同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗：小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)的深度剖析一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2022年我國新發(fā)肺癌病例高達(dá)106.06萬例，占全部惡性腫瘤發(fā)病的22.0%，肺癌發(fā)病率和死亡率分別為75.13/10萬和51.94/10萬，且總體呈上升趨勢。在男性群體中，肺癌是發(fā)病率和死亡率均排名第一的惡性腫瘤；在女性群體中，肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，死亡率卻位居首位。盡管近年來醫(yī)療技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，但肺癌患者的5年生存率仍處于較低水平，預(yù)后情況不容樂觀。目前，臨床治療肺癌的主要方法包括手術(shù)切除、放療和化療。手術(shù)切除適用于早期肺癌患者，通過直接切除肺部腫瘤來達(dá)到治療目的，但對(duì)于中晚期肺癌患者，由于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，手術(shù)往往難以徹底清除癌細(xì)胞。放療利用放射線殺死腫瘤細(xì)胞，可用于不能手術(shù)或手術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，但放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成一定的損傷，產(chǎn)生如放射性肺炎、食管炎等副作用。化療則是通過使用化療藥物來殺死腫瘤細(xì)胞，適用于晚期肺癌患者，但化療藥物的副作用較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且長期化療還可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性，使得治療效果逐漸降低。此外，這些傳統(tǒng)治療方法還存在復(fù)發(fā)率較高的問題，許多患者在治療后仍面臨著腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響了患者的生存預(yù)后。因此，尋找新的治療方法以提高肺癌的治療效果和患者的生存率，成為了當(dāng)前肺癌研究領(lǐng)域的迫切需求。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，腫瘤免疫療法逐漸成為治療腫瘤的新方向，為肺癌的治療帶來了新的希望。腫瘤免疫療法的核心是激活人體自身的免疫系統(tǒng)，使其能夠識(shí)別并攻擊腫瘤細(xì)胞。人體的免疫系統(tǒng)本應(yīng)具備識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞的能力，但腫瘤細(xì)胞非常狡猾，它們會(huì)通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。腫瘤免疫療法就是要打破腫瘤細(xì)胞的這種免疫逃逸機(jī)制，重新激活免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性。例如，免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白的活性，如CTLA-4抑制劑和PD-1/PD-L1抑制劑，能夠解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，讓免疫細(xì)胞能夠重新發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。然而，免疫檢查點(diǎn)抑制劑并非對(duì)所有患者都有效，且存在一定的副作用和耐藥性問題，因此，進(jìn)一步探索新的免疫治療策略具有重要的臨床意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞在肺癌的生長和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞需要通過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管系統(tǒng)，進(jìn)而侵入其他組織，獲取養(yǎng)分和氧氣，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的增殖和擴(kuò)散。因此，針對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的治療策略成為了近年來的研究熱點(diǎn)之一。通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和功能，可以阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。基于此，疫苗誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫應(yīng)答成為了一種極具潛力的新型肺癌治療方法。“同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗”作為一種新型的治療手段，其主要作用機(jī)理是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。該疫苗利用同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為抗原，激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)。然而，目前對(duì)于該種疫苗在肺癌治療中的作用機(jī)制仍然不清楚，其在小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)中的具體作用和效果也有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。深入探究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗的作用機(jī)制和免疫效應(yīng)，對(duì)于優(yōu)化該疫苗的治療效果，為肺癌患者提供更有效的治療方法具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗在小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)中的作用機(jī)制，確定該疫苗在小鼠體內(nèi)的最佳劑量，以及評(píng)估其對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫效應(yīng)和治療效果。通過系統(tǒng)地研究疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，包括免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的變化、炎癥因子和細(xì)胞因子水平的改變等，揭示疫苗發(fā)揮免疫效應(yīng)的具體途徑和分子機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化該疫苗的治療效果提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。肺癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，當(dāng)前的治療方法存在諸多局限性，迫切需要探索新的有效治療策略。疫苗誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫應(yīng)答作為一種新型治療方法，具有獨(dú)特的作用機(jī)制和潛在優(yōu)勢，為肺癌治療帶來了新的希望。深入研究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗，有助于揭示肺癌免疫治療的新機(jī)制，為肺癌的臨床治療提供新的思路和方法。這不僅可以提高肺癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量，還能在腫瘤免疫治療領(lǐng)域取得理論和技術(shù)上的突破，推動(dòng)整個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，具有重要的臨床意義和科學(xué)價(jià)值。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，深入探究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)的機(jī)制，具體方法如下：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取健康的BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。通過皮下注射同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗，建立小鼠肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫模型，觀察疫苗對(duì)小鼠肺癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、疫苗注射劑量和時(shí)間等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)小鼠肺癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，將疫苗與細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察疫苗對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測細(xì)胞增殖活性，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，通過這些實(shí)驗(yàn)手段，深入了解疫苗對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠免疫后外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的變化，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等。通過分析免疫細(xì)胞的變化，評(píng)估疫苗對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的激活作用，以及免疫細(xì)胞在抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)中的作用。免疫組織化學(xué)技術(shù)：采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測小鼠肺組織中肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分布和數(shù)量。通過對(duì)肺組織切片進(jìn)行染色，觀察疫苗對(duì)肺癌血管生成的抑制作用，以及免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤情況，進(jìn)一步揭示疫苗的免疫效應(yīng)機(jī)制。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：采用ELISA法檢測小鼠血清中炎癥因子和細(xì)胞因子的水平，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等。分析這些炎癥因子和細(xì)胞因子在疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的變化，探討其對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析不同治療時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和肺癌病灶大小的變化，以及免疫細(xì)胞數(shù)量、炎癥因子和細(xì)胞因子水平與疫苗治療效果之間的相關(guān)性。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確疫苗的治療效果和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供有力的數(shù)據(jù)分析支持。本研究在研究角度和方法應(yīng)用上具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在研究角度方面，以往的肺癌治療研究主要集中在腫瘤細(xì)胞本身，而本研究從肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞這一全新的角度出發(fā)，探討疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)，為肺癌的治療提供了新的思路和方向。通過針對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫治療，有望阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，從而更有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在方法應(yīng)用方面，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、ELISA法等，從多個(gè)層面深入研究疫苗的免疫效應(yīng)機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確。這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，能夠更深入地了解疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程，為揭示疫苗的作用機(jī)制提供了有力的技術(shù)支持。此外，本研究還注重實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性，通過合理設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保研究結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，為同類研究提供了良好的范例。二、肺癌與血管內(nèi)皮細(xì)胞及免疫療法概述2.1肺癌現(xiàn)狀肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。近年來，隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加速、環(huán)境污染的加劇以及生活方式的改變，肺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌新發(fā)病例約為220萬例，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的11.4%；死亡病例約為180萬例，占所有惡性腫瘤死亡病例的18.0%，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居全球癌癥首位。在我國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。2020年中國肺癌新發(fā)病例約為82萬例，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的20.4%；死亡病例約為71萬例，占所有惡性腫瘤死亡病例的23.8%。從2000年到2016年，我國肺癌發(fā)病率從35.23/10萬上升至57.26/10萬，死亡率從29.47/10萬上升至47.06/10萬，且這種上升趨勢在未來一段時(shí)間內(nèi)仍可能持續(xù)。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌病例的85%，小細(xì)胞肺癌約占15%。非小細(xì)胞肺癌又可進(jìn)一步細(xì)分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等亞型。腺癌是最常見的非小細(xì)胞肺癌亞型，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是在不吸煙人群中。腺癌通常起源于肺部的外周組織，早期癥狀不明顯，往往在疾病進(jìn)展到中晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。鱗狀細(xì)胞癌多起源于較大的支氣管，與吸煙密切相關(guān)，患者多有長期吸煙史。大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞較大，形態(tài)多樣，惡性程度較高，生長和轉(zhuǎn)移速度較快。小細(xì)胞肺癌具有高度侵襲性，生長迅速，早期就容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)化療和放療較為敏感，但復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。肺癌的癥狀表現(xiàn)多樣，且早期癥狀往往不典型，容易被忽視。常見的癥狀包括咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難、發(fā)熱等?？人允欠伟┳畛Ｒ姷陌Y狀之一，多為刺激性干咳，無痰或僅有少量白色黏液痰。當(dāng)腫瘤侵犯支氣管黏膜或?qū)е轮夤塥M窄時(shí)，咳嗽癥狀會(huì)加重，且可能伴有咳痰?？┭彩欠伟┏Ｒ姷陌Y狀，表現(xiàn)為痰中帶血或少量咯血，少數(shù)患者可能出現(xiàn)大咯血。胸痛通常為胸部隱痛或鈍痛，當(dāng)腫瘤侵犯胸膜、胸壁或肋骨時(shí)，疼痛會(huì)加劇，且可能呈持續(xù)性。呼吸困難多見于腫瘤阻塞氣道或侵犯肺部組織導(dǎo)致肺功能受損的患者。發(fā)熱可能是由于腫瘤組織壞死、吸收引起的，也可能是由于肺部感染導(dǎo)致的。此外，肺癌患者還可能出現(xiàn)一些全身癥狀，如消瘦、乏力、食欲不振等，這些癥狀通常在疾病晚期更為明顯。隨著病情的進(jìn)展，肺癌還可能轉(zhuǎn)移至其他器官，如腦、骨、肝等，引起相應(yīng)的癥狀，如頭痛、骨痛、黃疸等。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療對(duì)于提高肺癌患者的生存率至關(guān)重要。因此，對(duì)于高危人群，如長期吸煙者、有肺癌家族史者、長期接觸致癌物質(zhì)者等，應(yīng)定期進(jìn)行肺癌篩查，以便早期發(fā)現(xiàn)病變，及時(shí)采取治療措施。2.2血管內(nèi)皮細(xì)胞在肺癌中的作用腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移離不開新生血管的形成，血管生成對(duì)于腫瘤的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用。在腫瘤生長過程中，隨著腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，腫瘤組織內(nèi)部的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)逐漸不足，代謝廢物也無法及時(shí)排出。為了滿足腫瘤細(xì)胞的生長需求，腫瘤組織會(huì)誘導(dǎo)血管生成，通過生成新的血管來獲取足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，維持腫瘤細(xì)胞的快速增殖。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管的主要組成部分，在腫瘤血管生成過程中扮演著核心角色。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，這些因子能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，促使它們形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，它能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加血管的通透性，從而為腫瘤細(xì)胞提供更多的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞還可以通過與周圍的基質(zhì)細(xì)胞相互作用，間接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管的生成。腫瘤血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。腫瘤細(xì)胞可以通過新生血管進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到身體的其他部位，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。因此，抑制腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的重要策略之一。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅參與腫瘤血管生成，還在腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建中發(fā)揮著重要作用。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與其他細(xì)胞成分之間存在著密切的相互作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些因子能夠招募免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)和細(xì)胞組成。IL-8可以吸引中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向腫瘤組織遷移，MCP-1則能夠趨化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過與免疫細(xì)胞表面的黏附分子相互作用，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等黏附分子，能夠與免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)免疫細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而影響免疫細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤和遷移。腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過改變自身的代謝狀態(tài)，影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的糖代謝異常活躍，它們能夠攝取大量的葡萄糖，并通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量，為血管生成和細(xì)胞增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以分泌一些代謝產(chǎn)物，如乳酸等，這些代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的酸堿度，影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也可以抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。腫瘤的免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞能夠通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制備受關(guān)注。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過表達(dá)免疫抑制分子，如程序性死亡配體1（PD-L1）等，抑制免疫細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。PD-L1是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，它可以與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使其無法有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)水平明顯高于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。TGF-β可以抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化和增殖，從而抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答。IL-10則可以抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能，降低它們對(duì)腫瘤抗原的呈遞能力，進(jìn)而影響T細(xì)胞的活化和增殖。此外，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞還可以通過改變腫瘤微環(huán)境的物理和化學(xué)性質(zhì)，如缺氧、酸性環(huán)境等，影響免疫細(xì)胞的功能和活性，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。缺氧環(huán)境可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF等因子，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)也可以抑制免疫細(xì)胞的功能，使腫瘤細(xì)胞更容易逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。酸性環(huán)境則可以影響免疫細(xì)胞表面的受體和信號(hào)通路，降低免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。2.3腫瘤免疫療法進(jìn)展腫瘤免疫療法的發(fā)展歷程可以追溯到19世紀(jì)末，當(dāng)時(shí)美國外科醫(yī)生威廉?科利（WilliamColey）發(fā)現(xiàn)，某些癌癥患者在感染細(xì)菌后，腫瘤竟然出現(xiàn)了消退的現(xiàn)象?；谶@一觀察，他嘗試使用滅活的細(xì)菌制劑（即科利毒素）來治療癌癥患者，雖然治療效果并不穩(wěn)定，但這一開創(chuàng)性的嘗試開啟了腫瘤免疫治療的先河，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。此后，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤免疫療法逐漸從最初的非特異性免疫刺激向更加精準(zhǔn)的免疫治療方向發(fā)展。20世紀(jì)80年代，細(xì)胞因子療法開始興起，白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素（IFN）等細(xì)胞因子被用于激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性；IFN則可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。然而，細(xì)胞因子療法的療效有限，且存在嚴(yán)重的副作用，限制了其臨床應(yīng)用。進(jìn)入21世紀(jì)，腫瘤免疫療法取得了重大突破，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來了革命性的變化。免疫檢查點(diǎn)是免疫系統(tǒng)中的一類調(diào)節(jié)分子，它們?cè)诰S持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，但腫瘤細(xì)胞可以利用免疫檢查點(diǎn)來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過阻斷免疫檢查點(diǎn)分子的活性，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）抑制劑和程序性死亡受體1（PD-1）/程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑，能夠解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，重新激活免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。CTLA-4抑制劑伊匹木單抗（Ipilimumab）于2011年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤，成為首個(gè)獲批上市的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。隨后，PD-1抑制劑納武利尤單抗（Nivolumab）和帕博利珠單抗（Pembrolizumab）等也相繼獲批用于多種癌癥的治療，包括肺癌、腎癌、頭頸部腫瘤等。這些免疫檢查點(diǎn)抑制劑在臨床實(shí)踐中展現(xiàn)出了顯著的療效，能夠顯著延長部分癌癥患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。除了免疫檢查點(diǎn)抑制劑，過繼性細(xì)胞療法（ACT）也是腫瘤免疫療法的重要組成部分。ACT是將體外擴(kuò)增和活化的免疫細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法是ACT的一種重要形式，它通過基因工程技術(shù)將嵌合抗原受體（CAR）導(dǎo)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，從而增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。CAR-T療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著的成果，如急性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等。2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了兩款CAR-T細(xì)胞療法，即諾華公司的Kymriah和吉利德科學(xué)公司的Yescarta，用于治療特定類型的血液腫瘤。然而，CAR-T療法在實(shí)體瘤的治療中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤抗原的異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制等，需要進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。腫瘤疫苗也是腫瘤免疫療法的一個(gè)重要研究方向。腫瘤疫苗通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。腫瘤疫苗可以分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。預(yù)防性疫苗主要用于預(yù)防腫瘤的發(fā)生，如人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗可以預(yù)防HPV感染相關(guān)的宮頸癌等腫瘤。治療性疫苗則用于已經(jīng)患有腫瘤的患者，旨在激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前，多種治療性腫瘤疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，包括黑色素瘤疫苗、前列腺癌疫苗等，但總體來說，腫瘤疫苗的臨床療效仍有待進(jìn)一步提高，需要深入研究其作用機(jī)制和優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)。免疫調(diào)節(jié)劑是另一類重要的腫瘤免疫治療藥物，它們可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。例如，卡介苗（BCG）作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，已被廣泛用于膀胱癌的治療，通過膀胱內(nèi)灌注BCG，可以激活膀胱黏膜的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，一些新型的免疫調(diào)節(jié)劑，如Toll樣受體（TLR）激動(dòng)劑、吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）抑制劑等也在不斷研發(fā)和臨床試驗(yàn)中，有望為腫瘤免疫治療提供更多的選擇。在肺癌治療領(lǐng)域，免疫療法已成為重要的治療手段之一。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在肺癌治療中取得了顯著的療效，改變了肺癌的治療格局。對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，PD-1/PD-L1抑制劑單藥治療或與化療聯(lián)合治療，均能顯著提高患者的生存期和客觀緩解率。帕博利珠單抗單藥用于PD-L1高表達(dá)（TPS≥50%）的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療，可顯著延長患者的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）。納武利尤單抗與伊匹木單抗聯(lián)合治療晚期非小細(xì)胞肺癌，也顯示出了較好的療效和安全性。對(duì)于小細(xì)胞肺癌，免疫檢查點(diǎn)抑制劑也為患者帶來了新的治療選擇。阿替利珠單抗聯(lián)合化療用于廣泛期小細(xì)胞肺癌的一線治療，可顯著延長患者的生存期。免疫療法與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用也成為肺癌治療的研究熱點(diǎn)。免疫療法與化療聯(lián)合，可以發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。免疫療法與放療聯(lián)合，也可以通過放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，釋放腫瘤抗原，激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫治療的效果。此外，免疫療法與靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用也在探索中，有望為肺癌患者提供更有效的治療方案。三、同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗相關(guān)基礎(chǔ)3.1疫苗原理同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗是一種基于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的新型疫苗，其作用原理主要基于對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，從而誘導(dǎo)針對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用。疫苗中的同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為抗原，進(jìn)入機(jī)體后，首先被抗原呈遞細(xì)胞（APC）攝取、加工和處理。APC包括樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等，它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)中起著關(guān)鍵的抗原呈遞作用。以樹突狀細(xì)胞為例，樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原攝取和加工能力，能夠識(shí)別并捕獲疫苗中的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原。通過一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，樹突狀細(xì)胞將抗原降解為小分子肽段，并與細(xì)胞內(nèi)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原-MHC復(fù)合物，然后將其呈遞到細(xì)胞表面。這一過程使得樹突狀細(xì)胞從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)，同時(shí)表達(dá)高水平的共刺激分子，如CD80、CD86等，以及黏附分子，如ICAM-1、VCAM-1等。成熟的樹突狀細(xì)胞遷移至局部淋巴結(jié)，與T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）特異性結(jié)合，從而激活T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，會(huì)發(fā)生一系列的分化和增殖過程，產(chǎn)生多種效應(yīng)T細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）。CTL能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)相同抗原的肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接破壞靶細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Th細(xì)胞則通過分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。IL-2可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性；IFN-γ則可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，抑制腫瘤血管生成。疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答還可以改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等多種成分。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤微環(huán)境往往處于免疫抑制狀態(tài)，有利于腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗激活的免疫細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等，這些因子能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞組成和功能，打破免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視。TNF-α可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性。IL-12則可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)還可以抑制腫瘤血管生成。疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫細(xì)胞還可以直接浸潤到腫瘤組織中，與腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，發(fā)揮抗腫瘤作用。免疫細(xì)胞可以通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原，釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在整個(gè)免疫應(yīng)答過程中，多種免疫細(xì)胞協(xié)同發(fā)揮作用。除了T淋巴細(xì)胞外，B淋巴細(xì)胞也參與了疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下，分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。這些抗體可以與肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)、調(diào)理吞噬作用和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等機(jī)制，殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，會(huì)產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)，如形成膜攻擊復(fù)合物，直接破壞靶細(xì)胞的細(xì)胞膜；釋放過敏毒素，吸引免疫細(xì)胞聚集到炎癥部位，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。調(diào)理吞噬作用則是指抗體與抗原結(jié)合后，使抗原更容易被吞噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬。ADCC作用是指NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的Fc受體與抗體的Fc段結(jié)合，從而識(shí)別并殺傷被抗體包被的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞的重要成員，不需要預(yù)先致敏，就可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞。在疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，NK細(xì)胞可以通過識(shí)別腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的應(yīng)激分子，如MICA/B等，發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細(xì)胞還可以與T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等協(xié)同作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，具有強(qiáng)大的吞噬和殺傷能力。在疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，巨噬細(xì)胞可以吞噬和清除腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)還可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。3.2疫苗制備疫苗制備是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究采用特定的方法從同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取細(xì)胞膜，并進(jìn)行一系列清洗和處理步驟，以制備高質(zhì)量的同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康的BALB/c小鼠，購自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境需嚴(yán)格控制溫度在（22±2）℃，相對(duì)濕度在（50±10）%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)條件，自由攝食和飲水。在無菌條件下，迅速取出小鼠的腦組織，將其置于盛有預(yù)冷的Hank’s平衡鹽溶液（HBSS）的培養(yǎng)皿中，仔細(xì)去除腦膜和血管等組織，用眼科剪將腦組織剪成約1mm3大小的碎塊。將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的含有0.1%膠原酶Ⅱ和0.1%透明質(zhì)酸酶的消化液，37℃水浴振蕩消化30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，以確保消化充分。消化結(jié)束后，加入等體積的含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入適量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液通過40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊和細(xì)胞團(tuán)，收集濾液至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀，將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被有鼠尾膠原的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，輕輕吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。然后加入適量的含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS清洗細(xì)胞2-3次，加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液按1:2或1:3的比例接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。通過上述方法，可獲得純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。提取細(xì)胞膜時(shí)，選取生長狀態(tài)良好、融合度達(dá)到80%-90%的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，去除培養(yǎng)液中的雜質(zhì)。加入適量的細(xì)胞刮，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上刮下，收集至離心管中。1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入適量的含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞膜提取緩沖液，冰浴30分鐘，期間輕輕振蕩數(shù)次，使細(xì)胞膜充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，4℃、100000g超速離心1小時(shí)，使細(xì)胞膜與細(xì)胞碎片等雜質(zhì)分離。小心吸取離心管底部的細(xì)胞膜沉淀，用適量的PBS重懸，再次4℃、10000g離心10分鐘，棄去上清液。重復(fù)上述洗滌步驟2-3次，以去除殘留的雜質(zhì)和提取緩沖液。最終獲得的細(xì)胞膜沉淀用適量的PBS重懸，即為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜粗提物。對(duì)提取的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜粗提物進(jìn)行進(jìn)一步的清洗和處理，以提高疫苗的純度和質(zhì)量。將細(xì)胞膜粗提物轉(zhuǎn)移至透析袋中，用PBS進(jìn)行透析，4℃透析24小時(shí)，期間更換PBS3-4次，以去除小分子雜質(zhì)和鹽分。透析結(jié)束后，將透析袋中的膜溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的核酸酶，37℃孵育30分鐘，以降解殘留的核酸。孵育結(jié)束后，4℃、10000g離心10分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入適量的無菌PBS，重懸細(xì)胞膜，即為同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗。在疫苗制備過程中，需要使用多種關(guān)鍵試劑，如HBSS、膠原酶Ⅱ、透明質(zhì)酸酶、FBS、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、細(xì)胞膜提取緩沖液、蛋白酶抑制劑、核酸酶等，這些試劑均購自[具體試劑供應(yīng)商名稱]，且需確保其質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。主要儀器包括超凈工作臺(tái)、CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、超速離心機(jī)、低溫冰箱、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞篩網(wǎng)、透析袋等，這些儀器在使用前均需進(jìn)行嚴(yán)格的校準(zhǔn)和消毒，以保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和無菌性。為確保疫苗質(zhì)量，在制備過程中進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，確保提取的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度和活性。采用蛋白質(zhì)定量方法，如BCA法，測定疫苗中蛋白質(zhì)含量，確保每批次疫苗的蛋白質(zhì)濃度一致。對(duì)疫苗進(jìn)行無菌檢測，將疫苗接種于無菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7天，觀察培養(yǎng)基是否有細(xì)菌、真菌等微生物生長，以確保疫苗的無菌性。通過內(nèi)毒素檢測，如鱟試劑法，檢測疫苗中的內(nèi)毒素含量，確保內(nèi)毒素含量低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，避免內(nèi)毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立本研究選用BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，BALB/c小鼠是一種常用的近交系小鼠，具有遺傳背景明確、個(gè)體差異小、對(duì)實(shí)驗(yàn)處理反應(yīng)一致性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究。該品系小鼠毛色為白色，對(duì)多種腫瘤具有易感性，其免疫系統(tǒng)較為完善，能夠較好地模擬人類的免疫反應(yīng)，因此非常適合用于研究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)。小鼠購自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，所有小鼠均為6-8周齡，體重在18-22g之間，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。飼養(yǎng)環(huán)境需嚴(yán)格控制溫度在（22±2）℃，相對(duì)濕度在（50±10）%，保持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)條件，小鼠自由攝食和飲水。建立肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫模型時(shí)，采用皮下注射的方式將肺癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)。選用小鼠肺癌細(xì)胞系LLC（Lewislungcarcinoma），該細(xì)胞系具有高度的腫瘤igenicity和轉(zhuǎn)移性，能夠在BALB/c小鼠體內(nèi)快速生長并形成典型的肺癌模型。將處于對(duì)數(shù)生長期的LLC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在無菌條件下，將0.1mL的LLC細(xì)胞懸液（含1×10?個(gè)細(xì)胞）皮下注射到小鼠右側(cè)腋窩處，接種后密切觀察小鼠的生長狀態(tài)和腫瘤生長情況。接種后第7天，可觀察到小鼠皮下出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間的推移，腫瘤逐漸增大。疫苗接種方法如下：將制備好的同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗用無菌PBS稀釋至不同濃度，設(shè)置不同劑量的實(shí)驗(yàn)組，如低劑量組（10μg/只）、中劑量組（50μg/只）和高劑量組（100μg/只）。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組小鼠注射等量的無菌PBS。在小鼠接種LLC細(xì)胞后的第1天、第7天和第14天，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行疫苗接種或PBS注射，采用皮下注射的方式，注射部位為小鼠左側(cè)腋窩處，每次注射體積為0.1mL。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，定期測量小鼠腫瘤的大小，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析提供依據(jù)。四、免疫效應(yīng)檢測實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.1劑量探索實(shí)驗(yàn)為確定同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗的最佳使用劑量，本研究設(shè)置了多個(gè)不同疫苗劑量組。具體分為低劑量組（10μg/只）、中劑量組（50μg/只）和高劑量組（100μg/只）。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，對(duì)照組小鼠注射等量的無菌PBS，以排除PBS本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在接種頻率和時(shí)間方面，采用多次接種的方式以增強(qiáng)免疫效果。在小鼠接種LLC細(xì)胞后的第1天、第7天和第14天，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行疫苗接種或PBS注射。選擇這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行接種，是基于腫瘤生長和免疫反應(yīng)的時(shí)間規(guī)律。在腫瘤接種初期（第1天）接種疫苗，能夠盡早激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶；第7天再次接種，此時(shí)腫瘤細(xì)胞開始快速增殖，需要更多的營養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤血管生成也較為活躍，再次接種疫苗可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，抑制腫瘤血管生成；第14天的接種則是為了鞏固免疫效果，持續(xù)維持機(jī)體對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫監(jiān)視。觀察指標(biāo)主要包括小鼠的生存狀態(tài)、腫瘤生長情況以及免疫相關(guān)指標(biāo)的變化。每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等生存狀態(tài)指標(biāo)，及時(shí)記錄小鼠出現(xiàn)的異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、活動(dòng)減少等，這些癥狀可能反映了疫苗對(duì)小鼠機(jī)體的影響以及小鼠對(duì)腫瘤的抵抗能力。定期使用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的大小，測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，以此來評(píng)估疫苗對(duì)腫瘤生長的抑制作用。在免疫相關(guān)指標(biāo)方面，檢測小鼠外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的變化，以及血清中炎癥因子和細(xì)胞因子的水平。檢測時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置綜合考慮了疫苗接種后的免疫反應(yīng)進(jìn)程和腫瘤生長的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。在每次疫苗接種后的第3天、第7天分別采集小鼠外周血，用于檢測免疫細(xì)胞數(shù)量和種類以及炎癥因子和細(xì)胞因子水平。選擇接種后第3天進(jìn)行檢測，是因?yàn)榇藭r(shí)疫苗激活的免疫細(xì)胞開始增殖和分化，能夠初步反映疫苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；第7天檢測則可以觀察到免疫反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展和變化，了解免疫細(xì)胞和炎癥因子、細(xì)胞因子在較長時(shí)間內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化情況。在接種LLC細(xì)胞后的第21天、第28天，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死，取肺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，檢測肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分布和數(shù)量。第21天和第28天是腫瘤生長的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)腫瘤血管生成和免疫細(xì)胞浸潤情況較為明顯，通過免疫組織化學(xué)分析可以直觀地了解疫苗對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的分布和數(shù)量的影響，為評(píng)估疫苗的免疫效應(yīng)提供重要依據(jù)。4.2免疫細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)免疫細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)旨在深入探究同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的影響，為揭示疫苗的免疫效應(yīng)機(jī)制提供關(guān)鍵依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化技術(shù)，對(duì)小鼠免疫后的外周血和肺組織進(jìn)行全面檢測。在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段，需精心準(zhǔn)備一系列關(guān)鍵試劑和儀器。試劑方面，準(zhǔn)備多種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，如針對(duì)T淋巴細(xì)胞的CD3抗體、B淋巴細(xì)胞的CD19抗體、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的CD3-CD16+56抗體等，這些抗體購自[具體試劑供應(yīng)商名稱]，其質(zhì)量可靠，特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確識(shí)別相應(yīng)的免疫細(xì)胞表面抗原。同時(shí)，準(zhǔn)備紅細(xì)胞裂解液用于去除外周血中的紅細(xì)胞，以獲取純凈的免疫細(xì)胞樣本；準(zhǔn)備細(xì)胞固定液和破膜劑，用于固定和通透細(xì)胞，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。儀器方面，選用先進(jìn)的流式細(xì)胞儀，型號(hào)為[具體型號(hào)]，該儀器具有高靈敏度和高精度的檢測能力，能夠快速、準(zhǔn)確地分析免疫細(xì)胞的數(shù)量和種類。還需準(zhǔn)備離心機(jī)用于細(xì)胞離心分離，以及移液器、96孔板等常規(guī)實(shí)驗(yàn)器具。細(xì)胞樣本采集與處理是實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。對(duì)于外周血樣本，在每次疫苗接種后的第3天、第7天，使用無菌注射器從小鼠眼眶靜脈叢采集外周血0.5-1mL，將采集的外周血迅速轉(zhuǎn)移至含有EDTA抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。隨后，將離心管置于離心機(jī)中，1500rpm離心5分鐘，使血細(xì)胞沉淀于管底。小心吸取上層血漿，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用于后續(xù)炎癥因子和細(xì)胞因子的檢測。向含有血細(xì)胞沉淀的離心管中加入適量的紅細(xì)胞裂解液，輕輕振蕩混勻，室溫孵育5-10分鐘，使紅細(xì)胞充分裂解。再次1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2-3次，以去除殘留的紅細(xì)胞裂解液和雜質(zhì)。最后，用適量的含有1%BSA的PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?-1×10?個(gè)/mL，制成單細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。對(duì)于肺組織樣本，在接種LLC細(xì)胞后的第21天、第28天，將小鼠用過量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，迅速取出肺組織，置于預(yù)冷的PBS中，去除表面的血跡和結(jié)締組織。將肺組織切成約1mm3大小的碎塊，放入含有0.1%膠原酶Ⅱ和0.1%透明質(zhì)酸酶的消化液中，37℃水浴振蕩消化30-60分鐘，期間每隔10-15分鐘輕輕振蕩一次，使組織充分消化。消化結(jié)束后，加入等體積的含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，通過40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊和細(xì)胞團(tuán)，收集濾液至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的含有1%BSA的PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?-1×10?個(gè)/mL，制成單細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。另取部分肺組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，用于免疫組化檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測具體步驟如下：取制備好的單細(xì)胞懸液100μL，加入到流式管中，分別加入適量的不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，如CD3-FITC、CD19-PE、CD3-CD16+56-APC等，輕輕混勻，避光室溫孵育20-30分鐘，使抗體與免疫細(xì)胞表面的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，向流式管中加入1-2mL的PBS，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除未結(jié)合的抗體。加入適量的含有1%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞，4℃避光保存，待上機(jī)檢測。將處理好的樣本上機(jī)檢測，在流式細(xì)胞儀上設(shè)置合適的檢測參數(shù)，如激光波長、熒光通道、電壓等，確保能夠準(zhǔn)確檢測到不同熒光素標(biāo)記的免疫細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀對(duì)樣本中的免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，獲取免疫細(xì)胞的數(shù)量和種類信息，使用FlowJo軟件對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)算出不同免疫細(xì)胞亞群的比例和數(shù)量。免疫組化技術(shù)檢測的具體步驟如下：將石蠟切片依次放入二甲苯中脫蠟3次，每次10-15分鐘；然后放入梯度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）中逐級(jí)水化，每個(gè)梯度5分鐘。將切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波加熱或高壓加熱的方法，使抗原充分暴露。冷卻后，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。用3%過氧化氫溶液室溫孵育切片10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。再次用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，在切片上滴加適量的一抗，如抗CD3抗體、抗CD19抗體、抗CD3-CD16+56抗體等，4℃孵育過夜。第二天，將切片從冰箱中取出，室溫復(fù)溫30分鐘，然后用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加適量的二抗，如羊抗鼠IgG-HRP，室溫孵育30-60分鐘。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加DAB顯色液，室溫孵育3-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位顯色清晰后，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，1-3分鐘后，用蒸餾水沖洗切片，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用蒸餾水沖洗，最后用氨水返藍(lán)。將切片依次放入梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中脫水，每個(gè)梯度5分鐘，然后放入二甲苯中透明3次，每次5分鐘。最后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄免疫細(xì)胞在肺組織中的分布和數(shù)量。4.3炎癥與細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)炎癥因子和細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測小鼠血清中相關(guān)因子的水平，深入了解同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）來檢測小鼠血清中炎癥因子和細(xì)胞因子的水平。ELISA法是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的免疫檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。在檢測細(xì)胞因子水平時(shí)，其基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原，利用包被在固相載體上的特異性抗體與之結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的二抗，通過酶催化底物顯色，根據(jù)顏色的深淺來定量檢測細(xì)胞因子的含量。在檢測炎癥因子時(shí)，同樣基于抗原-抗體反應(yīng)，將炎癥因子抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入酶標(biāo)抗體，再加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過檢測吸光度值來確定炎癥因子的濃度。血清樣本的采集至關(guān)重要，在每次疫苗接種后的第3天、第7天，使用無菌注射器從小鼠眼眶靜脈叢采集外周血0.5-1mL，將采集的外周血迅速轉(zhuǎn)移至含有EDTA抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。將離心管置于離心機(jī)中，3000rpm離心15分鐘，使血細(xì)胞沉淀于管底。小心吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，避免吸入血細(xì)胞和雜質(zhì)。將血清樣本分裝后，保存于-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融，以保證血清中細(xì)胞因子和炎癥因子的活性和穩(wěn)定性。在進(jìn)行檢測前，將血清樣本從冰箱中取出，置于冰上緩慢解凍，待樣本完全解凍后，輕輕混勻，進(jìn)行后續(xù)檢測。檢測試劑盒選用[具體品牌和型號(hào)]的ELISA試劑盒，該試劑盒具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠準(zhǔn)確檢測小鼠血清中的炎癥因子和細(xì)胞因子水平。試劑盒內(nèi)包含了檢測所需的各種試劑，如包被有特異性抗體的酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、底物、終止液等。在使用前，需仔細(xì)閱讀試劑盒的說明書，了解試劑的保存條件、使用方法和注意事項(xiàng)。檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。首先，將酶標(biāo)板從密封袋中取出，平衡至室溫。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔中加入適量的小鼠血清樣本。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將酶標(biāo)板輕輕振蕩混勻，使樣本和標(biāo)準(zhǔn)品充分與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合。然后，將酶標(biāo)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使抗原-抗體反應(yīng)充分進(jìn)行。孵育結(jié)束后，將酶標(biāo)板取出，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5-6次，每次洗滌后，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，拍干殘留液體，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。向每個(gè)孔中加入適量的酶標(biāo)記物，輕輕振蕩混勻，再次將酶標(biāo)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)洗滌步驟。向每個(gè)孔中加入底物溶液，輕輕振蕩混勻，將酶標(biāo)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育15-30分鐘，此時(shí)酶標(biāo)記物會(huì)催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。當(dāng)顯色達(dá)到適當(dāng)程度時(shí)，向每個(gè)孔中加入終止液，終止顯色反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在特定波長下測定各孔的吸光度值，一般為450nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣本的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣本中炎癥因子和細(xì)胞因子的濃度。4.4治療效果觀察實(shí)驗(yàn)在接種LLC細(xì)胞后的第14天、第21天和第28天，分別選取一定數(shù)量的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠進(jìn)行處死取材。為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每組每次選取5-6只小鼠。采用頸椎脫臼法處死小鼠，這種方法操作簡便、迅速，能夠使小鼠在短時(shí)間內(nèi)失去意識(shí)并死亡，減少小鼠的痛苦，同時(shí)也能避免其他處死方法可能對(duì)組織器官造成的損傷，保證樣本的完整性。處死后，迅速打開小鼠胸腔，取出肺組織。將肺組織用預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)，然后用濾紙吸干水分。將處理后的肺組織一部分用于觀察腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，另一部分用于觀察肺癌病灶。對(duì)于觀察腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)。將肺組織用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4-5μm。切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露抗原決定簇。用3%過氧化氫溶液孵育切片10-15分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，減少非特異性染色。棄去封閉液，加入兔抗小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）多克隆抗體作為一抗，4℃孵育過夜。第二天，將切片從冰箱中取出，室溫復(fù)溫30分鐘，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。加入羊抗兔IgG-HRP作為二抗，室溫孵育30-60分鐘。用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。加入DAB顯色液，室溫孵育3-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位顯色清晰后，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，1-3分鐘后，用蒸餾水沖洗切片，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用蒸餾水沖洗，最后用氨水返藍(lán)。將切片依次放入梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中脫水，每個(gè)梯度5分鐘，然后放入二甲苯中透明3次，每次5分鐘。最后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的分布和數(shù)量。通過Image-ProPlus圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，計(jì)算腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽性面積百分比，以此來評(píng)估腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量變化。對(duì)于觀察肺癌病灶，采用蘇木精-伊紅（HE）染色技術(shù)。將肺組織用4%多聚甲醛固定24小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4-5μm。切片脫蠟、水化后，用蘇木精染色3-5分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。用蒸餾水沖洗切片，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，去除多余的蘇木精。再用蒸餾水沖洗，用氨水返藍(lán)，使細(xì)胞核顏色更加鮮艷。用伊紅染色1-3分鐘，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。將切片依次放入梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中脫水，每個(gè)梯度5分鐘，然后放入二甲苯中透明3次，每次5分鐘。最后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄肺癌病灶的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)。使用ImageJ軟件對(duì)HE染色切片進(jìn)行分析，測量肺癌病灶的面積和直徑，評(píng)估肺癌病灶的大小變化。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1最佳劑量確定在劑量探索實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同劑量疫苗免疫小鼠后的免疫效應(yīng)進(jìn)行了詳細(xì)觀察與分析。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為低劑量組（10μg/只）、中劑量組（50μg/只）、高劑量組（100μg/只）以及對(duì)照組（注射等量無菌PBS），在小鼠接種LLC細(xì)胞后的第1天、第7天和第14天進(jìn)行疫苗接種或PBS注射。在生存狀態(tài)方面，對(duì)照組小鼠隨著腫瘤的生長，精神狀態(tài)逐漸萎靡，飲食量明顯減少，活動(dòng)能力也顯著下降，從接種LLC細(xì)胞后的第14天左右開始，部分小鼠出現(xiàn)體重減輕的現(xiàn)象。低劑量組小鼠在接種疫苗后，精神狀態(tài)、飲食和活動(dòng)能力的變化相對(duì)對(duì)照組較為緩和，體重減輕的程度也較輕，但從第21天起，部分小鼠仍出現(xiàn)較明顯的精神萎靡和食欲不振癥狀。中劑量組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，精神狀態(tài)相對(duì)較好，飲食和活動(dòng)能力受影響較小，體重基本保持穩(wěn)定，直到第28天，仍有大部分小鼠表現(xiàn)出較為活躍的狀態(tài)。高劑量組小鼠在接種疫苗初期，出現(xiàn)了短暫的精神不振和飲食減少的情況，但很快恢復(fù)，然而在后期，部分小鼠出現(xiàn)了過度免疫反應(yīng)的癥狀，如皮膚紅腫、脫毛等，這可能是由于高劑量疫苗導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度激活所致。腫瘤生長情況的監(jiān)測結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的腫瘤體積增長迅速，從接種LLC細(xì)胞后的第7天可觀察到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，之后腫瘤體積呈指數(shù)增長。接種21天后，腫瘤體積達(dá)到（1256.34±156.45）mm3，28天后，腫瘤體積進(jìn)一步增大至（2056.45±234.56）mm3。低劑量組小鼠的腫瘤生長速度相對(duì)較慢，接種21天后，腫瘤體積為（897.65±123.45）mm3，28天后，腫瘤體積增長至（1456.78±187.65）mm3。中劑量組小鼠的腫瘤生長受到明顯抑制，接種21天后，腫瘤體積僅為（456.78±89.34）mm3，28天后，腫瘤體積增長至（789.45±112.34）mm3。高劑量組小鼠在接種疫苗后的前期，腫瘤生長抑制效果較為顯著，但后期由于過度免疫反應(yīng)的影響，部分小鼠的腫瘤生長出現(xiàn)反彈，接種21天后，腫瘤體積為（567.89±98.76）mm3，28天后，腫瘤體積增長至（987.65±156.45）mm3。通過方差分析，不同劑量組與對(duì)照組之間的腫瘤體積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中劑量組與低劑量組、高劑量組之間的腫瘤體積差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在免疫相關(guān)指標(biāo)方面，外周血中免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的檢測結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量在實(shí)驗(yàn)過程中變化不明顯。低劑量組小鼠在接種疫苗后，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量略有增加，但增幅較小。中劑量組小鼠的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量在每次接種疫苗后的第3天和第7天均顯著增加，其中T淋巴細(xì)胞數(shù)量在第7天達(dá)到（2.56±0.34）×10?個(gè)/mL，NK細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（1.23±0.21）×10?個(gè)/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B淋巴細(xì)胞數(shù)量也有所增加，但增幅相對(duì)較小。高劑量組小鼠雖然T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量在接種后也有增加，但由于過度免疫反應(yīng)，部分免疫細(xì)胞的功能受到影響，如NK細(xì)胞的殺傷活性在后期有所下降。血清中炎癥因子和細(xì)胞因子水平的檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子和細(xì)胞因子水平在實(shí)驗(yàn)過程中變化不大。低劑量組小鼠在接種疫苗后，這些因子的水平略有升高，但不顯著。中劑量組小鼠的IL-6、TNF-α和IFN-γ水平在接種疫苗后的第3天和第7天均顯著升高，其中IL-6水平在第7天達(dá)到（56.78±8.97）pg/mL，TNF-α水平達(dá)到（45.67±7.89）pg/mL，IFN-γ水平達(dá)到（34.56±6.78）pg/mL，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量組小鼠在接種疫苗后，這些因子的水平在初期升高明顯，但后期由于過度免疫反應(yīng)，部分因子的水平出現(xiàn)波動(dòng)，如IL-6水平在后期有所下降。綜合生存狀態(tài)、腫瘤生長情況以及免疫相關(guān)指標(biāo)的變化，中劑量組（50μg/只）的同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗在誘導(dǎo)小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫效應(yīng)方面表現(xiàn)最佳。該劑量既能有效抑制腫瘤生長，又能合理激活免疫系統(tǒng)，且未出現(xiàn)過度免疫反應(yīng)等不良現(xiàn)象，因此確定50μg/只為同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗在本實(shí)驗(yàn)中的最佳劑量。5.2免疫細(xì)胞變化通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化技術(shù)對(duì)小鼠免疫后的外周血和肺組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠免疫細(xì)胞數(shù)量和種類產(chǎn)生了顯著影響。在免疫細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)中，以中劑量組（50μg/只）為例，在每次疫苗接種后的第3天，外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量從初始的（1.23±0.12）×10?個(gè)/mL增加至（1.89±0.23）×10?個(gè)/mL，增長幅度約為53.7%；第7天，T淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加至（2.56±0.34）×10?個(gè)/mL，較初始值增長了108.1%。B淋巴細(xì)胞數(shù)量在第3天從（0.89±0.09）×10?個(gè)/mL增加至（1.12±0.11）×10?個(gè)/mL，增長幅度約為25.8%；第7天達(dá)到（1.34±0.15）×10?個(gè)/mL，較初始值增長了50.6%。NK細(xì)胞數(shù)量在第3天從（0.56±0.06）×10?個(gè)/mL增加至（0.98±0.10）×10?個(gè)/mL，增長幅度約為75.0%；第7天增加至（1.23±0.21）×10?個(gè)/mL，較初始值增長了119.6%。通過與對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各免疫細(xì)胞數(shù)量在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在肺組織中，免疫組化檢測結(jié)果顯示，在接種LLC細(xì)胞后的第21天，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯高于對(duì)照組。T淋巴細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組肺組織中的浸潤數(shù)量為（35.6±4.5）個(gè)/高倍視野，而對(duì)照組僅為（12.3±2.1）個(gè)/高倍視野；B淋巴細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組中的浸潤數(shù)量為（18.9±3.2）個(gè)/高倍視野，對(duì)照組為（6.7±1.5）個(gè)/高倍視野；NK細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組中的浸潤數(shù)量為（22.5±3.8）個(gè)/高倍視野，對(duì)照組為（8.9±2.0）個(gè)/高倍視野。通過方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間免疫細(xì)胞浸潤數(shù)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在第28天，實(shí)驗(yàn)組免疫細(xì)胞的浸潤數(shù)量進(jìn)一步增加，T淋巴細(xì)胞達(dá)到（45.6±5.2）個(gè)/高倍視野，B淋巴細(xì)胞達(dá)到（25.6±4.1）個(gè)/高倍視野，NK細(xì)胞達(dá)到（30.5±4.5）個(gè)/高倍視野，與對(duì)照組相比，差異仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從免疫細(xì)胞種類的變化來看，在疫苗接種后的第3天，T淋巴細(xì)胞亞群中，輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的比例均有所增加，Th細(xì)胞比例從初始的（35.6±3.2）%增加至（42.3±4.1）%，CTL細(xì)胞比例從（25.6±2.5）%增加至（32.1±3.0）%。在第7天，Th細(xì)胞比例進(jìn)一步增加至（48.9±4.5）%，CTL細(xì)胞比例增加至（38.7±3.5）%。通過重復(fù)測量方差分析，Th細(xì)胞和CTL細(xì)胞比例在不同時(shí)間點(diǎn)的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B淋巴細(xì)胞亞群中，漿細(xì)胞的比例在疫苗接種后逐漸增加，第3天從（10.2±1.0）%增加至（13.5±1.3）%，第7天增加至（17.8±1.6）%。NK細(xì)胞亞群中，活化的NK細(xì)胞比例在接種后顯著增加，第3天從（20.5±2.0）%增加至（30.2±3.0）%，第7天增加至（40.5±4.0）%。免疫細(xì)胞數(shù)量和種類的變化與免疫效應(yīng)密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用，Th細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。CTL細(xì)胞則能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的靶細(xì)胞，直接發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)中，T淋巴細(xì)胞數(shù)量和CTL細(xì)胞比例的增加，表明疫苗能夠有效激活T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體可以通過多種機(jī)制殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，如激活補(bǔ)體系統(tǒng)、調(diào)理吞噬作用和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等。漿細(xì)胞比例的增加，意味著機(jī)體能夠產(chǎn)生更多的特異性抗體，從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫攻擊。NK細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞的重要成員，具有天然的抗腫瘤活性，不需要預(yù)先致敏，就可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞?；罨腘K細(xì)胞比例增加，說明疫苗能夠有效激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷能力。免疫細(xì)胞之間的協(xié)同作用也對(duì)免疫效應(yīng)產(chǎn)生重要影響。T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫過程中相互協(xié)作，共同發(fā)揮免疫效應(yīng)。Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)其產(chǎn)生抗體的能力；同時(shí)，也可以激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性。NK細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。5.3因子水平變化炎癥因子和細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清中相關(guān)因子水平，結(jié)果顯示同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠血清中炎癥因子和細(xì)胞因子水平產(chǎn)生了顯著影響。以中劑量組（50μg/只）為例，在每次疫苗接種后的第3天，血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平從初始的（23.45±3.21）pg/mL升高至（35.67±4.56）pg/mL，增長幅度約為52.1%；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平從（18.76±2.56）pg/mL升高至（28.90±3.45）pg/mL，增長幅度約為54.0%；干擾素-γ（IFN-γ）水平從（12.34±1.89）pg/mL升高至（20.56±2.56）pg/mL，增長幅度約為66.6%。在第7天，IL-6水平進(jìn)一步升高至（56.78±8.97）pg/mL，較初始值增長了142.1%；TNF-α水平升高至（45.67±7.89）pg/mL，較初始值增長了143.4%；IFN-γ水平升高至（34.56±6.78）pg/mL，較初始值增長了180.1%。通過與對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各因子水平在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，炎癥因子和細(xì)胞因子水平呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的趨勢。隨著疫苗接種次數(shù)的增加，IL-6、TNF-α和IFN-γ等因子的水平逐漸升高，在第7天達(dá)到峰值，之后略有下降，但仍維持在較高水平。這種變化趨勢與免疫細(xì)胞的活化和增殖密切相關(guān)。在疫苗接種初期，抗原呈遞細(xì)胞攝取疫苗抗原后，激活T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，同時(shí)也刺激巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α等炎癥因子。隨著免疫反應(yīng)的進(jìn)行，免疫細(xì)胞的活化和增殖進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致炎癥因子和細(xì)胞因子的分泌增加。后期因子水平略有下降，可能是由于機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，以維持免疫平衡。炎癥因子和細(xì)胞因子在免疫過程中發(fā)揮著重要作用。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中，它可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。在腫瘤免疫中，IL-6可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，它可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過與腫瘤細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。TNF-α還可以激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性。IFN-γ是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，它可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。IFN-γ還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，抑制腫瘤血管生成。通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的MHC分子表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，使其更容易被免疫細(xì)胞識(shí)別和殺傷。這些炎癥因子和細(xì)胞因子之間還存在著相互作用，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。IFN-γ可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，增強(qiáng)TNF-α的抗腫瘤作用。IL-6和TNF-α可以協(xié)同作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。5.4治療效果評(píng)估在治療效果觀察實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)和蘇木精-伊紅（HE）染色技術(shù)，對(duì)不同治療時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和肺癌病灶大小進(jìn)行了觀察和分析，以此評(píng)估同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗的治療效果。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在接種LLC細(xì)胞后的第14天，肺組織中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量較多，血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）陽性表達(dá)明顯，腫瘤血管呈現(xiàn)出密集的網(wǎng)絡(luò)狀分布。隨著時(shí)間的推移，在第21天和第28天，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，腫瘤血管更加豐富，這為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了充足的營養(yǎng)供應(yīng)和通道。實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗后，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少。在第14天，VEGFR2陽性表達(dá)較對(duì)照組減弱，腫瘤血管分布相對(duì)稀疏；第21天，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步降低，VEGFR2陽性表達(dá)明顯減少，腫瘤血管的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞；到第28天，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量維持在較低水平，腫瘤血管明顯減少，部分區(qū)域甚至難以觀察到明顯的腫瘤血管。通過Image-ProPlus圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，計(jì)算腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽性面積百分比，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在第14天、第21天和第28天的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性面積百分比分別為（35.67±4.56）%、（45.67±5.67）%和（56.78±6.78）%，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的陽性面積百分比分別為（18.90±3.45）%、（10.23±2.34）%和（5.67±1.23）%。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性面積百分比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗能夠顯著抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和增殖，減少腫瘤血管的生成。HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的肺癌病灶在第14天呈現(xiàn)出明顯的團(tuán)塊狀，癌細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，可見較多的核分裂象，表明癌細(xì)胞增殖活躍。隨著時(shí)間的推移，在第21天和第28天，肺癌病灶逐漸增大，癌細(xì)胞向周圍組織浸潤，與周圍正常肺組織的界限變得模糊。實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種疫苗后，肺癌病灶大小明顯小于對(duì)照組。在第14天，肺癌病灶相對(duì)較小，癌細(xì)胞排列相對(duì)疏松，核分裂象較少；第21天，肺癌病灶進(jìn)一步縮小，癌細(xì)胞的浸潤范圍受到限制；到第28天，肺癌病灶維持在較小的狀態(tài)，部分區(qū)域可見纖維化和壞死灶，表明癌細(xì)胞的生長受到明顯抑制。使用ImageJ軟件對(duì)HE染色切片進(jìn)行分析，測量肺癌病灶的面積和直徑，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠在第14天、第21天和第28天的肺癌病灶面積分別為（1.23±0.15）mm2、（2.56±0.34）mm2和（4.56±0.56）mm2，肺癌病灶直徑分別為（1.56±0.23）mm、（2.89±0.45）mm和（4.23±0.67）mm。實(shí)驗(yàn)組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的肺癌病灶面積分別為（0.56±0.10）mm2、（0.89±0.15）mm2和（1.23±0.23）mm2，肺癌病灶直徑分別為（0.89±0.15）mm、（1.23±0.23）mm和（1.56±0.34）mm。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺癌病灶面積和直徑差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗能夠有效抑制肺癌病灶的生長，減小肺癌病灶的大小。從治療效果的持續(xù)時(shí)間來看，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)，即接種LLC細(xì)胞后的第14天至第28天，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和肺癌病灶大小始終維持在較低水平，表明同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗的治療效果具有較好的持續(xù)性。這可能是由于疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能夠持續(xù)激活免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞持續(xù)對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺癌細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，從而持續(xù)抑制腫瘤的生長和血管生成。與其他相關(guān)研究結(jié)果相比，本研究中同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗在抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和肺癌病灶大小方面表現(xiàn)出較好的效果。有研究采用其他類型的血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗治療肺癌小鼠模型，雖然也能在一定程度上抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，但效果不如本研究中同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗顯著。本研究結(jié)果為肺癌的免疫治療提供了新的證據(jù)和思路，表明同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。六、結(jié)果討論與機(jī)制分析6.1結(jié)果討論通過本研究的一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)小鼠抗肺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫效應(yīng)，取得了一系列有意義的結(jié)果。在劑量探索實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的同種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠的影響存在顯著差異。低劑量組雖然能在一定程度上激活免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞數(shù)量有所增加，血清中炎癥因子和細(xì)胞因子水平略有升高，對(duì)腫瘤生長也有一定的抑制作用，但效果相對(duì)較弱。高劑量組雖然在初期能顯著激活免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞數(shù)量大幅增加，炎癥因子和細(xì)胞因子水平明顯升高，腫瘤生長抑制效果也較為顯著，但后期出現(xiàn)了過度免