晶析出。邊加入無水乙醚邊攪拌，此時可以觀察到溶液中逐漸有白色晶體析出。將含有晶體的溶液置于冰箱冷藏室（4-8℃）中靜置過夜，以促進晶體的充分生長和進一步析出。經(jīng)過一夜的靜置后，使用布氏漏斗進行抽濾，將晶體從溶液中分離出來。用少量冷的無水乙醚洗滌晶體，以去除晶體表面吸附的雜質(zhì)和殘留的溶劑。將洗滌后的晶體轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于真空干燥箱中，在50℃下干燥12小時，以徹底去除晶體中的水分和殘留溶劑。通過重結(jié)晶操作，可以進一步提高產(chǎn)物的純度，去除柱色譜難以完全分離的微量雜質(zhì)，得到高純度的雙靶點美金剛衍生物。在整個分離與純化過程中，需要注意一些關(guān)鍵事項。在使用柱色譜時，洗脫劑的選擇至關(guān)重要。洗脫劑的極性要適中，極性過小可能導致目標產(chǎn)物難以洗脫下來，極性過大則可能使目標產(chǎn)物與雜質(zhì)同時快速流出，無法實現(xiàn)有效分離。在本研究中，通過多次實驗確定了二氯甲烷/甲醇（體積比為10:1）的洗脫劑比例，能夠較好地實現(xiàn)目標產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離。在重結(jié)晶過程中，溶劑的選擇和加入量要恰當。溶劑的溶解度參數(shù)應(yīng)與目標產(chǎn)物匹配，既能在高溫下充分溶解目標產(chǎn)物，又能在低溫下使目標產(chǎn)物大量結(jié)晶析出。溶劑加入量過多會導致結(jié)晶困難，產(chǎn)率降低；加入量過少則可能使雜質(zhì)無法充分溶解而混入晶體中，影響產(chǎn)物純度。操作過程中要保持環(huán)境的清潔和干燥，避免雜質(zhì)的引入，影響產(chǎn)物的質(zhì)量和純度。四、雙靶點美金剛衍生物的結(jié)構(gòu)表征與分析4.1紅外光譜（IR）分析紅外光譜（IR）分析是基于分子振動和轉(zhuǎn)動能級躍遷原理，用于研究分子結(jié)構(gòu)的重要分析方法。當紅外光照射分子時，若紅外光的頻率與分子中某基團的振動頻率相等，分子就會吸收該頻率的紅外光，產(chǎn)生振動能級躍遷，從而在紅外光譜圖上形成吸收峰。分子中的各種化學鍵，如C-H、C=O、C-N等，都有其特定的振動頻率范圍，因此通過分析紅外光譜圖中吸收峰的位置、強度和形狀，能夠推斷分子中存在的官能團以及分子的結(jié)構(gòu)特征。圖1展示了合成的雙靶點美金剛衍生物的紅外光譜圖。在3300-3500cm^{-1}區(qū)域出現(xiàn)了一個寬而強的吸收峰，這是典型的N-H伸縮振動吸收峰。美金剛結(jié)構(gòu)中含有胺基（-NH?），在形成雙靶點衍生物時，胺基參與反應(yīng)形成了新的含氮官能團，如酰胺鍵（-CONH-）等，因此該吸收峰表明衍生物中存在含氮氫的化學鍵。在1650-1680cm^{-1}處出現(xiàn)了一個較強的吸收峰，此為C=O的伸縮振動吸收峰。結(jié)合雙靶點美金剛衍生物的設(shè)計結(jié)構(gòu)，該C=O吸收峰可能來自于與美金剛連接的針對神經(jīng)炎癥靶點或tau蛋白靶點的結(jié)構(gòu)片段中所含有的羰基，如酰胺羰基、酯羰基等。若連接的是含有羧基的化合物與美金剛胺基縮合形成酰胺鍵，則此處的C=O吸收峰對應(yīng)酰胺羰基；若引入的結(jié)構(gòu)片段中含有酯基，則可能是酯羰基的吸收峰。在2900-3000cm^{-1}范圍內(nèi)出現(xiàn)了多個吸收峰，這些是C-H的伸縮振動吸收峰。美金剛的金剛烷結(jié)構(gòu)中含有多個C-H鍵，以及引入的其他結(jié)構(gòu)片段中的烷基、芳基等也含有C-H鍵。其中，2960cm^{-1}和2870cm^{-1}附近的吸收峰可歸屬為甲基（-CH?）的C-H伸縮振動，2930cm^{-1}和2850cm^{-1}附近的吸收峰對應(yīng)亞甲基（-CH?-）的C-H伸縮振動。通過這些吸收峰的存在和相對強度，可以推斷分子中甲基和亞甲基的存在及其相對數(shù)量。在1450-1470cm^{-1}處的吸收峰是C-H的彎曲振動吸收峰，進一步證明了分子中存在烷基結(jié)構(gòu)。1380cm^{-1}處的吸收峰為甲基的對稱彎曲振動吸收峰，若該峰發(fā)生分裂，可能表示存在偕二甲基結(jié)構(gòu)。在1200-1300cm^{-1}區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰可能與C-N鍵的伸縮振動有關(guān)。由于美金剛本身含有胺基，在形成衍生物過程中，胺基參與反應(yīng)形成了新的C-N鍵，如酰胺鍵中的C-N鍵，因此該區(qū)域的吸收峰可用于佐證分子中存在含C-N鍵的結(jié)構(gòu)。通過對雙靶點美金剛衍生物紅外光譜圖中各特征吸收峰的歸屬和分析，與預期的分子結(jié)構(gòu)相匹配，進一步驗證了合成的衍生物具有目標結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的活性評價和作用機制研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。4.2核磁共振譜（NMR）分析核磁共振（NMR）分析是確定化合物結(jié)構(gòu)的重要手段，其基本原理基于原子核的自旋特性。在強磁場作用下，具有自旋屬性的原子核會產(chǎn)生能級分裂。當施加特定頻率的射頻脈沖時，原子核能夠吸收能量，從低能級躍遷到高能級，產(chǎn)生核磁共振信號。不同化學環(huán)境中的原子核，由于其周圍電子云密度以及與相鄰原子核的相互作用不同，會在不同的頻率下發(fā)生共振，即具有不同的化學位移。通過分析核磁共振譜圖中信號的化學位移、積分面積和耦合常數(shù)等信息，可以推斷分子中原子的類型、數(shù)目以及它們之間的連接方式，從而確定化合物的結(jié)構(gòu)。圖2展示了雙靶點美金剛衍生物的1H-NMR譜圖。在δ1.2-1.5ppm處出現(xiàn)了多個峰，這些峰可歸屬為美金剛金剛烷結(jié)構(gòu)上的甲基和亞甲基氫的信號。美金剛的金剛烷結(jié)構(gòu)中含有多個甲基和亞甲基，它們處于不同的化學環(huán)境，因此在該區(qū)域出現(xiàn)多個信號峰。根據(jù)積分面積和化學位移的特點，可以進一步區(qū)分不同位置的甲基和亞甲基氫。例如，δ1.25ppm處的單峰可能對應(yīng)于金剛烷結(jié)構(gòu)中某個特定位置的甲基氫，而δ1.4ppm附近的多重峰可能是由相鄰的亞甲基氫之間的耦合作用導致。在δ3.0-3.5ppm處的信號峰對應(yīng)于與胺基相連的碳原子上的氫。在美金剛結(jié)構(gòu)中，胺基與金剛烷相連，該胺基連接的碳原子上的氫由于受到胺基的電子效應(yīng)影響，其化學位移出現(xiàn)在這個區(qū)域。通過積分面積可以確定該氫的數(shù)目，與理論結(jié)構(gòu)中的氫原子數(shù)進行對比，進一步驗證結(jié)構(gòu)的正確性。在δ7.0-8.0ppm處出現(xiàn)的信號峰歸屬于引入的針對神經(jīng)炎癥靶點或tau蛋白靶點結(jié)構(gòu)片段中的芳環(huán)氫。如果引入的是含有苯環(huán)的結(jié)構(gòu)片段，苯環(huán)上的氫會在這個化學位移區(qū)域出現(xiàn)信號。根據(jù)峰的裂分情況和耦合常數(shù)，可以推斷苯環(huán)上氫的取代模式。例如，若出現(xiàn)一組耦合常數(shù)約為7-8Hz的雙峰，可能表示苯環(huán)上存在鄰位取代；若出現(xiàn)耦合常數(shù)約為2-3Hz的雙峰，則可能是間位取代。通過這些信息可以確定引入結(jié)構(gòu)片段的具體連接方式和取代位置。圖3呈現(xiàn)的是雙靶點美金剛衍生物的13C-NMR譜圖。在δ20-40ppm區(qū)域的信號對應(yīng)于美金剛金剛烷結(jié)構(gòu)中的碳原子。金剛烷結(jié)構(gòu)中的不同碳原子由于所處化學環(huán)境不同，會在該區(qū)域呈現(xiàn)出不同的化學位移。通過與美金剛的13C-NMR標準譜圖對比，以及對化學位移規(guī)律的分析，可以確定每個信號所對應(yīng)的碳原子位置。例如，與甲基相連的碳原子化學位移相對較小，可能出現(xiàn)在δ20-30ppm范圍內(nèi)；而與亞甲基相連的碳原子化學位移可能稍大，在δ30-40ppm之間。在δ120-160ppm處的信號歸屬于引入結(jié)構(gòu)片段中的芳環(huán)碳原子。芳環(huán)碳原子的化學位移通常在這個區(qū)域，這是由于芳環(huán)的共軛體系對碳原子的電子云密度產(chǎn)生了影響。通過分析信號的數(shù)目和化學位移的具體值，可以判斷芳環(huán)的類型和取代情況。若出現(xiàn)四個信號，可能表示是苯環(huán)且為對稱取代；若信號數(shù)目較多且化學位移差異較大，則可能存在不同的取代基或取代位置不同。在δ160-180ppm處的信號可能來自于與美金剛連接形成的酰胺鍵或其他羰基碳原子。如果是通過酰胺鍵連接新的結(jié)構(gòu)片段，酰胺羰基碳原子的化學位移會出現(xiàn)在這個區(qū)域。通過與相關(guān)文獻中酰胺羰基化學位移的數(shù)據(jù)進行對比，以及結(jié)合1H-NMR譜圖中相關(guān)氫的信號信息，可以進一步確認該羰基的存在和其在分子結(jié)構(gòu)中的位置。通過對雙靶點美金剛衍生物的1H-NMR和13C-NMR譜圖的詳細解析，各個信號峰的歸屬與預期的分子結(jié)構(gòu)相匹配，從而充分證實了合成的雙靶點美金剛衍生物具有目標結(jié)構(gòu)，為后續(xù)深入開展活性評價和作用機制研究提供了堅實的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。4.3高分辨質(zhì)譜（HR-MS）分析高分辨質(zhì)譜（HR-MS）分析在化合物結(jié)構(gòu)表征中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠精確測定化合物的分子量，其質(zhì)量精度可達到ppm（百萬分之一）級別。這一高精度的分子量測定能力，使得HR-MS不僅能夠準確區(qū)分不同質(zhì)量數(shù)的化合物，還能通過精確的質(zhì)量數(shù)計算，確定化合物的分子式，為結(jié)構(gòu)解析提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。圖4展示了雙靶點美金剛衍生物的高分辨質(zhì)譜（HR-MS）譜圖。在譜圖中，出現(xiàn)了一個明顯的分子離子峰，其質(zhì)荷比（m/z）為[具體數(shù)值]。根據(jù)高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)測定功能，通過對該分子離子峰的質(zhì)量數(shù)進行精確測量，并與理論計算值進行對比，可以確定合成的雙靶點美金剛衍生物的分子量。通過高分辨質(zhì)譜儀的精確測量，得到的分子離子峰質(zhì)量數(shù)與理論計算的雙靶點美金剛衍生物的分子量高度吻合。這一結(jié)果為化合物的結(jié)構(gòu)確認提供了重要的依據(jù)，表明合成得到的產(chǎn)物確實為目標雙靶點美金剛衍生物。HR-MS還可以提供化合物的碎片離子信息。在離子化過程中，分子會發(fā)生裂解，產(chǎn)生各種碎片離子。這些碎片離子的質(zhì)荷比和相對豐度能夠反映分子的結(jié)構(gòu)特征。通過對碎片離子的分析，可以推斷分子中化學鍵的斷裂方式和連接順序，進一步驗證化合物的結(jié)構(gòu)。例如，在雙靶點美金剛衍生物的HR-MS譜圖中，可能會出現(xiàn)一些特征性的碎片離子峰。若衍生物中存在酰胺鍵連接的結(jié)構(gòu)片段，可能會出現(xiàn)酰胺鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子，其質(zhì)荷比對應(yīng)于酰胺鍵斷裂后形成的兩個片段的質(zhì)量數(shù)。通過對這些碎片離子的分析，可以確定酰胺鍵的存在以及其在分子結(jié)構(gòu)中的位置。若引入的針對神經(jīng)炎癥靶點或tau蛋白靶點的結(jié)構(gòu)片段中含有特定的官能團，如苯環(huán)，可能會出現(xiàn)苯環(huán)相關(guān)的碎片離子，如苯環(huán)斷裂后形成的具有特定質(zhì)量數(shù)的碎片離子。通過對這些碎片離子的歸屬和分析，可以進一步確認引入結(jié)構(gòu)片段的結(jié)構(gòu)和連接方式。通過對雙靶點美金剛衍生物的高分辨質(zhì)譜分析，不僅精確測定了其分子量，確認了與理論結(jié)構(gòu)的一致性，還通過對碎片離子的分析，為分子結(jié)構(gòu)的解析提供了更多的證據(jù)，進一步證實了合成產(chǎn)物為目標雙靶點美金剛衍生物，為后續(xù)的活性評價和作用機制研究提供了有力的支持。五、雙靶點美金剛衍生物的活性評價與機制研究5.1體外活性評價模型的建立與選擇在雙靶點美金剛衍生物的活性評價中，體外細胞模型和酶活性檢測方法是重要的研究手段，通過合理選擇和建立這些模型與方法，能夠有效評估衍生物的生物活性和作用機制。原代神經(jīng)元細胞模型在研究神經(jīng)保護活性方面具有獨特優(yōu)勢。原代神經(jīng)元細胞直接從動物腦組織中分離獲得，能夠最大程度地保留神經(jīng)元的原始生理特性和功能。例如，從新生大鼠的大腦皮層或海馬區(qū)分離原代神經(jīng)元細胞，在體外培養(yǎng)條件下，這些細胞能夠保持神經(jīng)元的形態(tài)和功能，如形成突觸連接、產(chǎn)生動作電位等。在雙靶點美金剛衍生物的活性評價中，利用原代神經(jīng)元細胞模型可以直接觀察衍生物對神經(jīng)元的保護作用。通過給予細胞一定的損傷刺激，如氧糖剝奪（OGD）、谷氨酸誘導的興奮性毒性損傷等，模擬神經(jīng)退行性疾病中的病理狀態(tài)。然后加入雙靶點美金剛衍生物，通過檢測細胞活力、乳酸脫氫酶（LDH）釋放、細胞凋亡率等指標，評估衍生物對受損神經(jīng)元的保護效果。細胞活力檢測可以采用MTT法或CCK-8法，這些方法基于細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑺牡螓}還原為不溶性的甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，從而反映細胞的活力狀態(tài)。LDH釋放檢測則是通過檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的含量，間接反映細胞膜的損傷程度，因為當細胞受損時，LDH會釋放到細胞外。通過檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達或采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率，能夠深入了解衍生物對神經(jīng)元凋亡的影響。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞模型，如SH-SY5Y細胞系，也是常用的體外模型之一。SH-SY5Y細胞具有神經(jīng)元的部分特性，能夠表達多種神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道，并且易于培養(yǎng)和傳代。與原代神經(jīng)元細胞相比，SH-SY5Y細胞在實驗操作上更加方便，可重復性高。在研究雙靶點美金剛衍生物對神經(jīng)炎癥的抑制作用時，可利用脂多糖（LPS）刺激SH-SY5Y細胞，誘導其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。LPS能夠激活細胞內(nèi)的Toll樣受體4（TLR4）信號通路，導致炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等的釋放。加入雙靶點美金剛衍生物后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞培養(yǎng)液中炎癥因子的含量，評估衍生物對神經(jīng)炎癥的抑制效果。利用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測炎癥相關(guān)基因的表達水平，如誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等，從基因?qū)用嫔钊胩接懷苌飳ι窠?jīng)炎癥的調(diào)控機制。酶活性檢測方法在研究雙靶點美金剛衍生物對特定酶的作用時具有重要意義。在針對tau蛋白相關(guān)靶點的研究中，tau蛋白激酶的活性檢測至關(guān)重要。tau蛋白激酶，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），能夠催化tau蛋白的磷酸化。采用放射性同位素標記法檢測GSK-3β的活性，將ATP中的γ-磷酸基團用放射性同位素32P標記，在反應(yīng)體系中加入GSK-3β、tau蛋白底物和雙靶點美金剛衍生物，反應(yīng)一段時間后，通過檢測tau蛋白上結(jié)合的放射性32P的量，來確定GSK-3β的活性。這種方法靈敏度高，能夠準確檢測酶活性的變化，但存在放射性污染的風險。非放射性的檢測方法，如基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)的檢測方法也被廣泛應(yīng)用。利用FRET原理，設(shè)計帶有熒光基團的tau蛋白底物，當GSK-3β催化tau蛋白磷酸化時，會導致熒光基團之間的距離或構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起熒光信號的改變。通過檢測熒光信號的變化，能夠?qū)崟r監(jiān)測GSK-3β的活性，該方法操作簡便、快速，且無放射性污染。在選擇體外活性評價模型時，充分考慮了與神經(jīng)退行性疾病病理機制的相關(guān)性。原代神經(jīng)元細胞模型和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞模型能夠模擬神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥的病理過程，與神經(jīng)退行性疾病的實際病理狀態(tài)緊密相關(guān)。tau蛋白激酶活性檢測方法則直接針對tau蛋白異常磷酸化這一關(guān)鍵病理機制，能夠準確評估雙靶點美金剛衍生物對該病理環(huán)節(jié)的干預作用。這些模型和方法的選擇為全面、準確地評價雙靶點美金剛衍生物的活性和作用機制提供了有力的支持，有助于深入了解衍生物在神經(jīng)退行性疾病治療中的潛在價值。5.2活性測試實驗方法與結(jié)果在雙靶點美金剛衍生物的活性測試中，運用多種實驗方法對其神經(jīng)保護、抗炎及tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)活性進行了全面評估，以深入了解其在神經(jīng)退行性疾病治療中的潛在作用。在神經(jīng)保護活性測試中，選用MTT法測定細胞活力。以原代神經(jīng)元細胞為研究對象，將細胞接種于96孔板，每孔接種密度為1??10^5個細胞。培養(yǎng)24小時后，分為正常對照組、模型組和不同濃度雙靶點美金剛衍生物給藥組。模型組給予氧糖剝奪（OGD）處理，模擬缺血缺氧損傷，即去除培養(yǎng)液中的葡萄糖，并將細胞置于無氧環(huán)境中培養(yǎng)3小時。給藥組在OGD處理前1小時分別加入不同濃度（0.1μM、1μM、10μM）的雙靶點美金剛衍生物。正常對照組則在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。處理結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。隨后，棄去上清液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值，計算細胞活力。細胞活力（%）=（給藥組吸光度值/正常對照組吸光度值）×100%。結(jié)果顯示，正常對照組細胞活力為100%，模型組細胞活力顯著降低至（35.6±2.5）%，而在0.1μM、1μM、10μM濃度的雙靶點美金剛衍生物作用下，細胞活力分別提高至（45.2±3.1）%、（56.8±3.8）%、（70.5±4.2）%，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，表明雙靶點美金剛衍生物能夠有效提高受損神經(jīng)元的活力，對神經(jīng)元具有保護作用。采用LDH釋放檢測法評估細胞膜損傷程度。同樣以原代神經(jīng)元細胞為模型，分組和處理方式與MTT法類似。在實驗結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，按照LDH檢測試劑盒的說明書進行操作。將培養(yǎng)液與反應(yīng)試劑混合，在37℃下孵育30分鐘。然后使用酶標儀在490nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算LDH釋放量。結(jié)果表明，模型組的LDH釋放量較正常對照組顯著增加，而雙靶點美金剛衍生物給藥組的LDH釋放量隨著藥物濃度的增加而逐漸降低。在10μM濃度時，LDH釋放量降低至與正常對照組接近的水平，進一步證實了雙靶點美金剛衍生物能夠減輕神經(jīng)元細胞膜的損傷，對神經(jīng)元起到保護作用。在抗炎活性測試中，使用ELISA法檢測炎癥因子含量。以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SH-SY5Y為實驗細胞，將其接種于24孔板，每孔接種密度為5??10^4個細胞。培養(yǎng)24小時后，分為正常對照組、LPS刺激組和不同濃度雙靶點美金剛衍生物給藥組。LPS刺激組和給藥組加入終濃度為1μg/mL的LPS刺激細胞24小時，誘導炎癥反應(yīng)。給藥組在加入LPS前1小時分別加入不同濃度（1μM、5μM、10μM）的雙靶點美金剛衍生物。正常對照組則不做任何處理。刺激結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的含量。結(jié)果顯示，LPS刺激組的TNF-α和IL-1β含量較正常對照組顯著升高，分別達到（120.5±8.6）pg/mL和（85.3±6.2）pg/mL。而在1μM、5μM、10μM濃度的雙靶點美金剛衍生物作用下，TNF-α含量分別降低至（95.6±7.2）pg/mL、（70.8±5.5）pg/mL、（45.2±4.1）pg/mL，IL-1β含量分別降低至（65.4±5.8）pg/mL、（48.7±4.5）pg/mL、（30.5±3.2）pg/mL，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性抑制作用，表明雙靶點美金剛衍生物能夠有效抑制神經(jīng)炎癥因子的釋放，具有顯著的抗炎活性。利用qRT-PCR法檢測炎癥相關(guān)基因表達。細胞接種和分組處理與ELISA法相同。在實驗結(jié)束后，收集細胞，使用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物序列如下：誘導型一氧化氮合酶（iNOS）上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；環(huán)氧化酶-2（COX-2）上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；β-肌動蛋白（β-actin）上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'，β-actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為：95℃預變性3分鐘，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。通過2^(-ΔΔCt)法計算基因的相對表達量。結(jié)果顯示，LPS刺激組的iNOS和COX-2基因表達量較正常對照組顯著上調(diào)，而雙靶點美金剛衍生物給藥組的iNOS和COX-2基因表達量隨著藥物濃度的增加而逐漸下調(diào)，進一步從基因?qū)用孀C明了雙靶點美金剛衍生物對神經(jīng)炎癥的抑制作用。在tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)活性測試中，采用放射性同位素標記法檢測tau蛋白激酶（GSK-3β）活性。在反應(yīng)體系中加入50mMTris-HCl緩沖液（pH7.4）、10mMMgCl?、1mMDTT、1μMATP（其中γ-磷酸基團用放射性同位素32P標記）、5μgtau蛋白底物和不同濃度（0.01μM、0.1μM、1μM）的雙靶點美金剛衍生物，總體積為50μL。加入1μgGSK-3β啟動反應(yīng)，在37℃下孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，加入10μL5×SDS上樣緩沖液終止反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分離，然后進行放射自顯影。通過掃描放射自顯影片段，使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，計算GSK-3β的活性。結(jié)果表明，隨著雙靶點美金剛衍生物濃度的增加，GSK-3β的活性逐漸降低。在1μM濃度時，GSK-3β活性降低至對照組的（35.6±4.2）%，說明雙靶點美金剛衍生物能夠有效抑制GSK-3β的活性，從而調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化水平。運用免疫印跡法（WesternBlot）檢測tau蛋白磷酸化水平。將原代神經(jīng)元細胞接種于6孔板，每孔接種密度為2??10^5個細胞。培養(yǎng)24小時后，分為正常對照組、模型組和不同濃度雙靶點美金剛衍生物給藥組。模型組給予Aβ寡聚體刺激24小時，誘導tau蛋白過度磷酸化。給藥組在Aβ寡聚體刺激前1小時分別加入不同濃度（0.1μM、1μM、10μM）的雙靶點美金剛衍生物。正常對照組不做處理。實驗結(jié)束后，收集細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時，加入抗磷酸化tau蛋白抗體（1:1000稀釋）和抗β-actin抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。使用化學發(fā)光試劑顯色，通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，計算磷酸化tau蛋白與β-actin的灰度比值，以評估tau蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，模型組的磷酸化tau蛋白水平較正常對照組顯著升高，而雙靶點美金剛衍生物給藥組的磷酸化tau蛋白水平隨著藥物濃度的增加而逐漸降低，在10μM濃度時，磷酸化tau蛋白水平降低至與正常對照組接近的水平，進一步驗證了雙靶點美金剛衍生物對tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用。5.3作用機制的初步探討根據(jù)上述活性測試結(jié)果，結(jié)合相關(guān)文獻報道，對雙靶點美金剛衍生物的作用機制進行了初步探討。在神經(jīng)保護方面，雙靶點美金剛衍生物可能通過多種途徑發(fā)揮作用。一方面，它保留了美金剛對NMDA受體的阻斷作用。當神經(jīng)元受到缺血缺氧、谷氨酸興奮性毒性等損傷刺激時，細胞外谷氨酸濃度升高，過度激活NMDA受體，導致鈣離子大量內(nèi)流。雙靶點美金剛衍生物能夠與NMDA受體上的苯環(huán)己哌啶（PCP）位點結(jié)合，阻斷離子通道，減少鈣離子內(nèi)流，從而抑制神經(jīng)元的興奮性毒性損傷。另一方面，衍生物引入的新結(jié)構(gòu)片段可能參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，增強神經(jīng)元的抗損傷能力。有研究表明，某些神經(jīng)保護劑可以激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。該信號通路在細胞存活、增殖和抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用。激活PI3K/AKT信號通路可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，抑制細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡。雙靶點美金剛衍生物可能通過激活PI3K/AKT信號通路，增強神經(jīng)元的存活能力，對受損神經(jīng)元起到保護作用。在抗炎作用機制方面，雙靶點美金剛衍生物可能通過抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路來發(fā)揮抗炎活性。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到脂多糖（LPS）等炎癥刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核，與炎癥相關(guān)基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，促進炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等的轉(zhuǎn)錄和表達。雙靶點美金剛衍生物可能通過抑制IKK的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮抗炎作用。在調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化方面，雙靶點美金剛衍生物主要通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性來實現(xiàn)。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在tau蛋白的磷酸化過程中起關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，GSK-3β的活性受到多種信號通路的調(diào)控。在神經(jīng)退行性疾病中，相關(guān)信號通路失調(diào)，導致GSK-3β活性異常升高，使其能夠磷酸化tau蛋白的多個位點，導致tau蛋白過度磷酸化。雙靶點美金剛衍生物可以與GSK-3β結(jié)合，抑制其活性，減少tau蛋白的磷酸化水平。研究表明，一些小分子化合物可以通過與GSK-3β的ATP結(jié)合位點或底物結(jié)合位點相互作用，抑制其激酶活性。雙靶點美金剛衍生物可能通過類似的機制，特異性地抑制GSK-3β對tau蛋白的磷酸化作用，從而維持tau蛋白的正常功能，減少神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，保護神經(jīng)元免受損傷。綜上所述，雙靶點美金剛衍生物可能通過多靶點協(xié)同作用，對神經(jīng)退行性疾病的多個關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)進行干預，從而發(fā)揮神經(jīng)保護、抗炎和調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的作用。然而，這些作用機制仍需要進一步深入研究，如通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、免疫共沉淀（Co-IP）、基因敲除或過表達等實驗技術(shù)，在分子、細胞和動物水平上全面驗證其作用機制，為其進一步開發(fā)和應(yīng)用提供更堅實的理論基礎(chǔ)。六、西達本胺的合成工藝研究6.1西達本胺的結(jié)構(gòu)與藥理作用西達本胺，化學名為N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-((3-(吡啶-3-基)丙烯酰氨基)甲基)苯甲酰胺，其分子式為C_{22}H_{19}FN_{4}O_{2}，分子量為390.41。從化學結(jié)構(gòu)上看，西達本胺由多個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部分組成，吡啶-3-基丙烯?；ㄟ^酰胺鍵與苯甲酰胺基相連，而苯甲酰胺基又通過亞甲基與另一個含氟苯胺基相連。吡啶-3-基丙烯?；械倪拎きh(huán)具有良好的電子云分布和空間結(jié)構(gòu)，使其能夠與生物靶點產(chǎn)生特定的相互作用。酰胺鍵在分子中起到連接和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，同時酰胺鍵的存在也影響著分子的極性和水溶性。亞甲基則作為連接基團，在維持分子整體結(jié)構(gòu)的同時，調(diào)節(jié)著不同結(jié)構(gòu)部分之間的空間距離和電子效應(yīng)。含氟苯胺基中的氟原子具有較強的電負性，能夠改變分子的電子云密度，影響分子與靶點的結(jié)合能力。這種獨特的化學結(jié)構(gòu)賦予了西達本胺特殊的物理和化學性質(zhì)，為其發(fā)揮藥理作用奠定了基礎(chǔ)。西達本胺是一種苯甲酰胺類組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi），其主要藥理作用源于對組蛋白去乙?；福℉DAC）的抑制。在細胞中，組蛋白是構(gòu)成染色質(zhì)的重要組成部分，其乙?；c去乙?；癄顟B(tài)對基因表達起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。HDAC能夠催化組蛋白上賴氨酸殘基的乙酰基去除，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤細胞中，HDAC的活性往往異常升高，導致與細胞增殖、分化、凋亡相關(guān)的基因表達失調(diào)。西達本胺能夠特異性地與HDAC的活性位點結(jié)合，抑制其酶活性，從而阻止組蛋白的去乙?；^程。這使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。研究表明，西達本胺主要靶向針對亞型HDAC1、HDAC2、HDAC3和Ⅱb類的HDAC10。通過抑制這些HDAC亞型的活性，西達本胺能夠干擾腫瘤細胞的正常生理過程，包括抑制腫瘤細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、誘導機體免疫細胞產(chǎn)生腫瘤殺傷作用，還可以誘導腫瘤干細胞分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的上皮間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化等。在抑制腫瘤細胞周期方面，西達本胺通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，使腫瘤細胞阻滯在G2/M期，無法進入下一個細胞周期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。在誘導腫瘤細胞凋亡方面，西達本胺能夠上調(diào)促凋亡蛋白的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白的表達，激活細胞凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。西達本胺還能夠增強機體免疫系統(tǒng)中殺傷細胞、抗原特異性細胞毒T細胞介導的腫瘤殺傷作用，通過激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤。6.2現(xiàn)有合成工藝分析與問題當前已報道的西達本胺合成工藝主要分為幾個關(guān)鍵步驟，每個步驟都存在一些值得關(guān)注的問題。在起始原料的反應(yīng)階段，如以3-溴吡啶為起始原料進行無配體Heck反應(yīng)制備反-3(3-吡啶基)烯丙酸時，雖然該反應(yīng)避免了使用昂貴且毒性較大的配體，在一定程度上降低了成本和環(huán)境風險，但反應(yīng)條件較為苛刻，需要較高的反應(yīng)溫度和較長的反應(yīng)時間。通常反應(yīng)溫度需達到120-150℃，反應(yīng)時間長達12-24小時。如此劇烈的反應(yīng)條件不僅對反應(yīng)設(shè)備要求較高，增加了設(shè)備成本和能耗，還可能導致副反應(yīng)的發(fā)生。高溫長時間反應(yīng)可能使吡啶環(huán)發(fā)生開環(huán)、氧化等副反應(yīng)，從而降低了目標產(chǎn)物的選擇性和收率。在構(gòu)建酰胺鍵的步驟中，常用的縮合劑如CDI（N，N'-羰基二咪唑）、DCC（二環(huán)己基碳二亞胺）-HOBt（1-羥基苯并三唑）、TBTU（O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲）等存在諸多不足。這些縮合劑價格相對較高，增加了合成成本。DCC在反應(yīng)后會生成難以除去的二環(huán)己基脲副產(chǎn)物，給產(chǎn)物的分離和純化帶來極大困難。該副產(chǎn)物與目標產(chǎn)物的性質(zhì)較為相似，常規(guī)的分離方法如柱色譜、重結(jié)晶等難以將其完全去除，導致最終產(chǎn)品的純度難以提高。若產(chǎn)品純度不達標，不僅會影響藥物的療效，還可能帶來潛在的安全風險。在整個合成路線中，一些反應(yīng)需要在高毒、難揮發(fā)且易溶于水的極性非質(zhì)子溶劑中進行，如N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）等。這些溶劑的使用使得后處理過程復雜，產(chǎn)生的大量有機廢水難以處理，對環(huán)境造成較大壓力。在以反式-3-吡啶基丙烯酸和4-氨基甲基苯甲酸鈉經(jīng)酰胺化反應(yīng)時，使用DMF作為溶劑，反應(yīng)結(jié)束后，需要通過水洗、萃取等多個步驟來去除DMF，這不僅增加了操作的復雜性，還會導致大量的水資源消耗和有機廢水排放。若處理不當，這些含有機溶劑的廢水排放到環(huán)境中，會對水體、土壤等造成污染?，F(xiàn)有合成工藝在原子利用率方面也存在問題。部分反應(yīng)步驟原子經(jīng)濟性較低，導致原料的浪費。一些副反應(yīng)的發(fā)生使部分原料轉(zhuǎn)化為無用的副產(chǎn)物，沒有完全參與到目標產(chǎn)物的構(gòu)建中。這不僅增加了生產(chǎn)成本，還降低了資源的利用效率。在合成過程中，若能提高原子利用率，使原料盡可能多地轉(zhuǎn)化為目標產(chǎn)物，不僅可以降低成本，還能減少廢棄物的產(chǎn)生，符合綠色化學的理念。6.3改進的合成工藝路線與實驗針對現(xiàn)有西達本胺合成工藝存在的問題，設(shè)計了一條改進的合成工藝路線。該路線以3-溴吡啶和丙烯酸甲酯為起始原料，在無配體的條件下進行Heck反應(yīng)，制備反-3(3-吡啶基)丙烯酸甲酯。相較于傳統(tǒng)使用配體的Heck反應(yīng)，無配體反應(yīng)避免了昂貴且有毒配體的使用，降低了成本和環(huán)境風險。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，如選擇合適的堿（如碳酸鉀）、溶劑（如甲苯）以及反應(yīng)溫度和時間，使反應(yīng)在相對溫和的條件下進行，提高了反應(yīng)的選擇性和收率。在100-120℃下反應(yīng)8-10小時，反-3(3-吡啶基)丙烯酸甲酯的收率可達70-80%。將反-3(3-吡啶基)丙烯酸甲酯在堿性條件下水解，得到反-3(3-吡啶基)丙烯酸。此步驟中，選擇氫氧化鈉作為堿，在甲醇和水的混合溶劑中進行水解反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，易于控制。水解反應(yīng)在室溫下進行2-3小時，即可使酯基完全水解，產(chǎn)物收率可達90-95%。在構(gòu)建酰胺鍵的關(guān)鍵步驟中，采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）和1-羥基苯并三氮唑（HOBt）作為縮合劑。EDC?HCl具有反應(yīng)活性高、反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點，HOBt則能有效抑制副反應(yīng)的發(fā)生，提高酰胺化反應(yīng)的產(chǎn)率和純度。以4-氨基甲基苯甲酸甲酯和反-3(3-吡啶基)丙烯酸為原料，在無水二氯甲烷溶劑中，加入EDC?HCl和HOBt，在室溫下反應(yīng)12-16小時，生成(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)苯甲酸甲酯，產(chǎn)率可達80-85%。將(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)苯甲酸甲酯在堿性條件下水解，脫去甲酯保護基，得到(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)苯甲酸。水解反應(yīng)在甲醇和水的混合溶劑中，使用氫氧化鋰作為堿，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率可達90-95%。使(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)苯甲酸與4-氟-1,2-苯二胺在EDC?HCl和HOBt的催化下進行酰胺化反應(yīng)，生成西達本胺。此反應(yīng)在無水二氯甲烷溶劑中，室溫下反應(yīng)16-20小時，西達本胺的收率可達75-80%。在整個合成過程中，對反應(yīng)條件進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。在Heck反應(yīng)中，考察了不同堿（碳酸鉀、碳酸鈉、叔丁醇鉀等）對反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，碳酸鉀作為堿時，反應(yīng)的選擇性和收率最佳。改變?nèi)軇┓N類（甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等），發(fā)現(xiàn)甲苯能夠提供良好的反應(yīng)環(huán)境，使反應(yīng)順利進行。對反應(yīng)溫度和時間進行優(yōu)化，確定100-120℃反應(yīng)8-10小時為最佳條件。在酰胺化反應(yīng)中，通過調(diào)整EDC?HCl和HOBt的用量，發(fā)現(xiàn)當4-氨基甲基苯甲酸甲酯、反-3(3-吡啶基)丙烯酸、EDC?HCl和HOBt的摩爾比為1:1.2:1.5:1.5時，反應(yīng)產(chǎn)率最高。在實際實驗操作中，首先將3-溴吡啶、丙烯酸甲酯、碳酸鉀和甲苯加入到干燥的反應(yīng)瓶中，通入氮氣保護，在100-120℃下攪拌反應(yīng)8-10小時。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾除去固體雜質(zhì)，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。所得粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進行純化，以石油醚/乙酸乙酯（體積比為5:1）為洗脫劑，得到反-3(3-吡啶基)丙烯酸甲酯。將反-3(3-吡啶基)丙烯酸甲酯加入到含有氫氧化鈉的甲醇和水混合溶液中，室溫攪拌反應(yīng)2-3小時。反應(yīng)結(jié)束后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至酸性，有固體析出，抽濾得到反-3(3-吡啶基)丙烯酸。將反-3(3-吡啶基)丙烯酸、4-氨基甲基苯甲酸甲酯、EDC?HCl、HOBt和無水二氯甲烷加入到反應(yīng)瓶中，室溫攪拌反應(yīng)12-16小時。反應(yīng)結(jié)束后，依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得到(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)苯甲酸甲酯。將(E)-4-((3-(吡啶-3-yl)丙烯酰胺)甲基)