ICS07.080

CCSZ06

37

山東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB37/T4711—2024

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)

技術(shù)規(guī)程

CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarine

animalresources

2024-04-11發(fā)布2024-05-11實(shí)施

山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB37/T4711—2024

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4監(jiān)測(cè)程序...........................................................................1

5監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì).......................................................................2

6樣品采集、保存與運(yùn)輸...............................................................2

6.1采樣地點(diǎn).......................................................................2

6.2采樣數(shù)量及方法.................................................................2

6.3采樣記錄.......................................................................3

6.4樣品保存與運(yùn)輸.................................................................3

7樣品檢測(cè)...........................................................................3

7.1方法原理.......................................................................3

7.2DNA提取........................................................................3

7.3DNA質(zhì)量檢測(cè)....................................................................3

7.4引物選擇.......................................................................3

7.5DNA擴(kuò)增........................................................................4

7.6PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測(cè)定....................................................4

8質(zhì)量控制...........................................................................4

9數(shù)據(jù)分析...........................................................................4

10監(jiān)測(cè)報(bào)告..........................................................................4

附錄A（資料性）樣品采集記錄.........................................................5

附錄B（資料性）設(shè)備與試劑...........................................................6

B.1儀器設(shè)備與耗材.................................................................6

B.2試劑及其配制...................................................................6

附錄C（資料性）酚-氯仿法提取DNA....................................................7

附錄D（資料性）瓊脂糖凝膠電泳.......................................................8

附錄E（資料性）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系.....................................................9

附錄F（資料性）檢測(cè)記錄............................................................10

參考文獻(xiàn).............................................................................11

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由山東省海洋局提出并組織實(shí)施。

本文件由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

II

DB37/T4711—2024

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件確立了海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)程序，規(guī)定了監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保

存與運(yùn)輸、樣品檢測(cè)、質(zhì)量控制、監(jiān)測(cè)報(bào)告等技術(shù)要求，描述了數(shù)據(jù)分析方法。

本文件適用于海洋動(dòng)物資源的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查

GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

遺傳多樣性geneticdiversity

種內(nèi)不同群體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。

4監(jiān)測(cè)程序

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)程序包括監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢

測(cè)、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測(cè)報(bào)告，程序見(jiàn)圖1。

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圖1監(jiān)測(cè)程序圖

5監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)

明確監(jiān)測(cè)海域、監(jiān)測(cè)周期、監(jiān)測(cè)時(shí)間、樣品采集、保存和運(yùn)輸、樣品檢測(cè)方法、監(jiān)測(cè)指標(biāo)、質(zhì)量控

制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測(cè)報(bào)告等。其中，對(duì)調(diào)查海域某種野生海洋動(dòng)物資源的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)，宜每5年～

10年開展1次；對(duì)人工增殖物種宜每年開展1次。

6樣品采集、保存與運(yùn)輸

6.1采樣地點(diǎn)

采樣地點(diǎn)可根據(jù)調(diào)查需求選擇：

a)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：按GB/T12763.6規(guī)定執(zhí)行。對(duì)海洋底棲動(dòng)物、潮間帶動(dòng)物進(jìn)行定點(diǎn)采樣，對(duì)

移動(dòng)迅速的底棲動(dòng)物可設(shè)地籠誘捕。對(duì)游泳能力強(qiáng)的魚類、甲殼類等進(jìn)行拖網(wǎng)采樣；

b)非現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：從調(diào)查海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場(chǎng)直接采集來(lái)自目標(biāo)海域的新鮮漁獲物，

采樣方法按GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。

6.2采樣數(shù)量及方法

按形態(tài)學(xué)分類后，每個(gè)調(diào)查海域應(yīng)采集同一物種30個(gè)以上獨(dú)立個(gè)體作為一批樣品；保護(hù)動(dòng)物和珍稀

瀕危動(dòng)物難以達(dá)到該數(shù)量的，可積累該海域一定時(shí)期內(nèi)多次調(diào)查采集的不同個(gè)體，以實(shí)際采集到的個(gè)體

數(shù)為準(zhǔn)。根據(jù)監(jiān)測(cè)對(duì)象不同，可分別選擇以下采樣方法：

a)通常采取海洋動(dòng)物整體；

b)對(duì)大型海洋動(dòng)物實(shí)行部分采樣，取肌肉組織約0.5g；

c)對(duì)海洋保護(hù)動(dòng)物、珍稀瀕危生物實(shí)行非致死性采樣：

2

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視監(jiān)測(cè)生物的具體情況，無(wú)菌操作剪取部分魚類鰭條組織約0.1g，或用無(wú)菌注射器于尾

靜脈處抽取血液約0.5mL；

貝類無(wú)菌取小部分外套膜組織；

蟹類用無(wú)菌注射器從第3步足基節(jié)關(guān)節(jié)膜處刺入抽取血淋巴0.1mL。

6.3采樣記錄

采集的每批樣品分別填寫樣品采集記錄，格式參見(jiàn)附錄A。

6.4樣品保存與運(yùn)輸

整體采樣的個(gè)體應(yīng)保持完整；部分采樣的組織應(yīng)每個(gè)個(gè)體獨(dú)立包裝。采樣后宜立即冷凍保存，不具

備冷凍條件的4℃～10℃冷藏，冷藏時(shí)間不宜超過(guò)24h。樣品運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)保證溫度在10℃以下。體積

小于1cm3的樣品或組織，可量取加入10倍以上體積的乙醇（95%以上）或商品化的樣品保存溶液浸泡，

常溫保存與運(yùn)輸。

7樣品檢測(cè)

7.1方法原理

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic

acid，DNA）測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)海洋動(dòng)物線粒體DNA中進(jìn)化速度最快的部分序列，通常

采用線粒體控制區(qū)（D-loop）序列，不適用D-loop序列的物種可采用細(xì)胞色素b（cytochromeb，Cytb）、

細(xì)胞色素氧化酶I（CytochromeoxidaseI，COI）基因或其他線粒體基因序列，進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分

析，獲得群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。

7.2DNA提取

取海洋動(dòng)物肌肉或鰭條組織約0.1g，液氮冷凍研磨、組織勻漿或剪碎后，用酚-氯仿法或動(dòng)物組織

DNA提取試劑盒提取總DNA；血液樣品用血液DNA提取試劑盒提取總DNA。樣品檢測(cè)所用設(shè)備和試劑參見(jiàn)附

錄B。酚-氯仿法提取DNA的步驟參見(jiàn)附錄C；用商品化試劑盒提取DNA，操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

7.3DNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的DNA用洗脫液或滅菌雙蒸水溶解，取5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量，電泳方法參

見(jiàn)附錄D，或取適量DNA溶液用核酸定量分析儀測(cè)定，A260/A280比值為1.8～2.0，DNA濃度不低于50ng/

μL。經(jīng)檢測(cè)DNA質(zhì)量良好后，-20℃以下冷凍備用。

7.4引物選擇

7.4.1引物設(shè)計(jì)與合成

引物宜引用已公開發(fā)表學(xué)術(shù)論文或研究報(bào)告，或在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索目標(biāo)物種的線粒體DNA序列自

行設(shè)計(jì)2對(duì)～3對(duì)，引物宜符合Tm值50℃～60℃、長(zhǎng)度18bp～24bp、G+C含量在40%～60%、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

400bp～600bp。引物序列通過(guò)DNA序列比對(duì)工具與目的序列比對(duì)驗(yàn)證，檢查校正無(wú)誤后合成。

7.4.2引物篩選

3

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用合成的引物對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。按每對(duì)引物的Tm值設(shè)定退火溫度，按7.5.2進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)

1%的瓊脂糖凝膠電泳后，選擇PCR產(chǎn)物條帶單一、清晰、且長(zhǎng)度與預(yù)期一致的引物，作為該物種的遺傳

多樣性監(jiān)測(cè)引物。

7.5DNA擴(kuò)增

7.5.1PCR反應(yīng)液配方參見(jiàn)附錄E。

7.5.2PCR反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，X℃退火30s（其中X視不同引物的具體Tm

值確定），72℃延伸30s～60s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。

7.6PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測(cè)定

對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，選擇單一、清晰、且長(zhǎng)度與預(yù)期一致

的條帶，回收純化目的片段后測(cè)序，或PCR產(chǎn)物直接雙向測(cè)序。

8質(zhì)量控制

每批PCR應(yīng)同時(shí)做空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照，模板依次為無(wú)菌超純水、近源種總DNA溶液、目標(biāo)物種總

DNA溶液。

瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，每排樣品中至少要同時(shí)加一個(gè)合適的DNA分子量梯度標(biāo)準(zhǔn)品。

9數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、剪切和聚類分析，用最大合成似然法（MaximumCompositeLikelihood，MCL）

計(jì)算群體間或群體內(nèi)個(gè)體間遺傳距離，計(jì)算單倍體多樣性（樣本中隨機(jī)抽取到兩個(gè)不同單倍型的頻率）、

平均核苷酸變異數(shù)（所有個(gè)體的核苷酸變異數(shù)之和與個(gè)體數(shù)的比值）、核苷酸多樣性（平均核苷酸差異

數(shù)與序列長(zhǎng)度的比值）等遺傳多樣性數(shù)據(jù)。分析結(jié)果格式參見(jiàn)附錄F。

10監(jiān)測(cè)報(bào)告

監(jiān)測(cè)報(bào)告的內(nèi)容應(yīng)包括前言、項(xiàng)目概況、每種生物的監(jiān)測(cè)結(jié)果、與歷史記錄比較變化情況、遺傳多

樣性保護(hù)存在的問(wèn)題及保護(hù)建議等。

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A

A

附錄A

（資料性）

樣品采集記錄

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)采樣記錄見(jiàn)表A.1。

表A.1樣品采集記錄表

種名樣品編號(hào)

樣品數(shù)量樣品規(guī)格

采樣時(shí)間

樣品捕撈海域

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：定點(diǎn)；地籠；拖網(wǎng)

采樣方式

非現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣

經(jīng)度：緯度：

采樣地點(diǎn)

碼頭/市場(chǎng)

樣品組織整體；肌肉；血液；鰭條；其他：

樣品外觀鮮活；新鮮；變質(zhì)

保存方式活體；冷凍；冰鮮；常溫；其他：

備注

采樣人：復(fù)核人：

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B

B

附錄B

（資料性）

設(shè)備與試劑

B.1儀器設(shè)備與耗材

儀器設(shè)備與耗材應(yīng)符合以下要求：

a)高壓蒸汽滅菌器；

b)電子天平：精度大于等于0.001g；

c)高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min；

d)移液器：1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL；

e)PCR儀；

f)水平凝膠電泳系統(tǒng)；

g)凝膠成像系統(tǒng)；

h)核酸定量分析儀；

i)無(wú)菌離心管：1.5mL、0.2mL；

j)無(wú)菌移液器吸頭：1000μL、200μL、10μL。

B.2試劑及其配制

除特別說(shuō)明外，本文使用試劑均為分析純?cè)噭渲圃噭┯盟畱?yīng)為滅菌雙蒸水或去離子水。所需試

劑及配制方法如下：

a)蛋白酶K（20mg/mL）；

b)十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液：CTAB20g溶于1000mLTE緩沖液（Tris-HCl1mol/L，

EDTA0.5mol/L，pH=8.0），高壓滅菌備用；

c)乙醇：75%、95%以上；

d)Taq酶；

e)脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）；

f)PCR緩沖液；

g)瓊脂糖；

h)核酸染料；

i)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；

j)6×上樣緩沖液；

k)Tris飽和酚（pH=8.0）；

l)三氯甲烷；

m)TBE緩沖液：Tris108g，EDTA-Na27.44g，硼酸55g，加去離子水1000mL。

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C

C

附錄C

（資料性）

酚-氯仿法提取DNA

C.1在1.5mL塑料離心管中加入研磨或剪碎的樣品組織約100mg，加入CTAB溶液600μL、蛋白酶K

溶液（20mg/mL）10μL，混勻后55℃水浴3h或37℃水浴過(guò)夜，期間顛倒混勻幾次，至消化液澄清。

C.2加入苯酚-氯仿（1:1）溶液500μL，顛倒混勻1min，12000rpm離心5min，吸取上清液500μ

L至另一支潔凈離心管內(nèi)。

C.3重復(fù)B.2操作一次。

C.4加入氯仿500μL，顛倒混勻30s，12000rpm離心5min，吸取上清液400μL至另一支潔凈離心

管內(nèi)。

C.5加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，-20℃冷凍過(guò)夜。

C.612000rpm離心5min，倒掉上清液。

C.7加75%乙醇500μL，顛倒清洗，12000rpm離心3min，倒掉上清液。

C.8重復(fù)B.7操作一次。

C.912000rpm瞬時(shí)離心，用200μL移液器小心吸出管底殘留溶液，注意不要吸走管底沉淀。

C.10離心管開口放于潔凈的環(huán)境中，自然干燥15min～30min。

C.11加入100μL滅菌雙蒸水充分溶解，備用。

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D

D

附錄D

（資料性）

瓊脂糖凝膠電泳

D.1用1×TBE緩沖液制備1%～1.5%的瓊脂糖凝膠，以1:10000（體積比）加入核酸染料。

D.2取5μL需要檢測(cè)的DNA，與1μL6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣。用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)做參照。

D.30.5×TBE緩沖液中，100V～120V恒壓電泳30min左右。

D.4凝膠移入凝膠成像系統(tǒng)，254nm紫外光透射下拍照記錄并分析。

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E

E

附錄E

（資料性）

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配方見(jiàn)表E.1.

表E.1PCR體系配方表

DNA模板50ng～100ng

10倍擴(kuò)增緩沖液2.5μL

MgCl2(25mmol/L)2.0μL

dNTP(10mmol/L)0.5μL

引物f(50pmol/μL)0.5μL

引物r(50pmol/μL)0.5μL

Taq酶(5U/μL)0.2μL

加無(wú)菌超純水配制成25μL的反應(yīng)體系

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F

F

附錄F

（資料性）

檢測(cè)記錄

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性檢測(cè)記錄見(jiàn)表F.1。

表F.1檢測(cè)記錄表

樣品名稱樣品編號(hào)

樣品數(shù)量

引物序列

目的序列長(zhǎng)度（bp）

單倍型1

DNA序列