瘧原蟲檢測(cè)培訓(xùn)演講人：2025-09-12CATALOGUE目錄01引言與背景02檢測(cè)方法概述03樣本采集與處理04顯微鏡檢查技術(shù)05快速診斷測(cè)試操作06結(jié)果報(bào)告與質(zhì)量控制01引言與背景瘧疾流行病學(xué)概況瘧疾主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，撒哈拉以南非洲、東南亞和拉丁美洲是高發(fā)區(qū)，其中非洲地區(qū)占全球瘧疾病例和死亡人數(shù)的90%以上，兒童和孕婦是易感高危人群。全球流行分布瘧疾通過按蚊叮咬傳播，流行強(qiáng)度與蚊媒密度、氣候條件密切相關(guān)，雨季通常是瘧疾暴發(fā)的高峰期，溫度和濕度變化直接影響蚊蟲生命周期和瘧原蟲發(fā)育。傳播媒介與季節(jié)特征瘧疾導(dǎo)致勞動(dòng)力損失、醫(yī)療負(fù)擔(dān)加重，每年造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約流行地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生體系建設(shè)。社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響瘧原蟲生物學(xué)特性病原體分類與生活史瘧原蟲屬頂復(fù)門原蟲，包括間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，其生活史涉及人體（肝細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育）和蚊體（有性繁殖）兩個(gè)宿主階段?？乖儺惻c免疫逃逸瘧原蟲表面蛋白（如PfEMP1）具有高度變異性，可逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別，導(dǎo)致重復(fù)感染和慢性病程，增加防控難度。紅細(xì)胞內(nèi)期致病機(jī)制瘧原蟲侵入紅細(xì)胞后通過裂殖增殖導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，釋放毒素和代謝產(chǎn)物，引發(fā)周期性發(fā)熱、貧血及多器官損傷，惡性瘧原蟲還可引起腦型瘧等嚴(yán)重并發(fā)癥。早期診斷與治療通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)追蹤瘧疾流行趨勢(shì)、評(píng)估防控措施效果（如蚊帳分發(fā)、藥物干預(yù)），為公共衛(wèi)生決策提供科學(xué)依據(jù)。流行病學(xué)監(jiān)測(cè)消除瘧疾的基石在高傳播區(qū)，無(wú)癥狀帶蟲者的檢測(cè)和根治是阻斷傳播鏈的關(guān)鍵；在消除階段，靈敏的檢測(cè)技術(shù)可發(fā)現(xiàn)隱匿病例，鞏固消除成果。準(zhǔn)確檢測(cè)瘧原蟲可區(qū)分瘧疾類型（如惡性瘧與間日瘧），指導(dǎo)抗瘧藥物選擇，避免延誤治療或?yàn)E用藥物導(dǎo)致的耐藥性，降低重癥和死亡風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)的必要性和意義02檢測(cè)方法概述薄血膜用于觀察瘧原蟲形態(tài)特征，厚血膜用于提高檢出率，兩者結(jié)合可提高診斷準(zhǔn)確性。血膜需經(jīng)吉姆薩染色后鏡檢，染色時(shí)間、pH值及溫度均影響結(jié)果。顯微鏡檢查原理薄血膜與厚血膜制備通過觀察紅細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲的環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體及配子體等發(fā)育階段，結(jié)合蟲體大小、色素顆粒分布等特征，可區(qū)分間日瘧、惡性瘧等蟲種。瘧原蟲形態(tài)學(xué)鑒別需定期校準(zhǔn)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，操作人員需通過能力驗(yàn)證，每張玻片應(yīng)由兩名檢驗(yàn)人員雙盲復(fù)核，寄生蟲密度需采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)方法（如WHO推薦的白細(xì)胞比值法）。鏡檢質(zhì)量控制要求靶向瘧原蟲特異性代謝酶，可區(qū)分活蟲感染，但對(duì)不同蟲種的pLDH亞型敏感性存在差異，需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)解讀結(jié)果?？焖僭\斷測(cè)試類別瘧原蟲乳酸脫氫酶（pLDH）檢測(cè)針對(duì)惡性瘧原蟲的特異性抗原，靈敏度高但存在抗原滯留現(xiàn)象（治愈后數(shù)周仍可陽(yáng)性），不適用于療效監(jiān)測(cè)。組氨酸富集蛋白2（HRP-2）檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)HRP-2/pLDH/Pan-malarial抗原，可提高混合感染檢出率，但需注意不同品牌試劑的檢測(cè)閾值差異及熱帶地區(qū)高溫對(duì)試紙條穩(wěn)定性的影響。多抗原聯(lián)合檢測(cè)試劑分子檢測(cè)技術(shù)下一代測(cè)序（NGS）應(yīng)用全基因組測(cè)序可用于溯源分析、抗藥性突變篩查及新發(fā)蟲株監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)分析需建立本地化瘧原蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以提升比對(duì)準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)采用18SrRNA基因保守區(qū)引物，可檢測(cè)低至0.5-5寄生蟲/μL的樣本，兼具蟲種鑒別和耐藥基因檢測(cè)功能，但需嚴(yán)格防污染措施及內(nèi)參基因質(zhì)量控制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）在恒溫條件下擴(kuò)增瘧原蟲線粒體DNA，適用于基層實(shí)驗(yàn)室，結(jié)果可通過濁度儀或顯色法判讀，但引物設(shè)計(jì)需避開人類基因組同源序列。03樣本采集與處理樣本標(biāo)識(shí)與記錄立即在采血管或玻片上標(biāo)注患者唯一編碼，同步填寫采樣時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目等信息，確保樣本可追溯性。采血部位消毒使用75%酒精棉球?qū)颊咧讣饣蚨惯M(jìn)行徹底消毒，確保采血區(qū)域無(wú)污染，避免樣本交叉感染。規(guī)范采血操作使用一次性采血針快速刺破皮膚，棄去第一滴血后，用毛細(xì)管或載玻片采集適量血液，避免過度擠壓導(dǎo)致組織液混入。血液樣本標(biāo)準(zhǔn)采集步驟樣本保存與運(yùn)輸規(guī)范短期保存條件若樣本需在6小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，應(yīng)置于4℃冷藏環(huán)境；超過6小時(shí)則需添加抗凝劑（如EDTA）并冷凍保存于-20℃以下。運(yùn)輸包裝要求運(yùn)輸過程中使用電子溫度記錄儀全程監(jiān)控，確保冷鏈不斷鏈，到貨后需驗(yàn)收溫度記錄數(shù)據(jù)。采用三重包裝系統(tǒng)（內(nèi)層防漏容器、中層吸水材料、外層硬質(zhì)運(yùn)輸箱），并附生物危險(xiǎn)標(biāo)識(shí)，符合國(guó)際生物安全運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)。溫度監(jiān)控措施實(shí)驗(yàn)室前處理流程樣本接收核查核對(duì)樣本標(biāo)簽信息與申請(qǐng)單一致性，檢查樣本量、溶血、凝血等情況，拒收不合格樣本并記錄原因。離心分離處理對(duì)全血樣本以3000rpm離心10分鐘，分離血漿與血細(xì)胞層，避免反復(fù)離心導(dǎo)致細(xì)胞破裂影響鏡檢結(jié)果。染色液配制標(biāo)準(zhǔn)化按比例配制吉姆薩染液（pH7.2磷酸緩沖液:染液=9:1），現(xiàn)配現(xiàn)用，避免沉淀影響染色效果。04顯微鏡檢查技術(shù)使用潔凈載玻片，取適量血液均勻推片，確保血膜薄而均勻，便于后續(xù)染色和鏡檢。推片角度和速度需控制得當(dāng)，避免血膜過厚或出現(xiàn)條紋。薄血膜制備技術(shù)取較大血量集中滴于載玻片，用另一玻片角旋轉(zhuǎn)涂布成圓形厚血膜。厚血膜需充分干燥，避免溶血不徹底影響染色效果。厚血膜制備要點(diǎn)薄血膜需用無(wú)水甲醇固定，厚血膜則不需固定直接染色。固定時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，避免過度固定導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。血膜固定方法010203涂片制備與優(yōu)化吉姆薩染色標(biāo)準(zhǔn)流程染色液濃度和pH值需精確控制，染色時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致血膜過染。染色后需快速用流水沖洗，防止脫色不均。瑞氏染色注意事項(xiàng)快速染色法應(yīng)用在緊急檢測(cè)時(shí)可采用改良快速染色法，通過調(diào)整染色液溫度和濃度縮短染色時(shí)間，但需保證染色質(zhì)量不受影響。染色液需新鮮配制，染色時(shí)間根據(jù)室溫調(diào)整。染色后需用緩沖液充分沖洗，避免染料沉淀干擾鏡檢。染色方法與技巧形態(tài)學(xué)識(shí)別關(guān)鍵點(diǎn)01需掌握環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體和配子體各階段的典型形態(tài)特征，包括細(xì)胞大小、染色特性、色素顆粒分布等細(xì)節(jié)。間日瘧原蟲與惡性瘧原蟲的鑒別需重點(diǎn)關(guān)注受染紅細(xì)胞大小變化、薛氏點(diǎn)存在與否以及環(huán)狀體數(shù)量等關(guān)鍵差異。需注意與血小板、染色顆粒等常見干擾物的區(qū)分，通過調(diào)節(jié)顯微鏡焦距和光源強(qiáng)度提高辨識(shí)準(zhǔn)確性。0203瘧原蟲發(fā)育階段特征蟲種鑒別要點(diǎn)干擾因素排除技巧05快速診斷測(cè)試操作樣本采集與處理使用無(wú)菌采血針采集指尖血，確保血量充足且無(wú)氣泡混入，將血液滴入測(cè)試卡樣本孔時(shí)需避免污染其他區(qū)域。試劑添加與反應(yīng)按說明書要求滴加緩沖液，確保液體完全覆蓋反應(yīng)膜，避免過量或不足導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。等待時(shí)間控制嚴(yán)格遵循制造商規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間（通常為15-20分鐘），過早或過晚判讀均可能影響準(zhǔn)確性。廢棄物處理使用后的采血針、測(cè)試卡等需按生物危害廢物規(guī)范處置，防止交叉感染或環(huán)境污染。RDT使用步驟詳解檢測(cè)線（T線）與質(zhì)控線（C線）同時(shí)顯色，且T線顏色強(qiáng)度與瘧原蟲載量呈正相關(guān)，需結(jié)合臨床癥狀綜合評(píng)估。僅C線顯色表明無(wú)瘧原蟲抗原檢出，但需排除高寄生蟲血癥導(dǎo)致的“前帶效應(yīng)”或試劑失效可能。若C線未顯色，無(wú)論T線是否出現(xiàn)，均需重新檢測(cè)，可能因操作失誤、試劑過期或存儲(chǔ)不當(dāng)導(dǎo)致。T線微弱顯色時(shí)，建議重復(fù)檢測(cè)或采用顯微鏡鏡檢復(fù)核，避免漏診低密度感染病例。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性結(jié)果特征陰性結(jié)果確認(rèn)無(wú)效結(jié)果處理弱陽(yáng)性鑒別常見錯(cuò)誤規(guī)避環(huán)境溫濕度影響測(cè)試應(yīng)在室溫（15-30℃）下進(jìn)行，高溫或高濕環(huán)境可能加速試劑降解或膜層析異常。存儲(chǔ)條件不當(dāng)未開封試劑應(yīng)避光保存于干燥環(huán)境，開封后需密封防潮，冷凍或高溫存放會(huì)破壞抗體活性。樣本量不足或過量嚴(yán)格使用配套毛細(xì)管或滴管控制血量，避免因樣本量偏差導(dǎo)致假陰性或背景模糊。交叉污染風(fēng)險(xiǎn)同一批次檢測(cè)多個(gè)樣本時(shí)，需更換手套并清潔操作臺(tái)面，防止血液或緩沖液污染相鄰測(cè)試卡。06結(jié)果報(bào)告與質(zhì)量控制陽(yáng)性/陰性報(bào)告格式陰性報(bào)告規(guī)范要求需包含樣本信息、檢測(cè)方法、復(fù)核人員簽名，并注明“未檢出瘧原蟲”或“檢測(cè)結(jié)果陰性”，同時(shí)建議結(jié)合臨床癥狀和其他檢測(cè)結(jié)果綜合判斷。03臨界值處理原則對(duì)于低密度感染或結(jié)果模糊的樣本，應(yīng)在報(bào)告中注明“建議復(fù)檢”或“結(jié)合臨床評(píng)估”，避免漏診或誤診。0201標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性報(bào)告內(nèi)容明確標(biāo)注樣本編號(hào)、檢測(cè)方法、瘧原蟲種類（如惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲等）、蟲體密度（如每微升血液中的寄生蟲數(shù)量），并附上顯微鏡檢圖像或分子檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖作為輔助證據(jù)。數(shù)據(jù)記錄與存檔電子化記錄系統(tǒng)數(shù)據(jù)復(fù)核流程紙質(zhì)檔案管理采用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）錄入檢測(cè)數(shù)據(jù)，確保樣本編號(hào)、檢測(cè)時(shí)間、操作人員、試劑批號(hào)等信息完整可追溯，并設(shè)置自動(dòng)備份功能防止數(shù)據(jù)丟失。保留原始檢測(cè)申請(qǐng)單、顯微鏡檢記錄表、分子檢測(cè)原始數(shù)據(jù)打印件等，按樣本編號(hào)分類存檔，存放于防潮防火的專用檔案室，保存期限符合行業(yè)規(guī)定。每批次檢測(cè)需由第二人獨(dú)立復(fù)核原始記錄與報(bào)告一致性，復(fù)核結(jié)果需簽字確認(rèn)并存檔，確保數(shù)據(jù)真實(shí)性和可追溯性。質(zhì)量保證機(jī)制人員能力評(píng)估每季度對(duì)檢測(cè)人員開展盲樣考核和