草莓脫毒種苗病毒檢測技術規(guī)程2016-09-04實施2016-09-04實施新疆維吾爾自治區(qū)質量技術監(jiān)督局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》給出的規(guī)則起草。本標準由新疆生產建設兵團第十二師農業(yè)科學研究所提出。本標準由新疆維吾爾自治區(qū)農業(yè)廳歸口。本標準起草單位：新疆生產建設兵團第十二師農業(yè)科學研究所、新疆維吾爾自治區(qū)標準化研究院。本標準主要起草人：史芳芳、汪泉、李向泉、郭艷、陳曉坤、胡曉愍、哈里旦、向征。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。DB33/T594.1-2005草莓脫毒種苗第1部分：脫毒種苗脫毒草莓母本株virus-freestr2花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測法(見附錄A),檢驗結果記錄見附錄B。37.2各類種苗病株病毒允許率：a)脫毒草莓母本株：病毒病株允許率是0;b)脫毒草莓種苗：病毒病株允許率≤5.0%。4(規(guī)范性附錄)反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測程序A.1溶液配制所用化學試劑為分析純級規(guī)格。所用試劑用0.1%(1mLDEPC+999mL蒸餾水)的DEPC處理水配制，并進行高溫高壓滅菌。A.2試劑配制A.2.12×CTAB提取液(PH8.0):2%CTAB,1.4MNaCl,0.02MEDTA-2Na,0.1MTris-HCl,0.2%mL和5MNaCl28mL,待CTAB溶解后用DEPC水定容到100mL(提取前加入2%的巰基乙醇，100mL加0.2mL巰基乙醇)。A.2.21MTris-HC1(pH8.0)100mL:12.11gTris;DEPC水，80mL;HCl,4.9mL三者混勻充分溶解后，滴加濃鹽酸調pH至8.0,定容至100mL。H至8.0(約2gNaOH顆粒),定容至100mL。A.2.53MNaAc10mL:稱取2.46gNaAc,用DEPC水定容到10mL(pH5.2)。A.3模板核酸(包括RNA和DNA)的制備A.3.1稱取1g幼嫩的葉片，在研缽中加入液氮預冷，將葉片放到液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉溶液(用前加入2%的巰基乙醇),將裝A.3.2冷卻后，加入500μL的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1),混勻，12000rpm,離心15min,吸上清，裝入一新的EP管。A.3.3加入500μL氯仿：異戊醇(24:1),12000rpm。離心15min吸上清，轉入一新的離心管中。A.3.4加入1/10體積的NaAc(3mol/1),1mL-20℃預冷的無水乙醇，反復顛倒數次，混勻后置于-20℃(-80℃,30min)3h-4h,1200A.3.5向離心管中加入75%的乙醇洗滌2次~3次，置于吸水紙上倒置晾干。A.4RT-PCR(一步法)反應體系見表1。5DB65/T3915.2016反應試劑反應體積10*PCR緩沖液M-MuLVRT引物總RNA總體積45℃30min;預變性94℃5min;94℃30s,55℃30s,68℃1.5min,35個循環(huán)；72℃延伸10min;A.5.3.1SVBV(草莓鑲脈病GAATGGGACAATGAAATGAG(SenseAACCTGTTTCTAGCTTCTTG(AntisensepCCGCTGCAGTTGTAGGGTA(Senseprimer)CATGGCACTCATTGGAGCTGGG(Antisensprimer)TAAGCGACCACGACTGTGACAATCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG(6A.5.3.4SCV(草莓皺縮病毒)345bpCATTGGTGGCAGACCCATCA(SenTTCAGGACCTATTTGATGACA(Antisenseprimer)7(規(guī)范性附錄)草莓脫毒苗病毒檢驗報告送樣單位：品種名稱：原種采集地：送樣時間：編號草莓斑駁病毒(SMo