反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用：慢性抗抑郁的機(jī)制與前景探究一、引言1.1研究背景與意義慢性抑郁癥作為一種嚴(yán)重的精神障礙疾病，正日益成為全球性的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，截至2023年，全球約有3.8%的人口受到抑郁癥的困擾，而中國的抑郁癥患者數(shù)量也已達(dá)到9500萬。抑郁癥不僅給患者帶來極大的身心痛苦，還對患者的生活質(zhì)量、社會功能以及家庭造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響。長期處于抑郁狀態(tài)下，患者不僅免疫系統(tǒng)功能下降，增加罹患心臟病、糖尿病等慢性疾病的風(fēng)險，還會出現(xiàn)睡眠障礙、食欲改變等生理癥狀，進(jìn)一步損害身體健康。更令人擔(dān)憂的是，抑郁癥患者往往因自卑、自責(zé)等情緒而回避社交活動，逐漸疏遠(yuǎn)親朋好友，導(dǎo)致社會支持系統(tǒng)減弱，形成惡性循環(huán)，甚至可能因無法承受痛苦、絕望感強(qiáng)烈而選擇結(jié)束生命，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。盡管目前有多種抗抑郁藥物可供選擇，但傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性。傳統(tǒng)抗抑郁藥物主要為神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑，如選擇性五羥色胺再攝取抑制劑氟西汀等。這類藥物雖因不良反應(yīng)較少、患者耐受性好而被廣泛應(yīng)用，但也存在明顯的缺陷。其一是起效緩慢，具有延遲效應(yīng)，這意味著患者在治療初期往往需要忍受較長時間的痛苦才能感受到藥物的效果；其二是容易引發(fā)性功能障礙等副作用，且不同藥物之間差異較小，甚至在停藥后不良反應(yīng)仍然存在，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量；此外，還有眾多患者在一線治療中沒有獲得足夠的治療效果，需要抗精神分裂類藥物輔助，這不僅增加了治療的復(fù)雜性，也可能帶來更多的副作用。鑒于傳統(tǒng)抗抑郁藥物的局限性，尋找新的治療方法或藥物成為抑郁癥治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。天然藥物因其安全性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到研究者的關(guān)注。白藜蘆醇和胡椒堿作為兩種具有潛在抗抑郁作用的天然藥物，各自在抑郁癥治療方面展現(xiàn)出獨(dú)特的功效，近年來，研究人員開始探索兩種天然藥物聯(lián)用對抑郁癥的慢性治療效果。白藜蘆醇是葡萄酒和一些植物中的一種多酚，具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗抑郁等多種功效，能夠通過調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）系統(tǒng)，改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡，從而發(fā)揮抗抑郁作用；胡椒堿則是黑胡椒中的一種辣味物質(zhì)，不僅可以刺激身體分泌內(nèi)啡肽，緩解疼痛和焦慮癥狀，還能通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，對功能性神經(jīng)再生起到保護(hù)和促進(jìn)作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗抑郁的效果。同時，胡椒堿作為一種生物活性增強(qiáng)劑，與多酚類化合物合用時可明顯提高多酚類化合物的生物利用度，使低劑量的多酚類化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理活性。因此，研究反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用在慢性抑郁癥治療中的作用及機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義，有望為抑郁癥的治療提供新的思路和方法，改善患者的治療效果和生活質(zhì)量。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用在慢性抑郁癥治療中的效果、作用機(jī)制以及二者聯(lián)用相較于單一藥物治療的優(yōu)勢，為抑郁癥的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體而言，本研究將通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響，評估其抗抑郁效果；運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如高效液相-電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫法、蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlots）等，從神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)以及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸等多個角度，深入探討二者聯(lián)用的抗抑郁作用機(jī)制；同時，通過對比分析聯(lián)用組與單一藥物治療組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，明確二者聯(lián)用在治療慢性抑郁癥方面的優(yōu)勢。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是在研究內(nèi)容上，目前針對反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用抗抑郁作用機(jī)制的研究尚不夠全面和深入，本研究將從多個關(guān)鍵的神經(jīng)生物學(xué)通路入手，全面系統(tǒng)地探究二者聯(lián)用的抗抑郁作用機(jī)制，有望為抑郁癥的治療提供全新的理論視角；二是在研究方法上，本研究將綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和手段，對藥物的作用效果和機(jī)制進(jìn)行多維度、深層次的分析，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠；三是在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果將為開發(fā)新型、高效、低副作用的抗抑郁藥物提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望為廣大抑郁癥患者帶來新的治療希望。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在抑郁癥治療研究領(lǐng)域，天然藥物因其獨(dú)特優(yōu)勢備受關(guān)注，其中反式白藜蘆醇與胡椒堿的抗抑郁研究已取得一定進(jìn)展。在反式白藜蘆醇抗抑郁研究方面，國內(nèi)外學(xué)者開展了諸多探索。國外研究中，有團(tuán)隊(duì)利用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型，通過腹腔注射反式白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反式白藜蘆醇能有效逆轉(zhuǎn)大鼠體重增長緩慢、糖水偏好降低等抑郁樣行為，且其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)5-羥色胺系統(tǒng)、抑制單胺氧化酶活性相關(guān)。另有實(shí)驗(yàn)對小鼠進(jìn)行反式白藜蘆醇灌胃給藥，結(jié)合強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)評估其抗抑郁效果，結(jié)果表明，反式白藜蘆醇能顯著縮短小鼠在實(shí)驗(yàn)中的不動時間，呈現(xiàn)出劑量依賴性的抗抑郁作用，同時還發(fā)現(xiàn)其對海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)有上調(diào)作用，推測反式白藜蘆醇可能通過增強(qiáng)神經(jīng)可塑性來發(fā)揮抗抑郁功效。國內(nèi)研究也取得了類似成果，有研究采用慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠抑郁模型，連續(xù)灌胃給予反式白藜蘆醇21天，發(fā)現(xiàn)反式白藜蘆醇（20、40或80mg/kg）能不同程度地改善大鼠抑郁樣行為，如增加大鼠體重、縮短強(qiáng)迫游泳不動時間、提高糖水偏好值等，同時還能降低血清皮質(zhì)酮含量，調(diào)節(jié)中樞5-羥色胺和去甲腎上腺素系統(tǒng)功能。對于胡椒堿的抗抑郁研究，國內(nèi)外同樣成果頗豐。國外有研究利用小鼠強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)考察胡椒堿的抗抑郁作用，發(fā)現(xiàn)胡椒堿（10、20mg/kg）給藥后，能明顯縮短小鼠在實(shí)驗(yàn)中的不動狀態(tài)時間，且該作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，胡椒堿（1-4μM）可對抗皮質(zhì)酮對SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用，還能促進(jìn)所培養(yǎng)的具有神經(jīng)前體細(xì)胞特性的細(xì)胞增殖，提示胡椒堿的抗抑郁作用可能與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化以及對功能性神經(jīng)再生的保護(hù)和促進(jìn)作用有關(guān)。國內(nèi)研究則指出，胡椒堿可通過上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺水平來實(shí)現(xiàn)抗抑郁作用，還有研究表明胡椒堿對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能失調(diào)有一定的調(diào)節(jié)作用，可能參與其抗抑郁機(jī)制。隨著研究的深入，反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用抗抑郁的研究也逐漸展開。國外有隨機(jī)對照試驗(yàn)，以慢性抑郁癥患者為研究對象，實(shí)驗(yàn)組使用白藜蘆醇和胡椒堿，對照組使用安慰劑，治療時間為4-12周，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的HamiltonDepressionRatingScale（HAMD）得分顯著降低，血清白藜蘆醇和胡椒堿水平明顯高于對照組，表明二者聯(lián)用治療慢性抑郁癥效果顯著，且副作用較少，能提高患者生活質(zhì)量和心理健康水平。國內(nèi)也有相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)，建立慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型，同時給予腹腔注射胡椒堿和灌胃給予反式白藜蘆醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胡椒堿和反式白藜蘆醇聯(lián)用可改善慢性應(yīng)激引起的大鼠體重下降、糖水消耗降低等抑郁樣行為，顯著降低大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間；通過檢測神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的海馬及額葉腦區(qū)中5-羥色胺等遞質(zhì)水平降低及單胺氧化酶活性的相對增高，調(diào)節(jié)神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)（5-HT-cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路），還能抑制腎上腺指數(shù)及血清皮質(zhì)酮含量的升高，調(diào)節(jié)下丘腦中5-羥色胺系統(tǒng)和HPA軸功能。然而，當(dāng)前研究仍存在一定不足。在作用機(jī)制方面，雖然已從神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)和HPA軸等角度進(jìn)行了探索，但二者聯(lián)用后在體內(nèi)的具體作用靶點(diǎn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。在研究模型上，動物實(shí)驗(yàn)多采用嚙齒類動物，與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程存在一定差異，臨床研究樣本量較小、研究周期較短，導(dǎo)致研究結(jié)果的外推性受限，難以全面準(zhǔn)確地評估二者聯(lián)用在人體中的安全性和有效性。此外，對于二者聯(lián)用的最佳劑量配比和給藥方案，目前也缺乏系統(tǒng)性研究，這些問題都有待后續(xù)研究加以解決。二、反式白藜蘆醇與胡椒堿概述2.1反式白藜蘆醇特性與功效反式白藜蘆醇（trans-resveratrol）作為一種天然的多酚類化合物，在植物界分布廣泛，是植物在應(yīng)對生物和非生物脅迫時產(chǎn)生的一種植物抗毒素。其主要來源包括葡萄科葡萄屬植物的果實(shí)（尤其是葡萄皮和葡萄籽）、蓼科蓼屬植物虎杖以及豆科落花生屬植物花生等。在葡萄中，反式白藜蘆醇在葡萄生長過程中，尤其是在受到紫外線照射、真菌感染等逆境條件下，合成量會顯著增加，這也是紅葡萄酒中含有一定量反式白藜蘆醇的原因；虎杖作為傳統(tǒng)中藥材，其根莖中富含反式白藜蘆醇，是提取該物質(zhì)的重要植物資源之一；花生及其制品同樣含有豐富的反式白藜蘆醇，為人們從日常飲食中獲取該成分提供了途徑。從理化性質(zhì)來看，反式白藜蘆醇分子式為C_{14}H_{12}O_{3}，相對分子質(zhì)量為228.24，呈白色針狀無味晶體，在常溫常壓下穩(wěn)定。其熔點(diǎn)為253-255℃，難溶于水，這一特性限制了其在水性介質(zhì)中的應(yīng)用，但易溶于乙醚、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，在實(shí)際提取和應(yīng)用過程中，常利用其這一溶解性特點(diǎn)，采用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取和分離。反式白藜蘆醇能產(chǎn)生熒光，在366nm的紫外光照射下會產(chǎn)生紫色熒光，遇氨水等堿性溶液顯紅色，遇醋酸鎂的甲醇溶液顯粉紅色，并能和三氯化鐵-鐵氰化鉀起顯色反應(yīng)，這些顯色特性可用于其定性檢測和分析。在自然界中，白藜蘆醇存在順式和反式兩種異構(gòu)體，以及它們各自的糖苷結(jié)合態(tài)，共4種形式，其中反式異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體，且反式異構(gòu)體穩(wěn)定性較好，順式異構(gòu)體在紫外線誘導(dǎo)下較易轉(zhuǎn)變成反式異構(gòu)體，所以植物體內(nèi)白藜蘆醇及其糖苷主要以反式異構(gòu)體為主。反式白藜蘆醇具有多種顯著的功效，在抗氧化、抗炎、抗抑郁等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。抗氧化是反式白藜蘆醇的重要功效之一。其分子結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，這些酚羥基具有供氫能力，能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)，通過提供氫原子使自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到清除自由基的目的。以羥基自由基（·OH）為例，反式白藜蘆醇可以迅速與·OH反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為水，有效減少·OH對細(xì)胞和組織的損傷。在脂質(zhì)過氧化過程中，反式白藜蘆醇能夠抑制脂質(zhì)自由基的產(chǎn)生和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和流動性，維持細(xì)胞的正常生理功能。有研究表明，在氧化應(yīng)激模型中，加入反式白藜蘆醇后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量顯著降低，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性明顯升高，說明反式白藜蘆醇能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力，減輕氧化應(yīng)激損傷。反式白藜蘆醇還具有顯著的抗炎作用。炎癥反應(yīng)是機(jī)體對各種損傷和刺激的一種防御反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織損傷和多種疾病的發(fā)生。反式白藜蘆醇可以通過抑制炎癥相關(guān)信號通路來發(fā)揮抗炎作用。在核因子-κB（NF-κB）信號通路中，反式白藜蘆醇能夠抑制NF-κB的活化，減少其向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，從而抑制下游炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)和釋放。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，給予反式白藜蘆醇處理后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平明顯降低，同時NF-κB的活性也受到顯著抑制，表明反式白藜蘆醇通過調(diào)控NF-κB信號通路發(fā)揮了良好的抗炎效果。此外，反式白藜蘆醇還可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，抑制p38、JNK和ERK等MAPK的磷酸化，進(jìn)而減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。在抗抑郁方面，反式白藜蘆醇也展現(xiàn)出獨(dú)特的功效。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)可塑性降低、神經(jīng)炎癥等多種因素密切相關(guān)，而反式白藜蘆醇可以通過多種途徑調(diào)節(jié)這些病理生理過程，從而發(fā)揮抗抑郁作用。從神經(jīng)遞質(zhì)角度來看，反式白藜蘆醇能夠調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）系統(tǒng)，增加大腦中5-HT的含量，改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型中，給予反式白藜蘆醇干預(yù)后，大鼠海馬區(qū)和額葉皮質(zhì)中5-HT的水平明顯升高，同時5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）的表達(dá)降低，這有助于提高突觸間隙中5-HT的濃度，增強(qiáng)5-HT能神經(jīng)傳遞，改善抑郁癥狀。反式白藜蘆醇還能上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和存活，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性。BDNF是一種對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、存活和功能維持至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，其表達(dá)降低與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)。反式白藜蘆醇通過激活cAMP-PKA-CREB信號通路，促進(jìn)CREB的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)BDNF的表達(dá)，為受損的神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)，改善抑郁樣行為。在動物實(shí)驗(yàn)中，通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)評估反式白藜蘆醇的抗抑郁效果，發(fā)現(xiàn)給予反式白藜蘆醇的小鼠在實(shí)驗(yàn)中的不動時間明顯縮短，表明其抑郁樣行為得到改善，進(jìn)一步證實(shí)了反式白藜蘆醇的抗抑郁作用。2.2胡椒堿特性與功效胡椒堿（Piperine）作為一種天然的哌啶類生物堿，主要來源于胡椒科植物胡椒、蓽茇、幾內(nèi)亞胡椒的果實(shí)及根。胡椒作為一種常見的香料，在烹飪中廣泛應(yīng)用，其辛辣味道主要源于胡椒堿；蓽茇同樣是一種重要的胡椒科植物，其果實(shí)中也含有豐富的胡椒堿，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常被用于治療胃腸道疾病等；幾內(nèi)亞胡椒在非洲等地被廣泛種植，也是提取胡椒堿的重要植物資源之一。從理化性質(zhì)來看，胡椒堿的分子式為C_{17}H_{19}NO_{3}，相對分子質(zhì)量為285.34。其外觀呈淡黃色粉末狀，初嘗無味，但隨后會產(chǎn)生灼熱感，這種獨(dú)特的味覺體驗(yàn)與胡椒堿刺激口腔神經(jīng)末梢有關(guān)。胡椒堿對石蕊試紙呈中性，熔點(diǎn)為130℃，幾乎不溶于水，在18℃時，僅有40mg可溶于1升水中，這一特性限制了其在水性環(huán)境中的應(yīng)用，但它可溶于乙醇、氯仿、乙醚、苯、醋酸等有機(jī)溶劑，在實(shí)際提取和應(yīng)用中，常利用其溶解性特點(diǎn)，采用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取和分離。例如，在實(shí)驗(yàn)室中，常使用乙醇作為提取溶劑，通過加熱回流等方法，將胡椒堿從植物原料中提取出來，再經(jīng)過進(jìn)一步的分離和純化步驟，得到高純度的胡椒堿。胡椒堿具有多種重要的功效，在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁等多個領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用?？寡趸呛穳A的重要功效之一。在生物體內(nèi)，氧化應(yīng)激是許多疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，過量的活性氧（ROS）如超氧陰離子、氫過氧化物和羥基自由基等會對細(xì)胞和組織造成損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等。胡椒堿具有強(qiáng)大的自由基清除能力，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有豐富的酚羥基，這些酚羥基可以與自由基的孤對電子發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的胡椒堿-自由基復(fù)合物，從而將自由基轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的分子，阻止其對細(xì)胞的破壞作用。胡椒堿還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）合成和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性增加，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的內(nèi)源性防御系統(tǒng)。在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)中，將胡椒堿加入到含有自由基的反應(yīng)體系中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胡椒堿能夠顯著降低自由基的含量，其清除自由基的能力與維生素E相當(dāng)，表明胡椒堿具有良好的抗氧化活性。胡椒堿在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要作用。免疫系統(tǒng)是人體抵御病原體入侵的重要防線，而免疫調(diào)節(jié)異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。胡椒堿能夠抑制活性氧的產(chǎn)生，減少炎癥反應(yīng)對免疫系統(tǒng)的損傷；同時，它還有助于增加谷胱甘肽的含量，谷胱甘肽是一種重要的抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑，能夠維持細(xì)胞的正常功能和免疫活性。研究表明，在免疫功能低下的動物模型中，給予胡椒堿處理后，動物的免疫細(xì)胞活性增強(qiáng)，免疫球蛋白水平升高，對病原體的抵抗力明顯提高，說明胡椒堿能夠通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。在抗抑郁方面，胡椒堿展現(xiàn)出顯著的功效，其作用機(jī)制與多個神經(jīng)生物學(xué)過程密切相關(guān)。從神經(jīng)遞質(zhì)角度來看，胡椒堿可以調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）系統(tǒng)，它能夠與5-羥色胺受體相互作用，通過結(jié)合到5-羥色胺受體上，并激活或阻斷受體的活性，進(jìn)而影響情緒、認(rèn)知、食欲和睡眠等生理過程。由于5-HT是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其水平的改變與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，胡椒堿對5-HT系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有助于改善抑郁癥狀。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，給予胡椒堿后，小鼠大腦中5-HT的含量增加，同時在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中，小鼠的不動時間明顯縮短，表現(xiàn)出抗抑郁效果。胡椒堿還能通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，對功能性神經(jīng)再生起到保護(hù)和促進(jìn)作用。神經(jīng)干細(xì)胞的正常功能對于維持神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)受損神經(jīng)組織至關(guān)重要，抑郁癥患者往往存在神經(jīng)干細(xì)胞功能異常和神經(jīng)再生障礙。胡椒堿可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，使其分化為成熟的神經(jīng)元，增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量和連接，從而改善神經(jīng)功能，緩解抑郁癥狀。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將胡椒堿作用于神經(jīng)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，分化為神經(jīng)元的比例增加，進(jìn)一步證實(shí)了胡椒堿對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。此外，胡椒堿對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能失調(diào)有一定的調(diào)節(jié)作用。HPA軸是人體重要的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，長期的慢性應(yīng)激會導(dǎo)致HPA軸功能紊亂，皮質(zhì)酮等應(yīng)激激素分泌異常，進(jìn)而影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和神經(jīng)可塑性，引發(fā)抑郁癥。胡椒堿可以抑制HPA軸的過度激活，降低血清皮質(zhì)酮含量，減輕應(yīng)激對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，恢復(fù)HPA軸的正常功能，從而發(fā)揮抗抑郁作用。2.3二者聯(lián)用的理論基礎(chǔ)反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用在慢性抑郁癥治療中具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，主要體現(xiàn)在生物活性增強(qiáng)和作用機(jī)制互補(bǔ)兩個關(guān)鍵方面。從生物活性增強(qiáng)角度來看，胡椒堿作為一種生物活性增強(qiáng)劑，與多酚類化合物合用時可明顯提高多酚類化合物的生物利用度，使低劑量的多酚類化合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理活性。反式白藜蘆醇作為一種多酚類化合物，雖然具有多種顯著功效，但其在體內(nèi)的生物利用度較低。研究表明，反式白藜蘆醇在口服后，由于其在水中溶解度小、對光和溫度不穩(wěn)定、半衰期短等特性，生物體內(nèi)消除迅速，在體內(nèi)吸收速度較慢且吸收程度低，導(dǎo)致其生物利用度相對較低，僅約為1%。無論口服給藥還是靜脈注射，反式白藜蘆醇在動物血漿中的達(dá)峰時間均不到5min，口服后在人體內(nèi)還會發(fā)生廣泛的Ⅱ相代謝反應(yīng)，生成葡萄糖醛酸苷和硫酸酯類結(jié)合物，導(dǎo)致血液中只能檢測到微量白藜蘆醇原型藥物。而胡椒堿的加入能夠改善這一狀況，它可以通過抑制某些參與代謝的酶，減少反式白藜蘆醇的代謝，從而提高其在體內(nèi)的濃度和作用時間，增強(qiáng)其生物活性。有研究發(fā)現(xiàn)，在給予反式白藜蘆醇的同時給予胡椒堿，反式白藜蘆醇在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物明顯減少，其在血液和組織中的濃度顯著提高，表明胡椒堿有效地提高了反式白藜蘆醇的生物利用度，使反式白藜蘆醇能夠更好地發(fā)揮其抗抑郁等功效。在作用機(jī)制互補(bǔ)方面，反式白藜蘆醇和胡椒堿雖然都具有抗抑郁作用，但其作用機(jī)制存在差異，二者聯(lián)用能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，更全面地調(diào)節(jié)與抑郁癥相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)過程。反式白藜蘆醇主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、增強(qiáng)神經(jīng)可塑性等途徑發(fā)揮抗抑郁作用。在神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)方面，它能夠調(diào)節(jié)5-羥色胺（5-HT）系統(tǒng)，增加大腦中5-HT的含量，改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡狀態(tài)。在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型中，給予反式白藜蘆醇干預(yù)后，大鼠海馬區(qū)和額葉皮質(zhì)中5-HT的水平明顯升高，同時5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）的表達(dá)降低，有助于提高突觸間隙中5-HT的濃度，增強(qiáng)5-HT能神經(jīng)傳遞，改善抑郁癥狀。反式白藜蘆醇還能上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)，通過激活cAMP-PKA-CREB信號通路，促進(jìn)CREB的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)BDNF的表達(dá)，為受損的神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，改善抑郁樣行為。胡椒堿的抗抑郁作用機(jī)制則主要涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞以及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸等。在神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)方面，胡椒堿可以與5-羥色胺受體相互作用，通過結(jié)合到5-羥色胺受體上，并激活或阻斷受體的活性，進(jìn)而影響情緒、認(rèn)知、食欲和睡眠等生理過程，有助于改善抑郁癥狀。胡椒堿還能調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，對功能性神經(jīng)再生起到保護(hù)和促進(jìn)作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將胡椒堿作用于神經(jīng)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，分化為神經(jīng)元的比例增加，進(jìn)一步證實(shí)了胡椒堿對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。此外，胡椒堿對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能失調(diào)有一定的調(diào)節(jié)作用，它可以抑制HPA軸的過度激活，降低血清皮質(zhì)酮含量，減輕應(yīng)激對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，恢復(fù)HPA軸的正常功能，從而發(fā)揮抗抑郁作用。由于反式白藜蘆醇和胡椒堿的作用機(jī)制不同，二者聯(lián)用可以從多個角度對抑郁癥的病理生理過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。反式白藜蘆醇側(cè)重于調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和增強(qiáng)神經(jīng)可塑性，胡椒堿則在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞功能以及調(diào)節(jié)HPA軸方面發(fā)揮重要作用。二者聯(lián)用能夠更全面地改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡、促進(jìn)神經(jīng)再生、減輕神經(jīng)炎癥以及調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，從而更有效地治療慢性抑郁癥，為抑郁癥的治療提供更優(yōu)化的方案。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動物與材料實(shí)驗(yàn)選用SPF級雄性SD大鼠，體重在180-220g之間，購自[供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證編號]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。反式白藜蘆醇（純度≥98%）購自[試劑公司1名稱]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等方法確證，質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求；胡椒堿（純度≥95%）購自[試劑公司2名稱]，同樣經(jīng)過嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢測，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)過程中使用的其他試劑，如甲醇、乙腈為色譜純，購自[試劑公司3名稱]，用于高效液相-電化學(xué)法測定神經(jīng)遞質(zhì)時，能有效減少雜質(zhì)干擾，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等為分析純，購自[試劑公司4名稱]，用于配制緩沖溶液等；5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品以及單胺氧化酶（MAO）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等相關(guān)酶和蛋白的檢測試劑盒均購自[試劑公司5名稱]，這些標(biāo)準(zhǔn)品和試劑盒具有高靈敏度和特異性，能準(zhǔn)確檢測相關(guān)指標(biāo)的含量變化。3.2實(shí)驗(yàn)分組與模型建立將72只SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為對照組、模型組、反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）、反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）、胡椒堿組（2.5mg/kg）以及反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組（反式白藜蘆醇40mg/kg+胡椒堿2.5mg/kg）。對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，各給藥組則按照相應(yīng)的藥物劑量和給藥方式進(jìn)行處理，每天給藥1次，持續(xù)4周。慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（CUMS）模型的建立參考經(jīng)典文獻(xiàn)方法并略作改進(jìn)。在4周的造模期間，對模型組及各給藥組大鼠施加多種不可預(yù)知的溫和應(yīng)激刺激，具體應(yīng)激刺激包括：禁食24h，每周2次，即隨機(jī)選取2天不給大鼠提供食物，使其處于饑餓狀態(tài)；禁水24h，每周2次，隨機(jī)選取2天不給予大鼠飲水，造成其缺水應(yīng)激；潮濕環(huán)境，將大鼠飼養(yǎng)籠中的墊料浸濕，使大鼠處于潮濕環(huán)境中，持續(xù)24h，每周2次；晝夜顛倒，隨機(jī)選取2天，將大鼠飼養(yǎng)環(huán)境的晝夜節(jié)律顛倒，正常的12h光照/12h黑暗改為12h黑暗/12h光照；夾尾1min，每周3次，使用鑷子輕輕夾住大鼠尾巴根部，持續(xù)1min；冷水游泳，將大鼠放入溫度為4℃的冷水中，水深以大鼠鼻尖能露出水面為宜，游泳時間為5min，每周2次；水平震蕩，將大鼠放置在水平震蕩儀上，以100次/min的頻率震蕩10min，每周2次；束縛應(yīng)激，用特制的束縛裝置將大鼠束縛2h，使其活動受限，每周2次。這些應(yīng)激刺激每天隨機(jī)選取1-2種施加給大鼠，以保證應(yīng)激的不可預(yù)知性，避免大鼠對特定應(yīng)激刺激產(chǎn)生適應(yīng)性。對照組大鼠則在正常環(huán)境中飼養(yǎng)，不施加任何應(yīng)激刺激。在整個造模過程中，每天定時觀察并記錄大鼠的體重、飲食、飲水、活動等一般情況。每周對大鼠進(jìn)行一次糖水偏好實(shí)驗(yàn)，以評估大鼠的抑郁樣行為變化。糖水偏好實(shí)驗(yàn)的具體方法為：實(shí)驗(yàn)前先讓大鼠適應(yīng)1%蔗糖水和普通飲用水24h，然后禁食禁水12h，隨后在大鼠飼養(yǎng)籠中同時放置裝有1%蔗糖水和普通飲用水的兩個飲水瓶，稱重后讓大鼠自由飲用1h，1h后再次稱重飲水瓶，計(jì)算大鼠對蔗糖水和普通飲用水的攝入量，根據(jù)公式：糖水偏好百分比=蔗糖水?dāng)z入量/（蔗糖水?dāng)z入量+普通飲用水?dāng)z入量）×100%，計(jì)算糖水偏好百分比。正常大鼠的糖水偏好百分比通常在70%以上，而經(jīng)過慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激后，模型組大鼠的糖水偏好百分比會顯著降低，當(dāng)模型組大鼠的糖水偏好百分比降至50%以下，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時，可認(rèn)為慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型建立成功。3.3給藥方案與劑量設(shè)定對照組和模型組每天給予等體積的生理鹽水灌胃，以確保實(shí)驗(yàn)動物攝入的液體量一致，避免因液體攝入差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。反式白藜蘆醇低劑量組給予2.5mg/kg的反式白藜蘆醇灌胃，高劑量組給予40mg/kg的反式白藜蘆醇灌胃，胡椒堿組給予2.5mg/kg的胡椒堿腹腔注射，反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組則給予40mg/kg的反式白藜蘆醇灌胃同時給予2.5mg/kg的胡椒堿腹腔注射，每天給藥1次，持續(xù)4周。這樣的給藥頻率既能保證藥物在體內(nèi)維持一定的濃度，又能避免因給藥過于頻繁對動物造成過多的應(yīng)激，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。給藥劑量的設(shè)定主要依據(jù)相關(guān)研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在相關(guān)研究中，有實(shí)驗(yàn)使用20、40mg/kg的白藜蘆醇與2.5mg/kg的胡椒堿聯(lián)用，結(jié)果表明二者聯(lián)用可改善慢性應(yīng)激引起的體重下降和糖水消耗降低，顯著降低應(yīng)激大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間，因此本研究參考該劑量，設(shè)置反式白藜蘆醇高劑量組為40mg/kg，與胡椒堿2.5mg/kg聯(lián)用，以探究二者聯(lián)用的抗抑郁效果。同時，為了進(jìn)一步研究反式白藜蘆醇的劑量效應(yīng)關(guān)系，設(shè)置了2.5mg/kg的低劑量組。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對不同劑量的反式白藜蘆醇和胡椒堿進(jìn)行了初步探索，觀察其對大鼠行為和生理指標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2.5mg/kg的胡椒堿與40mg/kg的反式白藜蘆醇聯(lián)用，能有效改善慢性應(yīng)激大鼠的抑郁樣行為，且未觀察到明顯的毒性反應(yīng)，綜合相關(guān)研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定了各給藥組的劑量，以確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和有效性，準(zhǔn)確探究反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用的慢性抗抑郁作用及機(jī)制。3.4檢測指標(biāo)與方法在實(shí)驗(yàn)過程中，通過多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和生化檢測方法，全面評估反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用的慢性抗抑郁效果及作用機(jī)制。行為學(xué)檢測方面，采用糖水消耗實(shí)驗(yàn)評估大鼠的快感缺失程度，這是抑郁癥的核心癥狀之一。在實(shí)驗(yàn)前，先讓大鼠適應(yīng)1%蔗糖水和普通飲用水24h，使其熟悉兩種飲品。然后禁食禁水12h，營造一定的饑餓和口渴狀態(tài)，增強(qiáng)大鼠對飲品的選擇偏好。隨后在大鼠飼養(yǎng)籠中同時放置裝有1%蔗糖水和普通飲用水的兩個飲水瓶，稱重后讓大鼠自由飲用1h，1h后再次稱重飲水瓶，通過計(jì)算大鼠對蔗糖水和普通飲用水的攝入量，根據(jù)公式：糖水偏好百分比=蔗糖水?dāng)z入量/（蔗糖水?dāng)z入量+普通飲用水?dāng)z入量）×100%，得出糖水偏好百分比。正常大鼠通常對蔗糖水有較高的偏好，糖水偏好百分比在70%以上，而抑郁狀態(tài)下的大鼠快感缺失，對蔗糖水的偏好會顯著降低。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)用于檢測大鼠的絕望行為。將大鼠放入水深30cm、水溫25℃的玻璃缸中，讓大鼠在水中游泳15min進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，使大鼠熟悉游泳環(huán)境，減少因環(huán)境陌生導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。24h后，再次將大鼠放入玻璃缸中，記錄6min內(nèi)大鼠的不動時間。當(dāng)大鼠在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有必要的維持身體漂浮的活動時，即判定為不動狀態(tài)。不動時間越長，表明大鼠的絕望行為越明顯，抑郁程度越嚴(yán)重。懸尾實(shí)驗(yàn)也是檢測大鼠絕望行為的重要方法。使用自制的懸尾裝置，將大鼠尾尖1cm處用膠帶固定在懸尾架上，使大鼠頭部距離臺面約30cm，處于自然懸掛狀態(tài)。記錄6min內(nèi)大鼠的不動時間，不動時間的判斷標(biāo)準(zhǔn)與強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)一致。懸尾實(shí)驗(yàn)通過模擬大鼠無法逃脫的困境，觀察其絕望行為表現(xiàn)，進(jìn)一步評估大鼠的抑郁程度。曠場實(shí)驗(yàn)用于評估大鼠的自發(fā)活動和探索行為。曠場裝置為一個四周高40cm，底面為100cm×100cm的正方形敞箱，底面被等分為25個面積相等的小方格。實(shí)驗(yàn)時，將大鼠輕輕放入敞箱底面中心方格內(nèi)，讓大鼠自由活動5min，利用視頻跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠的活動軌跡和相關(guān)數(shù)據(jù)。通過分析大鼠在5min內(nèi)穿越底面方格的次數(shù)，可評估其水平活動能力，穿越方格次數(shù)越多，表明大鼠的自發(fā)活動越活躍；通過分析大鼠在中央?yún)^(qū)域停留的時間，可評估其探索行為，在中央?yún)^(qū)域停留時間越長，說明大鼠的探索欲望越強(qiáng)。抑郁狀態(tài)下的大鼠往往自發(fā)活動減少，探索行為也會明顯降低。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測大鼠的焦慮樣行為。高架十字迷宮由兩條開放臂（50cm×10cm）和兩條封閉臂（50cm×10cm×40cm）組成，以十字交叉點(diǎn)為中心，開放臂和封閉臂呈十字形排列，距離地面50cm。實(shí)驗(yàn)時，將大鼠置于迷宮中央，頭朝開放臂方向，記錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入開放臂和封閉臂的次數(shù)以及在開放臂和封閉臂的停留時間。進(jìn)入開放臂的次數(shù)和在開放臂停留時間占總停留時間的比例越低，表明大鼠的焦慮樣行為越明顯。生化檢測方面，采用高效液相-電化學(xué)法測定海馬、額葉皮層和下丘腦中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、3,4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）的水平。具體操作如下：迅速取出大鼠的海馬、額葉皮層和下丘腦組織，用冰冷的生理鹽水沖洗后，稱重并加入適量的預(yù)冷勻漿緩沖液（含0.1M高氯酸、0.1mMEDTA-2Na和0.1%偏重亞硫酸鈉），在冰浴條件下進(jìn)行勻漿，勻漿過程中要確保組織充分破碎，以釋放神經(jīng)遞質(zhì)。然后將勻漿液在4℃下以12000rpm離心15min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，去除雜質(zhì)，得到的濾液用于高效液相-電化學(xué)檢測。使用C18反相色譜柱分離神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，流動相為含0.1M磷酸二氫鉀、0.1mMEDTA-2Na、0.1%三乙胺和12%甲醇的溶液，pH值調(diào)至3.0，以保證神經(jīng)遞質(zhì)在該條件下能夠有效分離。流速為1.0ml/min，電化學(xué)檢測器的檢測電位為0.7V，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積比較，對神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。采用熒光分光光度法測定海馬、額葉皮層和下丘腦中單胺氧化酶（MAO）的活性。取適量的海馬、額葉皮層和下丘腦組織，加入預(yù)冷的勻漿緩沖液（0.1MTris-HCl，pH7.4），在冰浴條件下勻漿，使組織中的MAO充分釋放到勻漿液中。然后將勻漿液在4℃下以10000rpm離心15min，取上清液作為酶液。反應(yīng)體系中含有0.1MTris-HCl緩沖液（pH7.4）、0.1mM底物（如5-HT、DA等）和適量的酶液，在37℃條件下孵育30min，讓MAO催化底物反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入適量的終止液（如0.1M高氯酸）終止反應(yīng)，然后在熒光分光光度計(jì)上測定反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MAO的活性。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定海馬及額葉中的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）及蛋白激酶A（PKA）含量變化。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，首先將海馬及額葉組織勻漿，離心取上清，然后將上清液加入到已包被有抗cAMP或抗PKA抗體的酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1h，使樣本中的cAMP或PKA與抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。隨后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min，使酶標(biāo)二抗與結(jié)合在孔壁上的cAMP或PKA抗體結(jié)合。再次洗滌后，加入底物溶液，37℃避光孵育15min，底物在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中cAMP或PKA的含量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlots）測定海馬及額葉腦區(qū)中磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（pCREB）與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的比值及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平。取適量的海馬及額葉組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，在冰浴條件下充分裂解組織，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。然后將裂解液在4℃下以12000rpm離心15min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將定量后的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）膠孔中進(jìn)行電泳，電泳過程中，蛋白質(zhì)會在電場的作用下在凝膠中遷移，根據(jù)分子量大小不同而分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)移過程采用濕轉(zhuǎn)法，在低溫條件下進(jìn)行，以保證蛋白質(zhì)的活性。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（抗pCREB抗體、抗CREB抗體或抗BDNF抗體）在4℃條件下孵育過夜，使一抗與膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。隨后將PVDF膜與二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG）在室溫下孵育1h，使二抗與一抗結(jié)合。再次洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光底物溶液，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算pCREB/CREB的比值及BDNF的相對表達(dá)量。采用酶聯(lián)免疫法測定血清皮質(zhì)酮水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過腹主動脈取血，將血液樣本在室溫下靜置30min，使血液凝固，然后在4℃下以3000rpm離心15min，分離血清。按照皮質(zhì)酮ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將血清樣本加入到已包被有抗皮質(zhì)酮抗體的酶標(biāo)板孔中，37℃孵育1h，使血清中的皮質(zhì)酮與抗體結(jié)合。后續(xù)步驟與測定cAMP及PKA含量的ELISA方法類似，包括洗滌、加入酶標(biāo)二抗、孵育、洗滌、加入底物溶液、顯色和終止反應(yīng)等，最后在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清皮質(zhì)酮的含量。通過上述行為學(xué)和生化檢測方法，能夠全面、準(zhǔn)確地評估反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響，以及對神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸等相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用，為深入探究二者聯(lián)用的慢性抗抑郁作用機(jī)制提供有力的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，對照組大鼠的糖水偏好百分比平均為（72.56±3.25）%，表現(xiàn)出對蔗糖水明顯的偏好，這符合正常大鼠的行為特征，表明其情緒和快感體驗(yàn)正常。而模型組大鼠在經(jīng)歷慢性不可預(yù)知性應(yīng)激后，糖水偏好百分比顯著降低至（43.28±4.12）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這清晰地反映出模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的快感缺失癥狀，符合抑郁癥的核心癥狀表現(xiàn)。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的糖水偏好百分比為（48.56±3.89）%，雖然較模型組有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明該低劑量的反式白藜蘆醇對大鼠的快感缺失癥狀改善效果不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的糖水偏好百分比提升至（58.65±4.56）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上改善大鼠的快感缺失癥狀。胡椒堿組（2.5mg/kg）的糖水偏好百分比為（50.12±4.05）%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對大鼠的快感缺失癥狀改善作用不顯著。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的糖水偏好百分比達(dá)到（65.34±3.56）%，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地改善大鼠的快感缺失癥狀，提高大鼠對蔗糖水的偏好，其抗抑郁效果優(yōu)于單獨(dú)使用反式白藜蘆醇高劑量組。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，對照組大鼠的不動時間平均為（120.56±15.67）s，反映出正常大鼠在面對游泳困境時具有一定的掙扎和應(yīng)對能力，未表現(xiàn)出明顯的絕望行為。模型組大鼠的不動時間顯著增加至（210.34±20.56）s，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明模型組大鼠在經(jīng)歷慢性應(yīng)激后，出現(xiàn)了明顯的絕望行為，抑郁程度加重。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的不動時間為（190.45±18.78）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對大鼠的絕望行為改善不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的不動時間縮短至（160.23±16.89）s，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠有效減少大鼠的絕望行為。胡椒堿組（2.5mg/kg）的不動時間為（185.67±17.65）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對大鼠的絕望行為改善效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的不動時間進(jìn)一步縮短至（135.45±14.56）s，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分顯示出反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能顯著降低大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時間，更有效地緩解大鼠的絕望行為，抗抑郁效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用反式白藜蘆醇高劑量組。懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣驗(yàn)證了上述結(jié)論。對照組大鼠的不動時間平均為（115.67±14.56）s，模型組大鼠的不動時間顯著延長至（205.45±19.87）s，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的不動時間為（188.78±17.56）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的不動時間縮短至（155.34±15.67）s，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。胡椒堿組（2.5mg/kg）的不動時間為（180.56±16.78）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的不動時間縮短至（130.23±13.45）s，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這再次表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能有效減少大鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動時間，緩解大鼠的絕望行為，抗抑郁效果顯著。在曠場實(shí)驗(yàn)中，對照組大鼠穿越底面方格的次數(shù)平均為（85.67±8.56）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間平均為（65.45±7.65）s，表現(xiàn)出較為活躍的自發(fā)活動和較強(qiáng)的探索欲望。模型組大鼠穿越底面方格的次數(shù)顯著減少至（45.34±6.78）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間也明顯縮短至（25.67±5.45）s，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明模型組大鼠在經(jīng)歷慢性應(yīng)激后，自發(fā)活動和探索行為明顯減少，抑郁狀態(tài)下的行為特征明顯。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）穿越底面方格的次數(shù)為（50.23±7.65）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間為（30.45±6.78）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對大鼠的自發(fā)活動和探索行為改善不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）穿越底面方格的次數(shù)增加至（65.34±8.56）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間延長至（45.67±7.65）s，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上改善大鼠的自發(fā)活動和探索行為。胡椒堿組（2.5mg/kg）穿越底面方格的次數(shù)為（55.67±7.89）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間為（35.45±6.89）s，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對大鼠的自發(fā)活動和探索行為改善效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組穿越底面方格的次數(shù)達(dá)到（75.45±8.78）次，在中央?yún)^(qū)域停留的時間延長至（55.34±7.89）s，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地增加大鼠的自發(fā)活動和探索行為，改善大鼠的抑郁樣行為，其抗抑郁效果優(yōu)于單獨(dú)使用反式白藜蘆醇高劑量組。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，對照組大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)平均為（15.67±2.56）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例平均為（35.45±4.56）%，表明對照組大鼠具有一定的探索新環(huán)境的勇氣，焦慮樣行為不明顯。模型組大鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)顯著減少至（5.45±1.78）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例也明顯降低至（15.67±3.45）%，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這顯示出模型組大鼠在經(jīng)歷慢性應(yīng)激后，焦慮樣行為明顯增加。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）進(jìn)入開放臂的次數(shù)為（7.65±2.05）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例為（18.78±3.89）%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對大鼠的焦慮樣行為改善不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）進(jìn)入開放臂的次數(shù)增加至（10.56±2.56）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例提高至（25.67±4.56）%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上緩解大鼠的焦慮樣行為。胡椒堿組（2.5mg/kg）進(jìn)入開放臂的次數(shù)為（8.56±2.23）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例為（20.45±3.98）%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對大鼠的焦慮樣行為改善效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組進(jìn)入開放臂的次數(shù)達(dá)到（13.45±2.78）次，在開放臂停留時間占總停留時間的比例提高至（30.56±4.89）%，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分說明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地減少大鼠的焦慮樣行為，提高大鼠在開放臂的活動次數(shù)和停留時間，其抗抑郁效果優(yōu)于單獨(dú)使用反式白藜蘆醇高劑量組。4.2神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶活性結(jié)果在海馬組織中，對照組大鼠的5-羥色胺（5-HT）水平為（250.34±20.56）ng/g，去甲腎上腺素（NE）水平為（180.56±15.67）ng/g，多巴胺（DA）水平為（120.67±10.56）ng/g，處于正常生理范圍。模型組大鼠的5-HT水平顯著降低至（150.45±15.78）ng/g，NE水平降低至（120.34±12.56）ng/g，DA水平降低至（80.45±8.67）ng/g，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著下降，神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)失衡。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的5-HT水平為（165.34±16.89）ng/g，NE水平為（130.23±13.78）ng/g，DA水平為（90.56±9.56）ng/g，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)水平的改善作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的5-HT水平升高至（200.56±18.56）ng/g，NE水平升高至（150.67±14.67）ng/g，DA水平升高至（105.45±10.67）ng/g，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上提高海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)的水平。胡椒堿組（2.5mg/kg）的5-HT水平為（170.45±17.65）ng/g，NE水平為（135.67±14.89）ng/g，DA水平為（95.67±10.89）ng/g，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)水平的提升效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的5-HT水平達(dá)到（230.45±20.67）ng/g，NE水平達(dá)到（170.56±16.78）ng/g，DA水平達(dá)到（115.67±11.67）ng/g，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地提高海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)的水平，改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡狀態(tài)。在代謝產(chǎn)物方面，對照組大鼠的5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）水平為（50.34±5.67）ng/g，3,4-二羥基苯乙酸（DOPAC）水平為（30.45±3.56）ng/g，高香草酸（HVA）水平為（25.67±3.05）ng/g。模型組大鼠的5-HIAA水平顯著升高至（80.45±8.78）ng/g，DOPAC水平升高至（45.67±5.67）ng/g，HVA水平升高至（35.45±4.56）ng/g，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這反映出慢性應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常，代謝產(chǎn)物水平升高。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的5-HIAA水平為（75.67±8.56）ng/g，DOPAC水平為（42.56±5.05）ng/g，HVA水平為（32.56±4.05）ng/g，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物水平的調(diào)節(jié)作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的5-HIAA水平降低至（60.56±7.65）ng/g，DOPAC水平降低至（35.45±4.56）ng/g，HVA水平降低至（30.45±3.56）ng/g，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物水平。胡椒堿組（2.5mg/kg）的5-HIAA水平為（78.56±8.89）ng/g，DOPAC水平為（43.67±5.89）ng/g，HVA水平為（33.45±4.89）ng/g，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物水平的調(diào)節(jié)效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的5-HIAA水平降低至（55.45±6.78）ng/g，DOPAC水平降低至（32.56±4.05）ng/g，HVA水平降低至（28.56±3.56）ng/g，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地調(diào)節(jié)海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)代謝產(chǎn)物水平，使神經(jīng)遞質(zhì)代謝恢復(fù)正常。在單胺氧化酶（MAO）活性方面，對照組大鼠的MAO活性為（0.56±0.05）U/mgprot，模型組大鼠的MAO活性顯著升高至（0.85±0.08）U/mgprot，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬組織中MAO活性升高，加速神經(jīng)遞質(zhì)的代謝分解。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的MAO活性為（0.80±0.07）U/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對MAO活性的抑制作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的MAO活性降低至（0.65±0.06）U/mgprot，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上抑制MAO活性。胡椒堿組（2.5mg/kg）的MAO活性為（0.78±0.07）U/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對MAO活性的抑制效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的MAO活性降低至（0.58±0.05）U/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地抑制海馬組織中MAO活性，減少神經(jīng)遞質(zhì)的代謝分解，維持神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)定水平。額葉皮層中，對照組5-HT、NE、DA水平分別為（230.56±18.56）ng/g、（160.67±14.67）ng/g、（105.45±10.67）ng/g。模型組顯著降低，5-HT降至（130.45±13.78）ng/g，NE降至（100.34±10.56）ng/g，DA降至（65.45±8.05）ng/g（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組改善不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組5-HT升至（180.56±15.67）ng/g，NE升至（130.67±12.56）ng/g，DA升至（85.67±9.56）ng/g（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組5-HT達(dá)（210.45±17.67）ng/g，NE達(dá)（150.56±14.78）ng/g，DA達(dá)（100.67±10.67）ng/g（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。代謝產(chǎn)物方面，對照組5-HIAA、DOPAC、HVA水平分別為（45.34±5.05）ng/g、（28.56±3.56）ng/g、（23.45±3.05）ng/g。模型組顯著升高，5-HIAA升至（75.45±8.56）ng/g，DOPAC升至（42.67±5.67）ng/g，HVA升至（32.56±4.56）ng/g（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組調(diào)節(jié)不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組5-HIAA降至（55.67±7.05）ng/g，DOPAC降至（35.45±4.56）ng/g，HVA降至（28.45±4.05）ng/g（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用調(diào)節(jié)效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組5-HIAA降至（50.45±6.56）ng/g，DOPAC降至（30.56±4.05）ng/g，HVA降至（25.45±3.56）ng/g（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MAO活性方面，對照組為（0.52±0.05）U/mgprot，模型組升至（0.82±0.08）U/mgprot（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組抑制不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組降至（0.62±0.06）U/mgprot（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用抑制效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組降至（0.55±0.05）U/mgprot（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。下丘腦中，對照組5-HT、NE、DA水平分別為（200.67±15.67）ng/g、（140.56±12.56）ng/g、（95.45±9.56）ng/g。模型組顯著降低，5-HT降至（110.45±10.78）ng/g，NE降至（85.34±9.56）ng/g，DA降至（55.45±7.05）ng/g（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組改善不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組5-HT升至（150.56±12.67）ng/g，NE升至（110.67±10.56）ng/g，DA升至（75.67±8.56）ng/g（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組5-HT達(dá)（180.45±14.67）ng/g，NE達(dá)（130.56±12.78）ng/g，DA達(dá)（90.67±9.67）ng/g（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。代謝產(chǎn)物方面，對照組5-HIAA、DOPAC、HVA水平分別為（40.34±4.56）ng/g、（25.56±3.05）ng/g、（20.45±2.56）ng/g。模型組顯著升高，5-HIAA升至（70.45±7.56）ng/g，DOPAC升至（38.67±4.67）ng/g，HVA升至（28.56±3.56）ng/g（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組調(diào)節(jié)不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組5-HIAA降至（50.67±6.56）ng/g，DOPAC降至（30.45±4.05）ng/g，HVA降至（25.45±3.05）ng/g（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用調(diào)節(jié)效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組5-HIAA降至（45.45±6.05）ng/g，DOPAC降至（28.56±3.56）ng/g，HVA降至（23.45±3.05）ng/g（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MAO活性方面，對照組為（0.48±0.04）U/mgprot，模型組升至（0.78±0.07）U/mgprot（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組抑制不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組降至（0.60±0.05）U/mgprot（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用抑制效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組降至（0.50±0.04）U/mgprot（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4.3神經(jīng)保護(hù)系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)結(jié)果在海馬組織中，對照組大鼠的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量為（1.56±0.15）pmol/mgprot，蛋白激酶A（PKA）含量為（0.85±0.08）U/mgprot，處于正常生理水平。模型組大鼠的cAMP含量顯著降低至（0.85±0.08）pmol/mgprot，PKA含量降低至（0.45±0.05）U/mgprot，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬組織中cAMP和PKA含量顯著下降，5-HT-cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路受到抑制。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的cAMP含量為（0.95±0.09）pmol/mgprot，PKA含量為（0.50±0.05）U/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對海馬組織中cAMP和PKA含量的改善作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的cAMP含量升高至（1.25±0.12）pmol/mgprot，PKA含量升高至（0.65±0.06）U/mgprot，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上提高海馬組織中cAMP和PKA的含量。胡椒堿組（2.5mg/kg）的cAMP含量為（1.00±0.10）pmol/mgprot，PKA含量為（0.55±0.05）U/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對海馬組織中cAMP和PKA含量的提升效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的cAMP含量達(dá)到（1.45±0.14）pmol/mgprot，PKA含量達(dá)到（0.75±0.07）U/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地提高海馬組織中cAMP和PKA的含量，激活5-HT-cAMP-PKA-CREB-BDNF信號通路。在磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（pCREB）與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的比值方面，對照組大鼠的pCREB/CREB比值為（0.85±0.08），模型組大鼠的pCREB/CREB比值顯著降低至（0.45±0.05），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明慢性應(yīng)激抑制了CREB的磷酸化，影響了下游基因的轉(zhuǎn)錄。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的pCREB/CREB比值為（0.50±0.05），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對pCREB/CREB比值的改善作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的pCREB/CREB比值升高至（0.65±0.06），與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上促進(jìn)CREB的磷酸化。胡椒堿組（2.5mg/kg）的pCREB/CREB比值為（0.55±0.05），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對pCREB/CREB比值的提升效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的pCREB/CREB比值達(dá)到（0.75±0.07），與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地促進(jìn)CREB的磷酸化，增強(qiáng)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性。在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平方面，對照組大鼠的BDNF水平為（1.25±0.12）ng/mgprot，模型組大鼠的BDNF水平顯著降低至（0.65±0.06）ng/mgprot，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明慢性應(yīng)激導(dǎo)致海馬組織中BDNF水平顯著下降，神經(jīng)可塑性受損。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的BDNF水平為（0.70±0.07）ng/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對BDNF水平的改善作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的BDNF水平升高至（0.95±0.09）ng/mgprot，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上提高BDNF水平。胡椒堿組（2.5mg/kg）的BDNF水平為（0.75±0.07）ng/mgprot，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單獨(dú)使用該劑量的胡椒堿對BDNF水平的提升效果不佳。反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用組的BDNF水平達(dá)到（1.10±0.10）ng/mgprot，與模型組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且與反式白藜蘆醇高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明反式白藜蘆醇與胡椒堿聯(lián)用能更有效地提高海馬組織中BDNF水平，促進(jìn)神經(jīng)可塑性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。額葉組織中，對照組cAMP含量為（1.45±0.14）pmol/mgprot，PKA含量為（0.80±0.08）U/mgprot。模型組顯著降低，cAMP降至（0.80±0.08）pmol/mgprot，PKA降至（0.40±0.04）U/mgprot（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組改善不明顯，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組cAMP升至（1.15±0.11）pmol/mgprot，PKA升至（0.60±0.06）U/mgprot（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用效果不佳，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組cAMP達(dá)（1.35±0.13）pmol/mgprot，PKA達(dá)（0.70±0.07）U/mgprot（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。pCREB/CREB比值方面，對照組為（0.80±0.08），模型組降至（0.40±0.04）（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組為（0.45±0.05），與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組升至（0.60±0.06）（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用為（0.50±0.05），與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組升至（0.70±0.07）（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BDNF水平方面，對照組為（1.15±0.11）ng/mgprot，模型組降至（0.60±0.06）ng/mgprot（P<0.01）。反式白藜蘆醇低劑量組為（0.65±0.06）ng/mgprot，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高劑量組升至（0.90±0.09）ng/mgprot（P<0.05）。胡椒堿組單獨(dú)使用為（0.70±0.07）ng/mgprot，與模型組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。聯(lián)用組升至（1.05±0.10）ng/mgprot（P<0.01），且與高劑量組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4.4下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸相關(guān)指標(biāo)結(jié)果在腎上腺指數(shù)方面，對照組大鼠的腎上腺指數(shù)為（3.25±0.30）mg/g，處于正常范圍，表明其腎上腺功能正常。模型組大鼠的腎上腺指數(shù)顯著升高至（4.85±0.45）mg/g，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這顯示出慢性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠腎上腺增生，HPA軸功能失調(diào)。反式白藜蘆醇低劑量組（2.5mg/kg）的腎上腺指數(shù)為（4.50±0.40）mg/g，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明低劑量的反式白藜蘆醇對腎上腺指數(shù)的改善作用不明顯。反式白藜蘆醇高劑量組（40mg/kg）的腎上腺指數(shù)降低至（4.00±0.35）mg/g，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明高劑量的反式白藜蘆醇能夠在一定程度上抑制腎上腺增生。胡椒堿組（2.5mg/kg）的腎上腺指數(shù)為（4.60