細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)操作規(guī)范指南細(xì)胞培養(yǎng)作為生命科學(xué)研究的核心技術(shù)之一，其操作規(guī)范性直接決定細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。本指南基于長(zhǎng)期實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，從環(huán)境準(zhǔn)備、試劑配置到細(xì)胞操作全流程梳理關(guān)鍵要點(diǎn)，助力科研人員建立標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)體系。一、環(huán)境與試劑準(zhǔn)備規(guī)范（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室需維持恒溫（25±2℃）、恒濕（50%~60%）環(huán)境，每日實(shí)驗(yàn)前開(kāi)啟層流生物安全柜（BSC）運(yùn)行30分鐘，紫外照射15~20分鐘（實(shí)驗(yàn)時(shí)需關(guān)閉紫外）。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面使用75%乙醇與含氯消毒劑交替擦拭，每周進(jìn)行一次全面清潔（含天花板、設(shè)備表面），避免粉塵與微生物堆積。（二）試劑與耗材準(zhǔn)備1.培養(yǎng)基配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM、RPMI-1640）需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型添加胎牛血清（FBS，終濃度10%~20%）、抗生素（青霉素-鏈霉素混合液，終濃度1%），使用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。血清需提前56℃滅活30分鐘（滅活后4℃保存不超過(guò)1個(gè)月），避免反復(fù)凍融。2.耗材處理：移液管、離心管等一次性耗材需選擇無(wú)熱源、無(wú)DNA酶/RNA酶的滅菌產(chǎn)品；玻璃器皿需經(jīng)121℃高壓滅菌20分鐘，烘干后存放于無(wú)菌柜。二、細(xì)胞復(fù)蘇操作流程（一）凍存管處理從液氮罐取出凍存管時(shí)，需佩戴防凍手套，快速轉(zhuǎn)移至37℃水浴鍋，持續(xù)輕搖至冰晶完全溶解（約1~2分鐘），避免水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞受熱損傷。（二）細(xì)胞接種1.溶解后的細(xì)胞懸液加入5mL預(yù)熱培養(yǎng)基（37℃），1000rpm離心5分鐘，棄上清（保留0.5mL重懸細(xì)胞）。2.按1×10?細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶的密度接種，加入5mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱，24小時(shí)內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶。三、傳代培養(yǎng)關(guān)鍵要點(diǎn)（一）消化時(shí)機(jī)判斷當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時(shí)需傳代，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)：貼壁細(xì)胞（如HeLa）呈單層生長(zhǎng)、間隙縮小；懸浮細(xì)胞（如Jurkat）密度達(dá)2×10?/mL以上。（二）消化操作規(guī)范1.棄舊培養(yǎng)基，加入2mLPBS（不含鈣鎂離子）漂洗細(xì)胞（去除殘留血清），靜置1分鐘后棄PBS。2.加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（預(yù)熱至37℃），覆蓋細(xì)胞層即可，37℃孵育1~3分鐘（貼壁較牢的細(xì)胞可延長(zhǎng)至5分鐘），鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。（三）細(xì)胞吹打與接種用移液管輕柔吹打細(xì)胞（避免產(chǎn)生氣泡），使細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液。按1:3~1:5的比例傳代（生長(zhǎng)快的細(xì)胞可降低接種密度），接種后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻，放回培養(yǎng)箱。四、細(xì)胞凍存操作規(guī)范（一）凍存液配置采用90%FBS+10%DMSO的凍存液（DMSO需提前預(yù)冷，避免損傷細(xì)胞），現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)期存放。（二）凍存流程1.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（狀態(tài)最佳），1000rpm離心5分鐘，棄上清后用凍存液重懸，調(diào)整密度至1×10?細(xì)胞/mL。2.細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、凍存日期，放入程序降溫盒（含異丙醇），-80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長(zhǎng)期保存。五、污染防控與處理（一）污染類(lèi)型識(shí)別細(xì)菌污染：培養(yǎng)基渾濁，鏡下可見(jiàn)快速游動(dòng)的短桿/球菌；真菌污染：培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色/黑色菌絲，鏡下可見(jiàn)分支狀孢子；支原體污染：細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、形態(tài)異常，需通過(guò)PCR或ELISA檢測(cè)。（二）預(yù)防措施實(shí)驗(yàn)全程佩戴口罩、手套，避免裸手接觸耗材；培養(yǎng)基每周更換2次，培養(yǎng)箱托盤(pán)水盤(pán)每周用含氯消毒劑清洗；新引入的細(xì)胞系需進(jìn)行支原體檢測(cè)，確認(rèn)無(wú)污染后再擴(kuò)增。（三）污染處理發(fā)現(xiàn)污染后立即將培養(yǎng)物移出實(shí)驗(yàn)室，用75%乙醇噴灑污染區(qū)域。若為重要細(xì)胞系，可嘗試用抗生素（如兩性霉素B處理真菌、慶大霉素處理細(xì)菌）挽救，但建議優(yōu)先復(fù)蘇凍存的無(wú)污染細(xì)胞。六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決策略（一）細(xì)胞貼壁不良原因：培養(yǎng)瓶未包被（如原代細(xì)胞）、血清質(zhì)量差、消化過(guò)度；解決：用多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)瓶，更換優(yōu)質(zhì)血清，縮短消化時(shí)間（或降低胰酶濃度）。（二）細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢原因：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足、CO?濃度異常、細(xì)胞密度過(guò)低；解決：補(bǔ)充谷氨酰胺（終濃度2mM），檢查培養(yǎng)箱CO?傳感器，提高接種密度（如1:2傳代改為1:3）。結(jié)語(yǔ)：細(xì)胞培養(yǎng)是一門(mén)“精