產(chǎn)氣莢膜梭菌plc和NetB基因重組植物乳酸桿菌的構(gòu)建與免疫保護(hù)效能探究一、引言1.1研究背景產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）是一種革蘭氏陽性、厭氧或微需氧的芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，如土壤、污水、人和動物的腸道等環(huán)境，也是人和動物腸道中的常在菌之一。該菌能產(chǎn)生多種強(qiáng)大的侵襲力的毒素和酶，其中包括4種主要的外毒素：α-毒素（磷酸酯酶C，具有壞死、溶血和致死功能）、β-毒素（一種神經(jīng)毒素，主要作用于腸道的運(yùn)動神經(jīng)，有壞死功能）、ε-毒素（有壞死和致死功能）和ι-毒素（有致死和壞死功能），以及θ-毒素（對熱不穩(wěn)定的溶血素，可以破壞白細(xì)胞，對心肌有毒性）、λ-毒素（蛋白酶）、κ-毒素（膠原酶，可以分解膠原組織）、μ-毒素（透明質(zhì)酸酶）、神經(jīng)氨酸酶和γ-毒素等次要毒素和酶。這些毒素和酶共同作用，可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，包括氣性壞疽、食物中毒、壞死性腸炎等，對人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的威脅和經(jīng)濟(jì)損失。在家禽養(yǎng)殖中，產(chǎn)氣莢膜梭菌可嚴(yán)重破壞雞群腸道健康，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，料肉比升高，雞群抗病力低下，死淘率急劇攀升，急性感染時甚至可導(dǎo)致雞群大批死亡。當(dāng)雞群產(chǎn)氣莢膜梭菌高發(fā)引發(fā)相關(guān)性肝病時，其生產(chǎn)性能可能降低23-43%，這在蛋雞和種雞中表現(xiàn)得尤為明顯。在養(yǎng)豬業(yè)中，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染可引發(fā)仔豬紅痢、母豬脹氣等疾病。感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的仔豬通常表現(xiàn)出急性型癥狀，可能無發(fā)病征兆而突然死亡；慢性型病例病程一般持續(xù)約2d，病豬排帶血的水樣稀糞，內(nèi)含灰色的壞死組織，迅速脫水、虛弱、消瘦，體溫快速下降，最終衰竭死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌也是造成豬脹氣的罪魁禍?zhǔn)?，不僅會造成死胎增多，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致豬死亡。在養(yǎng)牛業(yè)方面，近年來產(chǎn)氣莢膜梭菌對中國養(yǎng)牛業(yè)的危害巨大，其流行型別和致病特點(diǎn)較以往也在發(fā)生變化，其中C、D型菌對牛致病增多，部分病例呈現(xiàn)慢性型發(fā)病癥狀，嚴(yán)重影響牛的生長發(fā)育和養(yǎng)殖效益?？偟膩碚f，產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起鳥類、家畜等動物的腸道疾病，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，應(yīng)對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的傳統(tǒng)方法主要包括使用抗生素和某些化學(xué)藥品。在飼料中添加抗生素曾是控制牲畜中產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的常用手段，但隨著時間的推移，這些方法的弊端日益凸顯。長期或不合理使用抗生素，會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，使抗生素的治療效果逐漸降低，甚至出現(xiàn)無藥可用的局面；抗生素的殘留問題也對食品安全和人類健康構(gòu)成潛在威脅，還可能破壞畜禽腸道內(nèi)的微生物平衡，導(dǎo)致畜禽免疫力下降，增加其他疾病的感染風(fēng)險；而某些化學(xué)藥品則可能具有毒性，在使用過程中對畜禽和環(huán)境造成不良影響。因此，尋找安全、有效的新型防治方法迫在眉睫。乳酸菌是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧或微需氧、桿狀、無芽孢的細(xì)菌，是在人類和動物的食物和腸道中發(fā)現(xiàn)的最常見的益生菌。乳酸菌作為一種親生物菌，能夠在宿主腸道內(nèi)良好生存，具有諸多對宿主有益的作用。乳酸菌可以通過自身的代謝活動，降低腸道pH值，營造酸性環(huán)境，這種酸性環(huán)境不利于有害菌的生長繁殖，從而維持腸道微生態(tài)平衡；乳酸菌還能對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，幫助宿主抵抗病原菌的入侵?；谌樗峋倪@些特性，將其作為載體來構(gòu)建重組菌，為防治產(chǎn)氣莢膜梭菌感染提供了新的思路和研究方向。通過基因工程技術(shù)，在乳酸菌中重組產(chǎn)氣莢膜梭菌的相關(guān)基因，如plc和NetB基因，使乳酸菌能夠表達(dá)具有免疫原性的蛋白，有望刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和控制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的目的。1.2研究目的與意義本研究旨在利用重組植物乳酸桿菌來控制產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染，并探究其免疫保護(hù)功能。通過將產(chǎn)氣莢膜梭菌的plc和NetB基因引入植物乳酸桿菌，構(gòu)建重組菌株，期望該重組菌株能夠表達(dá)具有免疫原性的蛋白，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，有效預(yù)防和控制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。本研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。從理論層面來看，深入研究重組植物乳酸桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的免疫保護(hù)機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示乳酸菌與病原菌之間的相互作用關(guān)系，豐富微生物免疫學(xué)和分子生物學(xué)的理論知識，為開發(fā)新型的微生物制劑提供理論基礎(chǔ)。在實際應(yīng)用方面，本研究成果有望開發(fā)出一種新型的產(chǎn)氣莢膜梭菌防治藥物。與傳統(tǒng)的抗生素和化學(xué)藥品相比，利用重組植物乳酸桿菌制備的防治藥物具有顯著優(yōu)勢。乳酸菌本身無毒性，安全性高，不會對人體和動物造成不良影響，也不會在動物產(chǎn)品中殘留，符合食品安全和綠色養(yǎng)殖的要求；這種新型藥物能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)來防治產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，避免了因長期使用抗生素導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問題，為畜禽養(yǎng)殖業(yè)提供了一種可持續(xù)的、環(huán)境友好的防治策略，具有重要的臨床應(yīng)用前景。通過有效控制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，可減少畜禽疾病的發(fā)生，提高養(yǎng)殖效益，促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了諸多成果。國外對產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)制研究較為深入，明確了其產(chǎn)生的多種毒素在致病過程中的關(guān)鍵作用。例如，對α-毒素（plc基因編碼的磷酸酯酶C）的研究發(fā)現(xiàn)，它能夠通過水解細(xì)胞膜上的磷脂，破壞細(xì)胞的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壞死和組織損傷，這在氣性壞疽等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。對于NetB毒素，研究表明其主要影響禽類，能破壞腸道上皮細(xì)胞的緊密連接，增加腸道通透性，使病原菌更容易侵入機(jī)體，引發(fā)壞死性腸炎等疾病，嚴(yán)重影響家禽的生長性能和健康。在國內(nèi)，對產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究也在不斷深入，尤其是在其流行病學(xué)調(diào)查方面取得了顯著進(jìn)展。通過大量的調(diào)查研究，明確了產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同地區(qū)、不同畜禽群體中的感染情況和流行特點(diǎn)，為制定針對性的防控措施提供了重要依據(jù)。有研究對某地區(qū)規(guī)?；i場產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)仔豬紅痢的發(fā)病率與產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染密切相關(guān)，且不同血清型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在豬場中的分布存在差異。在植物乳酸桿菌的研究方面，國外對其作為益生菌的特性和功能研究較為全面。植物乳酸桿菌能夠在腸道內(nèi)定殖，通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等物質(zhì)抑制有害菌的生長，維持腸道微生態(tài)平衡；它還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對病原菌的抵抗力。在利用植物乳酸桿菌作為基因工程載體方面，國外已開展了一些相關(guān)研究，嘗試將不同的抗原基因?qū)胫参锶樗釛U菌中，構(gòu)建重組菌株，用于開發(fā)新型疫苗和生物制劑。國內(nèi)對植物乳酸桿菌的研究也逐漸增多，不僅關(guān)注其在食品發(fā)酵和生物保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用，還深入研究其在動物養(yǎng)殖中的益生作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加植物乳酸桿菌能夠提高畜禽的生長性能和飼料利用率，降低腹瀉率，改善腸道健康。在基因工程應(yīng)用方面，國內(nèi)也在積極探索利用植物乳酸桿菌表達(dá)外源基因，為開發(fā)新型的畜禽疫病防控產(chǎn)品提供了新的途徑。在產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)基因重組植物乳酸桿菌的研究方面，國內(nèi)外均有一定的探索。國外有研究成功構(gòu)建了表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌多種毒素的重組乳酸菌，并對其免疫效果進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，重組乳酸菌能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，對產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染具有一定的保護(hù)作用。在國內(nèi)，也有學(xué)者開展了類似的研究，如構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB毒素基因的重組植物乳酸桿菌，并通過動物實驗驗證了其對雞產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的免疫保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)重組植物乳酸桿菌能夠顯著提高雞的抗體水平和免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)雞對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抵抗力。盡管目前在產(chǎn)氣莢膜梭菌、植物乳酸桿菌以及相關(guān)基因重組研究方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。現(xiàn)有研究對于重組植物乳酸桿菌表達(dá)的plc和NetB基因產(chǎn)物的免疫原性和免疫保護(hù)機(jī)制的研究還不夠深入，對于如何進(jìn)一步提高重組菌株的表達(dá)效率和穩(wěn)定性，以及如何優(yōu)化免疫程序以增強(qiáng)免疫效果等方面，還需要進(jìn)一步的研究和探索。此外，目前的研究主要集中在實驗室階段，對于重組植物乳酸桿菌在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果和安全性評估還相對較少，距離實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還有一定的距離。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1產(chǎn)氣莢膜梭菌概述2.1.1生物學(xué)特性產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性粗大桿菌，菌體兩端鈍圓，大小約為(1-1.5)μm×(3-9)μm，常單獨(dú)或成雙排列，有時也可形成短鏈狀。在人和動物活體組織內(nèi)或含血清的培養(yǎng)基中生長時，部分菌株可形成莢膜，無鞭毛，不能運(yùn)動。芽孢呈卵圓形，位于菌體中央或近端，芽孢寬度不比菌體大，在一般培養(yǎng)條件下芽孢形成較為困難，需在無糖培養(yǎng)基中才易生成芽孢。該菌雖屬厭氧性細(xì)菌，但對厭氧程度的要求并不十分嚴(yán)格，甚至在氧化還原電位（EH）為200-250mv的環(huán)境內(nèi)也能生長。在普通培養(yǎng)基上即可生長，若添加葡萄糖、血液等成分，則生長更為良好。其生長適宜溫度為37-47℃，多數(shù)研究認(rèn)為43-47℃為最適生長溫度。產(chǎn)氣莢膜梭菌生長和繁殖速度極快，在適宜條件下增代時間僅8min，利用這一特性，可采用高溫快速培養(yǎng)法對其進(jìn)行選擇分離，如在45℃下，每培養(yǎng)3-4小時傳種1次，便較易獲得純培養(yǎng)。在不同培養(yǎng)基上，產(chǎn)氣莢膜梭菌呈現(xiàn)出不同的生長特性和菌落形態(tài)。在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時即可見到生長，并產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵?，但不被消化；在普通瓊脂平板上培養(yǎng)15小時左右可見到菌落，培養(yǎng)24小時后，菌落直徑可達(dá)2-4mm，呈圓形、凸起、光滑、半透明、邊緣整齊，無遷徙生長現(xiàn)象；在血平板上，多數(shù)菌株會形成雙層溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)完全溶血，是由于θ毒素的作用，外環(huán)不完全溶血則是由α毒素所致；在牛奶培養(yǎng)基中，能分解乳糖產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時產(chǎn)生大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成蜂窩狀，并將液面上的凡士林層向上推擠，甚至沖開管口棉塞，這種現(xiàn)象被稱為“洶涌發(fā)酵”，是該菌的典型特征之一。在生化特性方面，所有型菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但不發(fā)酵甘露醇或水楊苷；能夠液化明膠，產(chǎn)生H?S，不能消化已凝固的蛋白質(zhì)和血清，吲哚試驗為陰性；主要代謝產(chǎn)物為乙酸和丁酸，有時也會形成丁醇。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生外毒素種類的不同，可將其分為A、B、C、D、E5個毒素型，其中對人致病的主要是A型和C型，A型最為常見，可引起氣性壞疽和胃腸炎型食物中毒，C型則能引發(fā)壞死性腸炎。該菌廣泛分布于自然界，如土壤、污水、人和動物的腸道等環(huán)境，是人和動物腸道中的常在菌之一。2.1.2致病機(jī)制產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)制主要與其產(chǎn)生的多種毒素和侵襲性酶有關(guān)，這些毒素和酶協(xié)同作用，對宿主細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重?fù)p害，從而引發(fā)各種疾病。α毒素（α-toxin），也被稱為磷脂酶C（plc），由plc基因編碼，是產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的一種關(guān)鍵毒素，在致病過程中發(fā)揮著核心作用。α毒素具有廣泛的生物學(xué)活性，它能夠特異性地水解細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，進(jìn)而引起細(xì)胞壞死。在氣性壞疽的發(fā)生發(fā)展中，α毒素對肌肉組織細(xì)胞的破壞尤為顯著，它可使肌肉細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致肌肉組織壞死、溶解，同時還能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使血管通透性增高，造成局部組織水腫、出血和循環(huán)障礙。α毒素還具有溶血活性，能夠破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象，進(jìn)一步加重組織缺氧和損傷。NetB毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的另一種重要毒素，主要影響禽類。NetB毒素能夠作用于腸道上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞間的緊密連接蛋白，使腸道上皮細(xì)胞的緊密連接受損，增加腸道的通透性。這使得腸道內(nèi)的病原菌、毒素以及其他有害物質(zhì)更容易侵入機(jī)體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致禽類壞死性腸炎的發(fā)生。壞死性腸炎會嚴(yán)重影響禽類的腸道消化和吸收功能，導(dǎo)致禽類生長發(fā)育受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低，嚴(yán)重時可導(dǎo)致禽類死亡。除了α毒素和NetB毒素外，產(chǎn)氣莢膜梭菌還能產(chǎn)生多種其他毒素和侵襲性酶，如β毒素、ε毒素、ι毒素、θ毒素、λ毒素、κ毒素、μ毒素、神經(jīng)氨酸酶等。β毒素是一種神經(jīng)毒素，主要作用于腸道的運(yùn)動神經(jīng)，可導(dǎo)致腸道運(yùn)動功能紊亂，引起腸道壞死；ε毒素具有壞死和致死功能，能增加血管通透性，導(dǎo)致組織水腫和壞死；ι毒素也有致死和壞死功能，可通過破壞細(xì)胞骨架等機(jī)制損傷細(xì)胞；θ毒素對熱不穩(wěn)定，是一種溶血素，不僅可以破壞白細(xì)胞，影響機(jī)體的免疫防御功能，還對心肌有毒性，可導(dǎo)致心肌損傷；λ毒素是一種蛋白酶，能夠分解蛋白質(zhì)，破壞組織的結(jié)構(gòu)和功能；κ毒素是膠原酶，可分解膠原組織，使結(jié)締組織受損，有利于細(xì)菌的擴(kuò)散；μ毒素是透明質(zhì)酸酶，能分解細(xì)胞間質(zhì)中的透明質(zhì)酸，降低組織的粘性，促進(jìn)細(xì)菌在組織中的擴(kuò)散。在感染過程中，產(chǎn)氣莢膜梭菌首先通過其表面的黏附因子附著在宿主細(xì)胞表面，然后大量繁殖并釋放毒素和侵襲性酶。這些毒素和酶相互協(xié)同，對宿主的組織和器官造成廣泛的損傷，引發(fā)一系列病理生理變化，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。當(dāng)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染傷口時，α毒素和其他毒素、酶共同作用，破壞肌肉組織和血管，引起氣性壞疽，表現(xiàn)為局部組織腫脹、產(chǎn)氣、壞死，伴有嚴(yán)重的全身中毒癥狀；在腸道感染中，多種毒素和酶破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致腸道炎癥、出血、壞死，引發(fā)壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病。2.1.3對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害產(chǎn)氣莢膜梭菌對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害十分嚴(yán)重，可引發(fā)多種畜禽疾病，導(dǎo)致畜禽生長發(fā)育受阻、生產(chǎn)性能下降，甚至死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在養(yǎng)雞業(yè)中，產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起雞壞死性腸炎的主要病原菌之一。雞感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，腸道黏膜受到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)出血、壞死等病變，影響腸道的正常消化和吸收功能。病雞表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振、腹瀉，糞便中常帶有血液和壞死組織碎片。隨著病情的發(fā)展，雞的生長速度明顯減緩，體重下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低，料肉比升高。在嚴(yán)重感染的情況下，雞群的死淘率急劇上升，急性感染時甚至可導(dǎo)致雞群大批死亡。有研究表明，當(dāng)雞群受到產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引發(fā)相關(guān)性肝病時，其生產(chǎn)性能可能降低23-43%，這在蛋雞和種雞中表現(xiàn)得尤為明顯，蛋雞的產(chǎn)蛋量大幅下降，種雞的受精率和孵化率降低。在養(yǎng)豬業(yè)中，產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致仔豬紅痢和母豬脹氣等疾病。仔豬紅痢主要由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，多發(fā)生于1-3日齡的仔豬。感染后的仔豬通常表現(xiàn)出急性型癥狀，可能無明顯發(fā)病征兆而突然死亡；部分慢性型病例病程一般持續(xù)約2d，病豬排帶血的水樣稀糞，內(nèi)含灰色的壞死組織，迅速脫水、虛弱、消瘦，體溫快速下降，最終衰竭死亡。母豬脹氣則主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起，不僅會造成死胎增多，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致母豬死亡。這些疾病的發(fā)生，不僅增加了仔豬和母豬的死亡率，還會影響豬的生長發(fā)育和養(yǎng)殖效益，增加養(yǎng)殖成本。在養(yǎng)牛業(yè)方面，近年來產(chǎn)氣莢膜梭菌對中國養(yǎng)牛業(yè)的危害日益嚴(yán)重，其流行型別和致病特點(diǎn)較以往也在發(fā)生變化，其中C、D型菌對牛致病增多，部分病例呈現(xiàn)慢性型發(fā)病癥狀。牛感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后，可引發(fā)腸毒血癥、壞死性腸炎等疾病，導(dǎo)致牛的消化功能紊亂，生長緩慢，體重減輕?；疾∨＿€可能出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重影響牛的健康和養(yǎng)殖效益。在一些規(guī)?；B(yǎng)牛場，由于產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的牛死亡和生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？偟膩碚f，產(chǎn)氣莢膜梭菌感染給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失是多方面的，包括畜禽的死亡損失、治療費(fèi)用、飼料浪費(fèi)、養(yǎng)殖周期延長以及畜產(chǎn)品質(zhì)量下降等。為了防控產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，養(yǎng)殖戶需要投入大量的人力、物力和財力，如加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、改善養(yǎng)殖環(huán)境、使用抗生素和疫苗等，但這些措施往往效果有限，且長期使用抗生素還會帶來細(xì)菌耐藥性和藥物殘留等問題。因此，尋找有效的防治產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的方法，對于保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。2.2plc和NetB基因2.2.1plc基因結(jié)構(gòu)與功能plc基因是產(chǎn)氣莢膜梭菌中的關(guān)鍵基因，其全稱為磷脂酶C基因（phospholipaseCgene），編碼的α毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病過程中發(fā)揮著核心作用。plc基因的序列長度因菌株而異，但通常包含一段開放閱讀框（ORF），該ORF能夠指導(dǎo)合成具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)，即α毒素。以常見的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株為例，其plc基因的ORF長度約為1200bp左右，編碼約400個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，plc基因編碼的α毒素屬于鋅依賴型金屬酶，其活性中心含有一個鋅離子，對于酶的催化活性至關(guān)重要。α毒素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含多個結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域參與毒素與細(xì)胞膜上磷脂分子的結(jié)合，C端結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)催化磷脂的水解反應(yīng)。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得α毒素能夠特異性地識別并結(jié)合細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂等磷脂分子，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。α毒素的主要功能是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性。其作用機(jī)制是通過水解細(xì)胞膜上的磷脂，使細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終引起細(xì)胞壞死。在氣性壞疽的發(fā)生過程中，α毒素能夠作用于肌肉組織細(xì)胞的細(xì)胞膜，使肌肉細(xì)胞受損，肌肉組織出現(xiàn)壞死、溶解等病變。α毒素還可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，使血管通透性增高，導(dǎo)致局部組織水腫、出血和循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重組織損傷。α毒素還具有溶血活性。它能夠與紅細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，水解紅細(xì)胞膜上的磷脂，使紅細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生。溶血作用不僅會導(dǎo)致紅細(xì)胞數(shù)量減少，影響氧氣的運(yùn)輸和供應(yīng)，還會釋放出血紅蛋白等物質(zhì)，進(jìn)一步加重組織的損傷和炎癥反應(yīng)。此外，α毒素還可能通過激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、休克等嚴(yán)重的病理生理變化。2.2.2NetB基因結(jié)構(gòu)與功能NetB基因是產(chǎn)氣莢膜梭菌中另一個重要的基因，它編碼的NetB毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌對禽類的致病過程中起著關(guān)鍵作用。NetB基因的序列長度一般在1000bp左右，同樣包含一段完整的開放閱讀框，該閱讀框負(fù)責(zé)編碼NetB毒素的氨基酸序列。通過對不同產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株的NetB基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列具有一定的保守性，但也存在一些微小的差異，這些差異可能會影響NetB毒素的生物學(xué)活性和抗原性。從結(jié)構(gòu)上看，NetB毒素屬于β-桶狀孔道形成毒素家族。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由多個β-折疊片層組成，這些β-折疊片層能夠在細(xì)胞膜上組裝形成親水性的孔道結(jié)構(gòu)。NetB毒素在未與細(xì)胞膜結(jié)合時，以單體形式存在，當(dāng)它接觸到靶細(xì)胞的細(xì)胞膜后，會發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，多個單體之間相互作用，形成寡聚體，并最終插入細(xì)胞膜中，形成穩(wěn)定的孔道。NetB毒素的主要功能是破壞細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其作用機(jī)制是通過在細(xì)胞膜上形成親水性孔道，使細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)外流，破壞細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和滲透壓平衡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂死亡。在禽類壞死性腸炎的發(fā)病過程中，NetB毒素主要作用于腸道上皮細(xì)胞。腸道上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，NetB毒素與腸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，能夠在細(xì)胞膜上形成孔道，使細(xì)胞內(nèi)的鉀離子、鈣離子等重要離子外流，同時細(xì)胞外的鈉離子和水分子大量內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂。腸道上皮細(xì)胞的損傷會破壞腸道黏膜屏障的完整性，使腸道內(nèi)的病原菌、毒素以及其他有害物質(zhì)更容易侵入機(jī)體，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致壞死性腸炎的發(fā)生。腸道上皮細(xì)胞的損傷還會影響腸道的消化和吸收功能，導(dǎo)致禽類生長發(fā)育受阻、飼料轉(zhuǎn)化率降低，嚴(yán)重影響家禽的養(yǎng)殖效益。NetB毒素還可能通過激活腸道內(nèi)的免疫細(xì)胞，引發(fā)過度的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步加重腸道組織的損傷。一些研究表明，NetB毒素能夠刺激腸道內(nèi)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥因子會導(dǎo)致腸道組織的炎癥反應(yīng)加劇，出現(xiàn)黏膜出血、壞死等病理變化。2.3植物乳酸桿菌2.3.1生物學(xué)特性植物乳酸桿菌（Lactobacillusplantarum）隸屬于乳酸菌科乳酸菌屬，是一種革蘭氏陽性菌。其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)為直或彎的桿狀，大小通常為(0.7-1)μm×(3-8)μm，常以單個、成對或成鏈狀的形式存在。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物乳酸桿菌的表面菌落直徑約為3mm，呈凸起狀，外觀圓形，表面光滑且細(xì)密，顏色一般為白色，偶爾也會呈現(xiàn)出淺黃或深黃色。植物乳酸桿菌屬于化能異養(yǎng)菌，其生長需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。在生長過程中，它需要泛酸鈣和煙酸等營養(yǎng)物質(zhì)，但對硫胺素、吡哆醛或吡哆胺、葉酸、維生素B12等并無需求。該菌能夠發(fā)酵戊糖或葡萄糖酸鹽，其發(fā)酵終產(chǎn)物中85%以上為乳酸，屬于同型發(fā)酵乳酸菌。在代謝特性方面，植物乳酸桿菌通常不還原硝酸鹽，也不具備液化明膠的能力，其接觸酶和氧化酶檢測結(jié)果均為陰性。它還具有1,6-二磷酸果糖醛縮酶和單磷酸己糖途徑的活性，能夠在葡萄酸鹽中生長并產(chǎn)生CO?，在發(fā)酵1分子的核糖或其他戊糖時，會生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。在生長環(huán)境適應(yīng)性上，植物乳酸桿菌具有一定的特點(diǎn)。它最適生長溫度在30-35℃之間，厭氧或兼性厭氧。在15℃的環(huán)境下，植物乳酸桿菌依然能夠生長，只是生長速度相對較慢。其最適生長pH值約為6.5，在酸性環(huán)境中具有較好的耐受性，這使得它能夠在胃腸道等酸性環(huán)境中生存和繁殖。植物乳酸桿菌在自然界中分布極為廣泛。它常存在于發(fā)酵食品中，如酸奶、酸菜、泡菜等，在這些發(fā)酵食品的制作過程中，植物乳酸桿菌發(fā)揮著重要作用，參與發(fā)酵過程，產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物，不僅賦予了食品獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地，還具有一定的保鮮和防腐作用。在植物材料中，例如果蔬表面、谷物等，也能檢測到植物乳酸桿菌的存在。它能夠利用植物中的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖，在植物的自然發(fā)酵和保鮮過程中扮演著重要角色。植物乳酸桿菌也是人和動物腸道中的常見微生物之一，它能夠在腸道內(nèi)定殖，與腸道內(nèi)的其他微生物相互作用，維持腸道微生態(tài)平衡，對宿主的健康產(chǎn)生積極影響。2.3.2益生特性植物乳酸桿菌具有多種益生特性，對維持宿主的健康起著重要作用，這些益生特性主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫力以及降低膽固醇等方面。在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡方面，植物乳酸桿菌通過多種機(jī)制發(fā)揮作用。它能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等，使腸道內(nèi)環(huán)境的pH值降低。這種酸性環(huán)境不利于有害菌的生長繁殖，如大腸桿菌、沙門氏菌等，因為這些有害菌在酸性條件下的生長會受到抑制，其細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和酶的活性都會受到影響，從而無法正常生長和代謝。植物乳酸桿菌還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠特異性地抑制或殺死某些有害菌。細(xì)菌素可以作用于有害菌的細(xì)胞膜，使其通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終使有害菌死亡。植物乳酸桿菌通過與有害菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)，減少有害菌在腸道內(nèi)的定殖機(jī)會。它能夠優(yōu)先利用腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、氨基酸等，使有害菌缺乏生長所需的營養(yǎng)；同時，它能夠緊密黏附在腸道上皮細(xì)胞表面，占據(jù)黏附位點(diǎn)，阻止有害菌的黏附，從而維持腸道菌群的平衡。植物乳酸桿菌能夠促進(jìn)消化吸收。它可以產(chǎn)生多種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯纸鉃槠咸烟堑刃》肿犹穷悾鞍酌缚梢詫⒌鞍踪|(zhì)分解為氨基酸和小肽，脂肪酶則能將脂肪分解為脂肪酸和甘油。這些小分子物質(zhì)更容易被腸道吸收，從而提高了食物的消化利用率。植物乳酸桿菌還能增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的功能。它可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化，增加腸道絨毛的長度和數(shù)量，提高腸道的吸收面積。它還能調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。植物乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸等，也對腸道的消化吸收功能具有促進(jìn)作用。短鏈脂肪酸可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道蠕動，有助于食物的消化和排泄。在增強(qiáng)免疫力方面，植物乳酸桿菌具有顯著的作用。它能夠刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活化。植物乳酸桿菌可以與腸道黏膜上的免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞的信號通路，使免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等活化，增強(qiáng)它們的吞噬能力、分泌細(xì)胞因子的能力以及產(chǎn)生抗體的能力。植物乳酸桿菌還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的平衡。它可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子（如干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2等）和Th2型細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-5等）的平衡分泌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，同時避免過度免疫反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥損傷。植物乳酸桿菌還能通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，間接增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。腸道菌群與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，平衡的腸道菌群有助于維持免疫系統(tǒng)的正常功能，植物乳酸桿菌通過維持腸道菌群平衡，為免疫系統(tǒng)提供了一個良好的微生態(tài)環(huán)境，從而增強(qiáng)了機(jī)體的整體免疫力。植物乳酸桿菌還具有降低膽固醇的作用。其作用機(jī)制主要包括以下幾個方面。植物乳酸桿菌可以通過吸附作用降低膽固醇含量。它的細(xì)胞壁成分能夠與膽固醇結(jié)合，使其在腸道內(nèi)的溶解度降低，從而減少膽固醇的吸收。植物乳酸桿菌在代謝過程中會產(chǎn)生膽鹽水解酶。這種酶能夠?qū)⒔Y(jié)合型膽汁酸水解為游離型膽汁酸，游離型膽汁酸不易被腸道重吸收，從而促使肝臟利用膽固醇合成膽汁酸，降低血液中的膽固醇含量。植物乳酸桿菌還可能通過影響膽固醇的代謝途徑來降低膽固醇水平。它可以調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇合成相關(guān)酶的活性，抑制膽固醇的合成，或者促進(jìn)膽固醇的排泄，從而降低血液和組織中的膽固醇含量。2.3.3作為基因工程載體的優(yōu)勢植物乳酸桿菌作為基因工程載體具有諸多顯著優(yōu)勢，使其在生物技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。植物乳酸桿菌本身無毒性，具有極高的安全性。它是人和動物腸道中的常見益生菌，長期存在于宿主體內(nèi)，對宿主健康無不良影響。與其他一些潛在的基因工程載體相比，如某些病毒載體，植物乳酸桿菌不存在病毒感染和潛在的致癌風(fēng)險。在將其作為基因工程載體用于生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)時，無需擔(dān)心其對人體和動物的毒性問題，這為其在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅實的安全基礎(chǔ)。植物乳酸桿菌能夠在腸道內(nèi)成功定植。其細(xì)胞表面存在多種黏附因子，這些因子能夠與腸道上皮細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，從而使植物乳酸桿菌牢固地黏附在腸道上皮細(xì)胞上，實現(xiàn)穩(wěn)定定植。這種特性使得它能夠在腸道內(nèi)持續(xù)表達(dá)外源基因，為腸道提供持續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)利用植物乳酸桿菌作為載體表達(dá)具有治療作用的蛋白時，它可以在腸道內(nèi)長期定植并不斷表達(dá)該蛋白，從而持續(xù)發(fā)揮治療效果，而無需頻繁給藥。植物乳酸桿菌能夠有效地表達(dá)外源基因。它具有一套完整的基因表達(dá)系統(tǒng)，包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等元件，能夠識別并轉(zhuǎn)錄外源基因。其翻譯系統(tǒng)也能夠準(zhǔn)確地將外源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。植物乳酸桿菌的生長速度較快，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠在短時間內(nèi)大量繁殖。這一特性使得在利用其進(jìn)行外源基因表達(dá)時，可以快速獲得大量表達(dá)外源蛋白的菌體，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。植物乳酸桿菌能夠激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。腸道黏膜是機(jī)體與外界環(huán)境接觸的重要界面，也是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。植物乳酸桿菌作為腸道內(nèi)的常駐菌，在表達(dá)外源基因后，其表達(dá)的蛋白可以直接接觸腸道黏膜免疫系統(tǒng)。它能夠刺激腸道黏膜表面的免疫細(xì)胞，如上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。這些免疫細(xì)胞被激活后，會分泌多種細(xì)胞因子和免疫球蛋白，如IgA等。IgA是腸道黏膜免疫的主要抗體，它能夠特異性地結(jié)合病原體和外來抗原，阻止它們與腸道上皮細(xì)胞的黏附，從而發(fā)揮免疫防御作用。通過激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)，植物乳酸桿菌作為基因工程載體可以為機(jī)體提供針對特定病原體或抗原的局部免疫保護(hù)，增強(qiáng)機(jī)體對疾病的抵抗力。三、重組植物乳酸桿菌的構(gòu)建3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株為本實驗室分離保存，經(jīng)過鑒定確認(rèn)其毒力及相關(guān)生物學(xué)特性，確保能夠穩(wěn)定表達(dá)plc和NetB基因，為后續(xù)實驗提供可靠的基因來源。植物乳酸桿菌菌株LactobacillusplantarumATCC8014購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該菌株遺傳背景清晰，具有良好的益生特性和遺傳穩(wěn)定性，能夠作為理想的基因工程載體。質(zhì)粒pMD19-TSimpleVector購自TaKaRa公司，該質(zhì)粒具有多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因以及高拷貝數(shù)復(fù)制起點(diǎn)，方便目的基因的插入、篩選以及在宿主菌中的大量擴(kuò)增。實驗動物選用SPF級Balb/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，小鼠6-8周齡，體重18-22g，飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由采食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實驗，確保實驗動物的健康狀態(tài)和一致性，減少實驗誤差。工具酶包括限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI，購自NEB公司，該公司的限制性內(nèi)切酶具有高活性和特異性，能夠準(zhǔn)確切割DNA片段；T4DNA連接酶購自Promega公司，其連接效率高，可有效連接目的基因和載體；PrimeSTARHSDNAPolymerase購自TaKaRa公司，具有高保真度，能夠減少PCR擴(kuò)增過程中的堿基錯配，保證擴(kuò)增基因的準(zhǔn)確性。試劑方面，DNAMarkerDL2000、DL15000購自TaKaRa公司，用于判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的大小；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，提取和回收的DNA純度高、完整性好；LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，為細(xì)菌的生長提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境；氨芐青霉素、氯霉素等抗生素購自Sigma公司，用于篩選含有重組質(zhì)粒的菌株。儀器設(shè)備包含PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），溫度控制精確，能夠滿足PCR反應(yīng)中變性、退火和延伸的溫度要求；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），可在低溫條件下快速離心，用于分離和純化DNA、蛋白質(zhì)等生物分子；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），能夠清晰成像，準(zhǔn)確分析DNA條帶；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，用于細(xì)菌的培養(yǎng)；恒溫?fù)u床（太倉市實驗設(shè)備廠），使細(xì)菌在培養(yǎng)過程中充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)生長。3.1.2實驗方法從產(chǎn)氣莢膜梭菌中擴(kuò)增plc和NetB基因時，首先提取產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照其操作說明書進(jìn)行提取。根據(jù)GenBank中公布的plc和NetB基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物，引物兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，以方便后續(xù)的基因克隆。引物序列如下：plc基因上游引物：5'-CGGAATTCATGAAAGAAAAGAAAGAAAG-3'（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACTTCTTTTCCACATTTCT-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)）。NetB基因上游引物：5'-CGGAATTCATGAAATAAAAAGTTTATG-3'（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACATCTTTCTCTGATCTT-3'（下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)）。以提取的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA1μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有特異性條帶，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將目的基因與植物乳酸桿菌質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI分別對PCR擴(kuò)增得到的plc和NetB基因片段以及質(zhì)粒pMD19-TSimpleVector進(jìn)行雙酶切。酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，EcoRI1μL，XhoI1μL，DNA10μL，ddH?O6μL。37℃水浴酶切3h。酶切結(jié)束后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段和載體片段。將回收的目的基因片段和載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為10μL，包括10×T4DNALigaseBuffer1μL，目的基因片段3μL，載體片段1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物即為重組質(zhì)粒pMD19-T-plc和pMD19-T-NetB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至植物乳酸桿菌采用電轉(zhuǎn)化法。首先制備植物乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將植物乳酸桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)至OD???值為0.5-0.6。將培養(yǎng)物冰浴30min，然后4℃、5000rpm離心10min，收集菌體。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體3次，再用10%甘油洗滌菌體1次，最后將菌體重懸于10%甘油中，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×101?-1×1011cfu/mL，即為感受態(tài)細(xì)胞，分裝后保存于-80℃?zhèn)溆?。?0μL重組質(zhì)粒加入到100μL植物乳酸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)為2.5kV，25μF，200Ω，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)后立即加入1mL預(yù)冷的MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)2h，使細(xì)胞復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的MRS固體培養(yǎng)基平板上，37℃厭氧培養(yǎng)24-48h，篩選轉(zhuǎn)化子。篩選鑒定陽性重組菌株時，隨機(jī)挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)物中的質(zhì)粒DNA，使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系及條件同構(gòu)建重組質(zhì)粒時的酶切步驟。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與目的基因大小相符的條帶，則初步判斷為陽性重組菌株。對初步鑒定為陽性的重組菌株進(jìn)行PCR鑒定，以提取的質(zhì)粒DNA為模板，使用與擴(kuò)增目的基因相同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件同擴(kuò)增目的基因時一致。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)特異性條帶，則進(jìn)一步確認(rèn)該菌株為陽性重組菌株。對確認(rèn)的陽性重組菌株進(jìn)行測序鑒定，將菌株送測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中公布的plc和NetB基因序列進(jìn)行比對，若序列一致，則最終確定該菌株為成功構(gòu)建的重組植物乳酸桿菌。3.2重組質(zhì)粒的鑒定3.2.1PCR鑒定以篩選出的重組植物乳酸桿菌的質(zhì)粒DNA為模板，使用擴(kuò)增plc和NetB基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。在圖1中，M為DNAMarkerDL2000，1-5泳道為plc基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6-10泳道為NetB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢郧逦赜^察到，在plc基因的擴(kuò)增泳道中，1-5泳道均出現(xiàn)了一條大小約為1200bp的特異性條帶，與預(yù)期的plc基因片段大小相符；在NetB基因的擴(kuò)增泳道中，6-10泳道均出現(xiàn)了一條大小約為1000bp的特異性條帶，與預(yù)期的NetB基因片段大小一致。這表明重組質(zhì)粒中成功插入了plc和NetB基因，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過PCR鑒定，能夠快速、直觀地檢測重組質(zhì)粒中目的基因的存在情況，為后續(xù)的雙酶切鑒定和測序鑒定提供了重要的參考依據(jù)。3.2.2雙酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI對重組質(zhì)粒pMD19-T-plc和pMD19-T-NetB進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。圖2中，M為DNAMarkerDL15000，1-3泳道為pMD19-T-plc重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物，4-6泳道為pMD19-T-NetB重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。在pMD19-T-plc重組質(zhì)粒的雙酶切泳道中，1-3泳道均出現(xiàn)了兩條條帶，一條大小約為2692bp，與pMD19-TSimpleVector的大小相符，另一條大小約為1200bp，與plc基因片段大小一致；在pMD19-T-NetB重組質(zhì)粒的雙酶切泳道中，4-6泳道也均出現(xiàn)了兩條條帶，一條大小約為2692bp，另一條大小約為1000bp，與NetB基因片段大小相符。雙酶切結(jié)果進(jìn)一步驗證了重組質(zhì)粒中目的基因的插入情況，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。雙酶切鑒定能夠從酶切片段大小的角度，直觀地驗證重組質(zhì)粒的構(gòu)建是否成功，與PCR鑒定結(jié)果相互印證，提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2.3測序鑒定將初步鑒定為陽性的重組菌株送測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中公布的plc和NetB基因序列進(jìn)行比對。測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中plc基因和NetB基因的序列與GenBank中相應(yīng)基因序列的同源性均達(dá)到99%以上，且基因的閱讀框正確，無堿基缺失、插入或突變等情況。這表明成功將plc和NetB基因克隆到了植物乳酸桿菌的質(zhì)粒中，重組植物乳酸桿菌構(gòu)建成功。測序鑒定是對重組質(zhì)粒最準(zhǔn)確、最可靠的鑒定方法，能夠從基因序列的層面確保重組質(zhì)粒中目的基因的準(zhǔn)確性和完整性，為后續(xù)的研究提供了堅實的基礎(chǔ)。3.3重組植物乳酸桿菌的表達(dá)分析3.3.1蛋白表達(dá)檢測將成功構(gòu)建的重組植物乳酸桿菌接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取1mL菌液，12000rpm離心5min，收集菌體，用PBS洗滌菌體3次。向菌體沉淀中加入適量的細(xì)菌蛋白裂解液，冰浴裂解30min，期間每隔5min渦旋振蕩1次，使菌體充分裂解。然后12000rpm離心15min，取上清，即為重組植物乳酸桿菌的總蛋白提取物。采用SDS對總蛋白提取物進(jìn)行分析，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。取20μL蛋白樣品與5μL5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品上樣至SDS凝膠孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓120V條件下進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色2-4h，然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白條帶顯現(xiàn)。SDS結(jié)果如圖3所示，M為蛋白Marker，1泳道為未誘導(dǎo)的重組植物乳酸桿菌總蛋白，2泳道為誘導(dǎo)后的重組植物乳酸桿菌總蛋白。在誘導(dǎo)后的泳道中，可以清晰地看到在相對分子量約為45kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的plc蛋白分子量相符；在相對分子量約為35kDa處也出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的NetB蛋白分子量一致。而在未誘導(dǎo)的泳道中，幾乎看不到這兩條蛋白條帶，說明誘導(dǎo)表達(dá)成功，重組植物乳酸桿菌能夠表達(dá)plc和NetB蛋白。為進(jìn)一步驗證表達(dá)的蛋白是否為目的蛋白，進(jìn)行WesternBlot檢測。將SDS分離后的蛋白通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min。然后將PVDF膜與一抗（鼠抗plc蛋白單克隆抗體和鼠抗NetB蛋白單克隆抗體，稀釋比例均為1:1000）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。接著將PVDF膜與二抗（羊抗鼠IgG-HRP，稀釋比例為1:5000）室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。WesternBlot結(jié)果如圖4所示，1泳道為plc蛋白的WesternBlot檢測結(jié)果，2泳道為NetB蛋白的WesternBlot檢測結(jié)果。在1泳道中，在相對分子量約為45kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的plc蛋白分子量一致；在2泳道中，在相對分子量約為35kDa處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的NetB蛋白分子量相符。這進(jìn)一步證實了重組植物乳酸桿菌表達(dá)的蛋白即為目的蛋白plc和NetB。3.3.2表達(dá)條件優(yōu)化為了提高重組蛋白plc和NetB的表達(dá)量，對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化研究。首先研究誘導(dǎo)劑濃度對重組蛋白表達(dá)量的影響。將重組植物乳酸桿菌接種于含有氨芐青霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD???值約為0.6）。然后分別加入不同終濃度（0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM）的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，收集菌體，提取總蛋白，進(jìn)行SDS分析，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶的灰度值，以確定不同誘導(dǎo)劑濃度下重組蛋白的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。隨著IPTG濃度的增加，plc和NetB蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)IPTG濃度為1.0mM時，兩種重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到最高。接著探究誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)量的影響。在IPTG終濃度為1.0mM的條件下，37℃誘導(dǎo)重組植物乳酸桿菌表達(dá)不同時間（2h、4h、6h、8h、10h），然后收集菌體，提取總蛋白，進(jìn)行SDS分析和灰度值測定，結(jié)果如圖6所示。plc和NetB蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時間的延長而逐漸增加，在誘導(dǎo)6h時，表達(dá)量達(dá)到較高水平，之后隨著誘導(dǎo)時間的進(jìn)一步延長，表達(dá)量增加不明顯，且有下降趨勢。最后研究培養(yǎng)溫度對重組蛋白表達(dá)量的影響。在IPTG終濃度為1.0mM，誘導(dǎo)時間為6h的條件下，分別在不同溫度（30℃、37℃、42℃）下誘導(dǎo)重組植物乳酸桿菌表達(dá)，收集菌體，提取總蛋白，進(jìn)行SDS分析和灰度值測定，結(jié)果如圖7所示。37℃時，plc和NetB蛋白的表達(dá)量最高，30℃和42℃時表達(dá)量相對較低。綜合以上實驗結(jié)果，確定重組植物乳酸桿菌表達(dá)plc和NetB蛋白的最佳條件為：IPTG終濃度1.0mM，誘導(dǎo)時間6h，培養(yǎng)溫度37℃。在最佳表達(dá)條件下，重組蛋白的表達(dá)量得到顯著提高，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。四、重組植物乳酸桿菌的免疫保護(hù)研究4.1體外免疫保護(hù)實驗4.1.1實驗設(shè)計選用雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）作為實驗細(xì)胞模型，因其對產(chǎn)氣莢膜梭菌較為敏感，且易于培養(yǎng)和操作，能夠很好地模擬產(chǎn)氣莢膜梭菌在體內(nèi)感染細(xì)胞的情況。將對數(shù)生長期的CEF細(xì)胞以每孔1×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。實驗共分為5組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，具體分組及處理方式如下：對照組：只加入正常的CEF細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液，不做任何其他處理，作為細(xì)胞正常生長的對照，用于評估細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)和活性。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組：向CEF細(xì)胞中加入產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液，使感染復(fù)數(shù)（MOI）為100，即產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量是細(xì)胞數(shù)量的100倍，模擬產(chǎn)氣莢膜梭菌對細(xì)胞的感染過程，用于觀察產(chǎn)氣莢膜梭菌單獨(dú)作用下細(xì)胞的變化情況。重組植物乳酸桿菌組：向CEF細(xì)胞中加入重組植物乳酸桿菌菌液，使菌液濃度為1×10?cfu/mL，單獨(dú)觀察重組植物乳酸桿菌對細(xì)胞的影響，了解其是否對細(xì)胞本身有不良作用。重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組：先向CEF細(xì)胞中加入重組植物乳酸桿菌菌液，使菌液濃度為1×10?cfu/mL，孵育2h，讓重組植物乳酸桿菌與細(xì)胞充分接觸并發(fā)揮作用，然后再加入產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液，使MOI為100，模擬重組植物乳酸桿菌提前作用后產(chǎn)氣莢膜梭菌對細(xì)胞的感染情況，研究重組植物乳酸桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染細(xì)胞的保護(hù)效果?？蛰d體植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組：先向CEF細(xì)胞中加入含有空載體的植物乳酸桿菌菌液，菌液濃度同樣為1×10?cfu/mL，孵育2h后，再加入產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液，MOI為100，作為陰性對照，排除空載體植物乳酸桿菌對實驗結(jié)果的干擾，驗證重組植物乳酸桿菌的保護(hù)作用是否是由其表達(dá)的目的基因引起的。將上述各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進(jìn)行后續(xù)的檢測分析。4.1.2細(xì)胞活性檢測采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，該方法基于WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色的甲瓚，生成的甲瓚的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)成正比的原理，能夠準(zhǔn)確、靈敏地反映細(xì)胞的活性。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，然后將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實驗結(jié)果如圖8所示，橫坐標(biāo)表示不同的實驗組，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞的相對活性（以對照組細(xì)胞活性為100%）。對照組細(xì)胞的OD值為1.25±0.05，設(shè)定其細(xì)胞相對活性為100%。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組的OD值為0.56±0.03，細(xì)胞相對活性顯著降低至44.8%±2.4%，表明產(chǎn)氣莢膜梭菌對CEF細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，能夠顯著抑制細(xì)胞的活性，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。重組植物乳酸桿菌組的OD值為1.18±0.04，細(xì)胞相對活性為94.4%±3.2%，與對照組相比無顯著差異（P>0.05），說明重組植物乳酸桿菌對CEF細(xì)胞本身無明顯的毒性作用，不會影響細(xì)胞的正常生長和活性。重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組的OD值為0.85±0.04，細(xì)胞相對活性為68.0%±3.2%，顯著高于產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組（P<0.05），表明重組植物乳酸桿菌能夠在一定程度上保護(hù)CEF細(xì)胞免受產(chǎn)氣莢膜梭菌的侵害，提高細(xì)胞的活性?？蛰d體植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組的OD值為0.62±0.03，細(xì)胞相對活性為49.6%±2.4%，與產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組相比無顯著差異（P>0.05），進(jìn)一步證明了重組植物乳酸桿菌的保護(hù)作用是由其表達(dá)的plc和NetB基因產(chǎn)物所介導(dǎo)的，而不是植物乳酸桿菌本身或空載體的作用。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示不同組之間的細(xì)胞相對活性存在顯著差異（P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較檢驗，結(jié)果表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組與對照組、重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組之間均存在顯著差異（P<0.05）；重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組與空載體植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組之間也存在顯著差異（P<0.05）。這些結(jié)果充分表明重組植物乳酸桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，能夠有效提高細(xì)胞在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染下的存活率。4.1.3炎癥因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量。IL-1β和TNF-α是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。收集細(xì)胞培養(yǎng)24h后的上清液，按照ELISA試劑盒的操作說明書進(jìn)行檢測。首先將抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜，使抗體牢固結(jié)合在板上；然后用洗滌液洗滌3次，每次5min，去除未結(jié)合的抗體；接著加入封閉液，37℃孵育1h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；再加入稀釋后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1h，使炎癥因子與抗體充分結(jié)合；之后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育1h，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物；最后加入底物溶液，避光顯色15min，加入終止液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中IL-1β和TNF-α的含量。實驗結(jié)果如圖9所示，橫坐標(biāo)表示不同的實驗組，縱坐標(biāo)表示炎癥因子的含量（pg/mL）。對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量為25.6±2.1pg/mL，TNF-α的含量為32.5±2.5pg/mL。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組中IL-1β的含量顯著升高至125.3±8.2pg/mL，TNF-α的含量升高至186.7±10.5pg/mL，與對照組相比差異極顯著（P<0.01），表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)CEF細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。重組植物乳酸桿菌組中IL-1β的含量為30.2±2.5pg/mL，TNF-α的含量為38.6±3.0pg/mL，與對照組相比無顯著差異（P>0.05），說明重組植物乳酸桿菌單獨(dú)作用時不會引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組中IL-1β的含量為78.5±5.6pg/mL，TNF-α的含量為112.4±8.0pg/mL，顯著低于產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組（P<0.05），表明重組植物乳酸桿菌能夠抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染誘導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)?？蛰d體植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組中IL-1β的含量為118.6±7.5pg/mL，TNF-α的含量為175.3±9.5pg/mL，與產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組相比無顯著差異（P>0.05），進(jìn)一步證實了重組植物乳酸桿菌抑制炎癥反應(yīng)的作用是由其表達(dá)的目的基因產(chǎn)物所介導(dǎo)的。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示不同組之間的炎癥因子含量存在顯著差異（P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較檢驗，結(jié)果表明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組與對照組、重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組之間均存在極顯著差異（P<0.01）；重組植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組與空載體植物乳酸桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染組之間也存在顯著差異（P<0.05）。這些結(jié)果表明重組植物乳酸桿菌能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕細(xì)胞的炎癥損傷，這可能是其發(fā)揮免疫保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。4.2體內(nèi)免疫保護(hù)實驗4.2.1動物實驗設(shè)計選用60只SPF級Balb/c小鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。分組及處理情況如下：對照組：灌胃等量的生理鹽水，不進(jìn)行任何免疫和攻菌處理，作為空白對照，用于評估小鼠在正常生理狀態(tài)下的各項指標(biāo)變化。重組植物乳酸桿菌免疫組：每只小鼠每次灌胃1×10?cfu的重組植物乳酸桿菌菌液，每隔7天免疫一次，共免疫3次。在第三次免疫后14天，對小鼠進(jìn)行攻菌，攻菌時每只小鼠腹腔注射1×10?cfu的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液，用于研究重組植物乳酸桿菌免疫后對產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊的保護(hù)效果?？蛰d體植物乳酸桿菌免疫組：每只小鼠每次灌胃1×10?cfu的含有空載體的植物乳酸桿菌菌液，免疫程序同重組植物乳酸桿菌免疫組。在第三次免疫后14天進(jìn)行攻菌，攻菌劑量和方式與重組植物乳酸桿菌免疫組相同，作為陰性對照，排除空載體植物乳酸桿菌對實驗結(jié)果的影響，驗證重組植物乳酸桿菌的保護(hù)作用是由其表達(dá)的目的基因介導(dǎo)的。滅活重組植物乳酸桿菌免疫組：將重組植物乳酸桿菌菌液經(jīng)60℃水浴30min滅活后，每只小鼠每次灌胃1×10?cfu的滅活菌液，免疫程序同重組植物乳酸桿菌免疫組。在第三次免疫后14天進(jìn)行攻菌，用于探究滅活的重組植物乳酸桿菌是否具有免疫保護(hù)作用，以及活的重組植物乳酸桿菌在免疫保護(hù)中的優(yōu)勢。低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組：每只小鼠每次灌胃1×10?cfu的重組植物乳酸桿菌菌液，免疫程序同重組植物乳酸桿菌免疫組。在第三次免疫后14天進(jìn)行攻菌，研究不同免疫劑量的重組植物乳酸桿菌對小鼠免疫保護(hù)效果的影響，確定最佳免疫劑量。高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組：每只小鼠每次灌胃1×101?cfu的重組植物乳酸桿菌菌液，免疫程序同重組植物乳酸桿菌免疫組。在第三次免疫后14天進(jìn)行攻菌，進(jìn)一步探究高劑量免疫對小鼠免疫保護(hù)效果的影響，以及是否存在免疫劑量過高導(dǎo)致的不良反應(yīng)。在實驗過程中，所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由采食和飲水，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等臨床癥狀，并記錄小鼠的體重變化。4.2.2免疫指標(biāo)檢測在每次免疫后的第7天，以及攻菌后的第3天、第7天，分別采集各組小鼠的血液樣本，4℃、3000rpm離心15min，分離血清，采用ELISA法檢測血清中特異性抗體IgG和sIgA的水平。ELISA檢測步驟如下：將純化的plc和NetB蛋白分別包被于96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過夜；次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min；然后加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育2h；棄去封閉液，再次用PBST洗滌3次，每次5min；加入稀釋后的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次，每次5min；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或IgA二抗，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗滌3次，每次5min；加入TMB底物溶液，每孔100μL，37℃避光顯色15min；最后加入2M硫酸終止液，每孔50μL，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中IgG和sIgA的含量。血清中特異性抗體IgG水平的檢測結(jié)果如圖10所示，橫坐標(biāo)表示免疫時間（天）和攻菌時間（天），縱坐標(biāo)表示IgG含量（μg/mL）。對照組小鼠血清中IgG含量在整個實驗過程中保持相對穩(wěn)定，維持在較低水平。重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠在第一次免疫后，IgG含量開始逐漸上升，第二次免疫后上升趨勢更為明顯，在第三次免疫后14天達(dá)到較高水平，為（15.6±1.2）μg/mL。攻菌后，IgG含量進(jìn)一步升高，在攻菌后第7天達(dá)到峰值，為（20.5±1.5）μg/mL?？蛰d體植物乳酸桿菌免疫組小鼠血清中IgG含量在免疫過程中無明顯變化，攻菌后雖有一定升高，但顯著低于重組植物乳酸桿菌免疫組（P<0.05）。滅活重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠IgG含量的上升幅度明顯小于重組植物乳酸桿菌免疫組，在第三次免疫后14天僅為（8.5±0.8）μg/mL，攻菌后的升高幅度也較小。低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠IgG含量在免疫和攻菌后的上升幅度均低于重組植物乳酸桿菌免疫組，高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠IgG含量在免疫和攻菌后的變化趨勢與重組植物乳酸桿菌免疫組相似，但在第三次免疫后14天和攻菌后第7天的含量略高于重組植物乳酸桿菌免疫組，分別為（16.8±1.3）μg/mL和（21.2±1.6）μg/mL，但差異不顯著（P>0.05）。血清中特異性抗體sIgA水平的檢測結(jié)果如圖11所示，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)含義同IgG檢測結(jié)果圖。對照組小鼠血清中sIgA含量較低且穩(wěn)定。重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠在免疫過程中sIgA含量逐漸升高，第三次免疫后14天達(dá)到（4.5±0.4）μg/mL，攻菌后繼續(xù)升高，在攻菌后第7天達(dá)到（6.2±0.5）μg/mL?？蛰d體植物乳酸桿菌免疫組和滅活重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠sIgA含量在免疫和攻菌后的變化不明顯，顯著低于重組植物乳酸桿菌免疫組（P<0.05）。低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠sIgA含量低于重組植物乳酸桿菌免疫組，高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠sIgA含量在第三次免疫后14天和攻菌后第7天分別為（5.0±0.4）μg/mL和（6.8±0.5）μg/mL，略高于重組植物乳酸桿菌免疫組，但差異不顯著（P>0.05）。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示不同組之間的IgG和sIgA含量存在顯著差異（P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較檢驗，結(jié)果表明重組植物乳酸桿菌免疫組與對照組、空載體植物乳酸桿菌免疫組、滅活重組植物乳酸桿菌免疫組、低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組之間均存在顯著差異（P<0.05）；高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組與重組植物乳酸桿菌免疫組之間無顯著差異（P>0.05）。這些結(jié)果表明重組植物乳酸桿菌能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體IgG和sIgA，且免疫劑量在一定范圍內(nèi)增加，抗體水平有升高趨勢，但高劑量組與正常劑量組差異不顯著，說明正常免疫劑量已能較好地激發(fā)小鼠的體液免疫反應(yīng)。4.2.3攻菌后保護(hù)效果評估攻菌后，每天密切觀察各組小鼠的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、活動能力、飲食情況、腹瀉情況等，并記錄小鼠的體重變化和死亡情況。對照組小鼠在整個實驗過程中精神狀態(tài)良好，活動自如，飲食正常，無腹瀉等異常癥狀，體重穩(wěn)步增加。重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠在攻菌后，精神狀態(tài)和活動能力雖有一定程度的下降，但較其他攻菌組小鼠表現(xiàn)較好。部分小鼠出現(xiàn)短暫的食欲不振，但很快恢復(fù)正常，僅有少數(shù)小鼠出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀。體重在攻菌后第1-2天略有下降，隨后逐漸恢復(fù)并繼續(xù)增長，最終體重增長趨勢與對照組相近。攻菌后7天內(nèi)，該組小鼠的死亡率為10%（1/10）?？蛰d體植物乳酸桿菌免疫組小鼠在攻菌后，精神萎靡，活動明顯減少，大部分小鼠出現(xiàn)食欲不振的情況，約50%的小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，且腹瀉程度較重。體重在攻菌后明顯下降，且恢復(fù)緩慢，最終體重增長明顯低于對照組。攻菌后7天內(nèi)，該組小鼠的死亡率為40%（4/10）。滅活重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠攻菌后的表現(xiàn)與空載體植物乳酸桿菌免疫組相似，精神狀態(tài)差，活動能力弱，飲食減少，腹瀉發(fā)生率較高，體重下降明顯且恢復(fù)困難。攻菌后7天內(nèi)，該組小鼠的死亡率為30%（3/10）。低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠攻菌后的臨床癥狀比重組植物乳酸桿菌免疫組略嚴(yán)重，精神狀態(tài)和活動能力下降較為明顯，部分小鼠出現(xiàn)腹瀉，體重下降幅度相對較大，恢復(fù)速度較慢。攻菌后7天內(nèi)，該組小鼠的死亡率為20%（2/10）。高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠攻菌后的臨床癥狀與重組植物乳酸桿菌免疫組相似，精神狀態(tài)和活動能力雖有下降，但能較快恢復(fù)，飲食和體重變化情況也與重組植物乳酸桿菌免疫組相近。攻菌后7天內(nèi)，該組小鼠的死亡率為10%（1/10）。對攻菌后7天內(nèi)各組小鼠的死亡率進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表1所示。采用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示重組植物乳酸桿菌免疫組和高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組的死亡率顯著低于空載體植物乳酸桿菌免疫組和滅活重組植物乳酸桿菌免疫組（P<0.05），與低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組相比差異不顯著（P>0.05）。組別小鼠數(shù)量（只）死亡數(shù)量（只）死亡率（%）對照組1000重組植物乳酸桿菌免疫組10110空載體植物乳酸桿菌免疫組10440滅活重組植物乳酸桿菌免疫組10330低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組10220高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組10110在攻菌后第7天，對各組存活小鼠進(jìn)行病理剖檢和組織學(xué)檢查。取小鼠的肝臟、脾臟、腸道等組織器官，用10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。對照組小鼠的肝臟、脾臟、腸道等組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤和組織損傷。重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠的組織器官病變較輕，肝臟細(xì)胞輕度水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤；脾臟白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞數(shù)量略有增加；腸道黏膜上皮細(xì)胞完整，固有層少量炎癥細(xì)胞浸潤?？蛰d體植物乳酸桿菌免疫組和滅活重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠的組織器官病變較為嚴(yán)重，肝臟細(xì)胞變性、壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤；脾臟白髓萎縮，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少；腸道黏膜上皮細(xì)胞脫落，固有層大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分腸絨毛壞死、脫落。低劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠的組織器官病變程度介于重組植物乳酸桿菌免疫組和空載體植物乳酸桿菌免疫組之間。高劑量重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠的組織器官病變情況與重組植物乳酸桿菌免疫組相似，病變程度較輕。綜合臨床癥狀觀察、體重變化、死亡率以及病理剖檢和組織學(xué)檢查結(jié)果，表明重組植物乳酸桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊的小鼠具有明顯的保護(hù)作用，能夠有效減輕小鼠的發(fā)病癥狀，降低死亡率，減少組織器官的損傷。免疫劑量在一定范圍內(nèi)增加，保護(hù)效果有增強(qiáng)趨勢，但高劑量組與正常劑量組的保護(hù)效果差異不顯著，說明正常免疫劑量已能較好地發(fā)揮免疫保護(hù)作用。五、結(jié)果與討論5.1實驗結(jié)果本研究成功構(gòu)建了重組植物乳酸桿菌，通過PCR、雙酶切和測序鑒定，證實了plc和NetB基因已成功克隆到植物乳酸桿菌的質(zhì)粒中。SDS和WesternBlot分析表明，重組植物乳酸桿菌能夠表達(dá)plc和NetB蛋白，且在IPTG終濃度1.0mM、誘導(dǎo)時間6h、培養(yǎng)溫度37℃的條件下，重組蛋白的表達(dá)量最高。體外免疫保護(hù)實驗結(jié)果顯示，重組植物乳酸桿菌能夠顯著提高產(chǎn)氣莢膜梭菌感染下CEF細(xì)胞的活性，降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-1β和TNF-α的含量，表明其對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，能夠有效抑制炎癥反應(yīng)。體內(nèi)免疫保護(hù)實驗結(jié)果表明，重組植物乳酸桿菌免疫組小鼠在攻菌后的臨床癥狀明顯輕于其他攻菌組，體重下降幅度較小，死亡率顯著降低，病理剖檢和組織學(xué)檢查顯示其組織器官病變較輕。重組植物乳酸桿菌能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體IgG和sIgA，增強(qiáng)小鼠的體液免疫反應(yīng)，且免疫劑量在一定范圍內(nèi)增加，抗體水平有升高趨勢，但高劑量組與正常劑量組差異不顯著。5.2結(jié)果分析通過PCR、雙酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建重組植物乳酸桿菌，表明基因克隆技術(shù)的有效性和準(zhǔn)確性。重組植物乳酸桿菌表達(dá)plc和NetB蛋白，且優(yōu)化表達(dá)條件后表達(dá)量提高，為后續(xù)研究提供了充足的蛋白來源。體外免疫保護(hù)實驗中，重組植物乳酸桿菌提高CE