紅葉石楠耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離及其16SrDNA鑒定摘要：目的研究耐鉛重金屬植物內(nèi)生菌（Endophyticbacteria）的生理機(jī)制和生物學(xué)特點(diǎn)，為土壤環(huán)境中重金屬的去除提供科學(xué)理論依據(jù)。方法本研究采用脅迫培養(yǎng)、分離等方法，用不同鉛濃度培養(yǎng)基對(duì)從鉛脅迫的紅葉石楠根、莖、葉不同部位，分離出耐鉛內(nèi)生細(xì)菌并純化，不同的耐鉛內(nèi)生細(xì)菌菌株的形態(tài)特征及生長特點(diǎn)，并對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行生理生化特征分析，從而進(jìn)一步提取內(nèi)生菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得16SrDNA序列進(jìn)行初步核酸鑒定。結(jié)果經(jīng)過分離純化得到44株內(nèi)生細(xì)菌，都為革蘭氏陽性菌，并觀察到其單菌落為：菌落呈圓形，乳白色，輪廓光滑，中央稍微凸起，便于接種。提取菌株的cDNA及其16SrDNA序列，結(jié)合生理生化特征及其16SrDNA序列分析，并通過BLAST比對(duì)分析方式，利用MEGA軟件建立發(fā)育樹等分子鑒定手段，初步推斷本實(shí)驗(yàn)分離得到的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌PS43是賴氨酸桿菌屬（Lysinibacillus）。關(guān)鍵詞：紅葉石楠;耐鉛內(nèi)生細(xì)菌;生理生化鑒定；16SrDNA鑒定1前言1.1紅葉石楠紅葉石楠（Photiniaserrulata）是薔薇科石楠屬雜交種的統(tǒng)稱，以常綠小喬木或灌木為主，其葉片為革質(zhì)，長橢圓形至倒卵披針形，新老葉分別呈現(xiàn)紅色、青綠色[1]。枝干易修剪成各種形狀，常做為園林設(shè)計(jì)首選植株。紅葉石楠的桐油在工業(yè)生產(chǎn)上具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還具有殺蟲的功效。紅葉石楠的根葉具有一定的醫(yī)藥研究價(jià)值，有助于祛風(fēng)濕

、強(qiáng)筋骨、益肝腎、抑菌的作用。紅葉石楠作為環(huán)境綠化樹種常常成為馬路兩旁綠化的首選，而汽車尾氣的大量排放使路邊土壤受到一定程度的鉛污染，此植株可常年正常生長，可見其具有耐鉛的能力。1.2鉛污染現(xiàn)狀近些年，因?yàn)橛袊艺叩闹С?，我國工農(nóng)業(yè)發(fā)展疾速，在給人民生活帶來方便的同時(shí)也為我國GDP的增長奉獻(xiàn)不少力量。但在發(fā)展迅速的工農(nóng)業(yè)背后對(duì)天然環(huán)境與生態(tài)平衡的毀壞也逐步展現(xiàn)出來，因?yàn)槿鄙購?qiáng)制性的國家規(guī)范，局部企業(yè)只重視經(jīng)濟(jì)效益漠視生態(tài)環(huán)境保護(hù)，在生產(chǎn)發(fā)展過程產(chǎn)生的廢棄物直接排放到水體和土壤中，對(duì)水土造成污染，而危害性較大、現(xiàn)象將為明顯的污染問題是土壤的重金屬污染。土壤中多種重金屬通過食物能量流動(dòng)直接或者間接地?fù)p害人民的健康，故怎樣能更好地解決重金屬污染造成的系列危害已是目前國家、群眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

據(jù)報(bào)道，每年全球鉛用量約5×106噸，能夠回收利用的約25%，可見鉛污染的嚴(yán)峻形勢(shì)[2]。并且隨著民生水平的提高，汽車購買量劇增，尾氣大量排放加重了鉛土壤污染程度。鉛土壤污染不僅對(duì)土壤的理化性質(zhì)造成難以修復(fù)的破壞，使植株難以生長減少耕地面積；而且通過食物鏈會(huì)引發(fā)人體貧血、溶血、生殖系統(tǒng)性能下降等疾病，還是一種極可能的致癌物質(zhì)。而且土壤一旦受到污染后，不經(jīng)過人工恢復(fù)處理而僅依靠自身的自然凈化能力對(duì)污染物去除的過程具有周期漫長性和效果有限性?？梢姡U污染的危害性日愈突出，鉛土壤修復(fù)的路仍漫長而艱難，鉛污染治理已成為人類想要健康生產(chǎn)生活的重要問題。1.3修復(fù)土壤鉛污染研究進(jìn)展修復(fù)土壤鉛污染的方式有電化學(xué)處理、化學(xué)沉淀、離子交換、反滲透、氧化還原、膜技術(shù)等物理化學(xué)方式及利用微生物、植物富集等生物修復(fù)方式。目前有研究單一一種修復(fù)方式的修復(fù)。例如：負(fù)載植物微生物的活性營養(yǎng)土生物修復(fù)方式，羥基磷灰石、巰基煤矸石對(duì)壤中重金屬的鈍化修復(fù)，使用磷酸亞鐵銨固化劑使土壤重金屬鉛形成鹽類沉淀物的固化法修復(fù)，采用磷酸渣進(jìn)行離子交換修復(fù)方式，使用植物根系分泌物進(jìn)行鉛污染修復(fù)等等[3-5]。也有研究復(fù)合的修復(fù)方式，復(fù)合方式通過取長補(bǔ)短增強(qiáng)修復(fù)土壤鉛污染的能力。例如：可溶性有機(jī)質(zhì)（DOM）與生物炭結(jié)合使用使其對(duì)鉛的吸附容量增加，堆肥菌糠與生物吸附劑結(jié)合使用提升對(duì)鉛離子的去除能力并增加沉淀機(jī)制，利用殼聚糖基為螯合劑或添加復(fù)合型植物活化劑強(qiáng)化植物修復(fù)能力，利用納米材料（納米羥基磷石）與植物聯(lián)合修復(fù)方式等[6-8]。通過眾多研究文獻(xiàn)，可以看出使用合適的結(jié)合物進(jìn)行鉛污染復(fù)合修復(fù)的方式更有利于土壤鉛污染的去除，加快鉛污染的土壤恢復(fù)速度，是一個(gè)修復(fù)土壤鉛污染的研究方向。1.4研究意義目前，全球鉛污染日趨嚴(yán)重且鉛污染對(duì)人體健康造成危害，故尋找最佳治理鉛污染的方法是迫在眉睫的問題。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)紅葉石楠體內(nèi)存在耐鉛內(nèi)生菌，即植株通過體內(nèi)的內(nèi)生菌通過與鉛進(jìn)行離子交換、表面絡(luò)合等方式來降低土壤鉛重金屬的濃度以此保證植株可以正常生長，從而確定紅葉石楠具有富集轉(zhuǎn)運(yùn)土壤中鉛重金屬的能力。故本研究為治理鉛污染提供新植株，即可將紅葉石楠植株種植在鉛污染的土壤上，并添加本實(shí)驗(yàn)純化分離出來的PS43菌株進(jìn)行植物、微生物聯(lián)合修復(fù)的方式作污染土壤修復(fù)和根際過渡。由于紅葉石楠的形狀和葉冠顏色的特點(diǎn)，還起到園林美化的效果。本研究具有學(xué)術(shù)價(jià)值和研究意義，通過查閱資料得知，目前對(duì)紅葉石楠的研究主要是栽培技術(shù)、園林綠化、特性特征等方面，缺少對(duì)其耐重金屬的研究，更是完全沒有針對(duì)紅葉石楠耐鉛的研究。由于有資料表明紅葉石楠具有富集鉻的能力和能在酸性廢水底泥生長，故本研究探討紅葉石楠耐鉛的生理生化分析及鉛污染修復(fù)機(jī)理。2實(shí)驗(yàn)部分2.1紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的分離純化2.1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器供試植株移栽于福建省三明市三明學(xué)院校門前荊東路旁綠化帶的紅葉石楠植株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由于此路段有大量重型汽車行經(jīng)且車流量較大，且汽車尾氣中的主要成分具有含鉛化合物，所以此路段土壤在受到到汽車尾氣的長期污染下已存在鉛重金屬污染，而栽種的植株必定已受到一定程度的鉛脅迫。儀器LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）、ST-16R冷凍離心機(jī)（德國）、CA-920-2潔凈工作臺(tái)、90cm*90cm培養(yǎng)皿、錐形瓶（250mL）、接種環(huán)、涂布棒、滅菌研缽、量杯、、CP214電子天平、移液槍(1000μL、200μL)、離心管（1.5mL）、恒溫水浴鍋、恒溫振蕩培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固態(tài)培養(yǎng)基）試劑PBS緩沖溶液（滅菌備用），75%酒精，石英沙、無菌水（滅菌備用）。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法參照張潔、魏娟等人對(duì)半夏內(nèi)生細(xì)菌、云南重樓內(nèi)生細(xì)菌的分離方法，并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件，采用研磨法進(jìn)行紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的分離[9]。具體步驟見附錄1。2.2紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察2.2.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器供試菌株試驗(yàn)菌株為2.1中分離純化的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌。儀器BM-37XBS倒置生物顯微鏡、載玻片、蓋玻片、油鏡、酒精燈、洗瓶、接種環(huán)、膠頭滴管、擦鏡紙、吸水紙、移液槍(1000μL)、錐形瓶（250mL）、比色皿、紫外分光光度儀。培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液革蘭氏染色試劑[10-11]草酸銨結(jié)晶紫的混合液（堿性染料）、碘液（媒染劑）、脫色液（95%的乙醇溶液）、復(fù)染液2.2.2方法染色反應(yīng)使用經(jīng)典方法（草酸銨結(jié)晶紫染色）進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察。判斷分離得到的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌為G+或G－，并記錄細(xì)菌形態(tài)[12]。具體步驟見附錄2。2.3紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的生理生化鑒定2.3.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器供試菌株試驗(yàn)菌株為2.1中分離純化的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌。儀器酒精燈、接種環(huán)、洗瓶、膠頭滴管、載玻片、試管、上海Eppendorf移液槍(1000μL、200μL、100μL)、錐形瓶（250mL）培養(yǎng)基（1）葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液：用作分離菌株的培養(yǎng)，為甲基紅試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)（貝立脫法）提供試驗(yàn)菌液。（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液：培養(yǎng)淀粉水解實(shí)驗(yàn)所需的菌液。試劑甲基紅指示劑、貝立脫（Barritt）試劑、碘液、3%~5%過氧化氫溶液2.3.2方法（1）甲基紅試驗(yàn)[13]V-P試驗(yàn)（貝立脫法）過氧化氫酶試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)2.4紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA鑒定2.4.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器供試菌株試驗(yàn)菌株為2.1中分離純化的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌。儀器ST-16R冷凍離心機(jī)（德國）、HQ-60旋渦混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）、恒溫水浴鍋、DYY-5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、瓊脂糖水平電泳槽、2720-PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystemsbylifeTechnologies）、JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀、移液槍（1000μL、200μL、10μL）。培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液：用作紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌富集培養(yǎng)。試劑3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2、0.5×TBE緩沖液、核酸染料、DL2000DNAMaker（TaKaRa）、10×PCRbuffer、dNTPs、引物、2×EsTaqMasterMix(Dye)、ddH2O、瓊脂粉2.4.2方法紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌DNA提取用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2（試劑盒組成見附錄3）提取DNA，參照DNA回收試劑盒提取方法（試劑盒提取步驟見附錄4），并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境進(jìn)行部分調(diào)整。DNA質(zhì)量檢測(cè)用移液槍吸取所提取的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌DNA5μL,并將DNA與核酸染料按3：1的比列在干凈的封口膜上充分混合均勻，緩慢加入裝有0.5×TBE緩沖液的瓊脂糖水平電泳槽中的瓊脂糖凝膠（1.0%）膠孔內(nèi)，以110V電壓進(jìn)行電泳30~35min。電泳結(jié)束后，立即用自動(dòng)凝膠圖像分析儀觀察條帶并拍照存檔，與相應(yīng)的DNAMaker進(jìn)行比對(duì)，將合理的DNA樣品保存在4℃冷凍箱中，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)做充分的準(zhǔn)備。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用細(xì)菌通用引物8f、1492r（如表2-1所示）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。表2-1引物設(shè)計(jì)組別引物名稱序列18f5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’21492r5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’按照表2-2所示的PCR反應(yīng)體系，在超凈臺(tái)內(nèi)置于冰盒上點(diǎn)樣：表2-2PCR反應(yīng)體系試劑50μl體系2×EsTaqMasterMix(Dye)25μlPrimer8f1μlPrimer1492r1μlddH2O22μl步驟表2-3龍葵內(nèi)生細(xì)菌DNA擴(kuò)增程序步驟條件條件①預(yù)變性②變性③退火④延伸溫度94℃94℃52℃72℃時(shí)間5min30sec30sec1min②-④循環(huán)35次72℃下延伸7min,4℃保存擴(kuò)增后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，按DNA與核酸染料3：1的比例混合，在110V電壓、1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，并用自動(dòng)凝膠圖像分析儀觀察條帶并拍照存檔。將純度高、特異性高的產(chǎn)物進(jìn)行送檢測(cè)序。序列測(cè)定及序列數(shù)據(jù)分析PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，獲得菌株16SrDNA堿基序列。根據(jù)張會(huì)敏等人的16SrDNA序列數(shù)據(jù)分析和野生菌分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方法[14]。通過Internet網(wǎng)，利用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi）中Blast工具[15]。將紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌菌株的16SrDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行對(duì)比，找到相似度最高的物種。系統(tǒng)發(fā)育樹使用Mega（6.0）軟件包中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建，以確定紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌在微生物發(fā)育中產(chǎn)生的影響。3結(jié)果與分析3.1紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的分離3.1.1涂布培養(yǎng)情況圖3-1根、莖、葉的空白對(duì)照涂布平板圖圖3-2植株根、莖、葉在鉛濃度0mmol·L-1培養(yǎng)基上菌落生長情況分布圖圖3-3植株莖在鉛濃度0.4、0.8、1.2mmol·L-1培養(yǎng)基上菌落生長情況分布圖圖3-1為實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組，以添加紅葉石楠根、莖、葉三部位外植體經(jīng)過表面嚴(yán)格消毒的最后一次洗滌的無菌水替代根、莖、葉研磨液涂布的培養(yǎng)基，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后察看培養(yǎng)基的情況，由圖3-1顯示其培養(yǎng)結(jié)果是無微生物生長。因此，紅葉石楠外植體表面無微生物存活，表面滅菌徹底，實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)菌為紅葉石楠的內(nèi)生細(xì)菌。通過觀察圖3-2植株根、莖、葉在鉛濃度0mmol·L-1培養(yǎng)基上菌落生長情況，可發(fā)現(xiàn)均有菌株長出，說明紅葉石楠體內(nèi)含有內(nèi)生細(xì)菌，而且其根部的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較多。圖3-3為涂布紅葉石楠莖研磨液培養(yǎng)24h后菌落的生長情況，在培養(yǎng)基鉛離子濃度越高，菌落長得相對(duì)越小，并在培養(yǎng)基鉛濃度為1.6mmol·L-1上出現(xiàn)三種不同培養(yǎng)形態(tài)的菌株，與此同時(shí)所有培養(yǎng)皿中均沒有出現(xiàn)形態(tài)特異的菌株，即在無菌操作時(shí)得當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)中，紅葉石楠的不同營養(yǎng)器官處于不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)，共分離到44株內(nèi)生細(xì)菌（表3-1），在根、莖、葉等三個(gè)部位分離到的菌株分別為17株、16株、11株。表3-1紅葉石楠不同營養(yǎng)器官不同鉛濃度分離菌株情況表菌落個(gè)數(shù)根莖葉平板鉛離子濃度04440.43320.83331.24311.63313.2紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察3.2.1革蘭氏染色鏡檢結(jié)果圖3-4紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌革蘭氏染色（16×40）通過在BM-37XBS倒置顯微鏡下放大16×40倍的鏡檢結(jié)果（如圖3-4），觀察到本實(shí)驗(yàn)分離和純化的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)過革蘭氏染色后為紫色。所以紅葉石楠中分離的內(nèi)生細(xì)菌被判定為革蘭氏陽性細(xì)菌，其形態(tài)為棒桿狀。3.3紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的生理生化鑒定通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)知，本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的44株紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)顯微鏡觀察后均呈現(xiàn)紫色，故判定為棒桿狀的陽性菌（G+）。其中，甲基紅試驗(yàn)中有40株測(cè)定為陰性（－），V-P試驗(yàn)中36株試驗(yàn)結(jié)果為陽性（+），過氧化氫酶反應(yīng)中有40株判定為陽性（+），而淀粉水解實(shí)驗(yàn)全部菌株為陽性（+），鑒定結(jié)果見表3-2。表3-2生理生化鑒定結(jié)果序號(hào)革蘭氏染色甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)過氧化氫酶淀粉水解試驗(yàn)序號(hào)革蘭氏染色甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)過氧化氫酶淀粉水解試驗(yàn)PS1+-+++PS23+-+++PS2+-+++PS24+-+++PS3+-+++PS25+++++PS4+-+++PS26+-+++PS5+++++PS27+-+++PS6+-+++PS28+-+++PS7+-+++PS29+-+++PS8+--++PS30+-+++PS9+-+++PS31+-+++PS10+-+++PS32+-+++PS11+--++PS33+-+++PS12+++++PS34+--++PS13+++++PS35+-+++PS14+-+++PS36+--++PS15++PS37+--++PS16++PS38+-+++PS17++PS39+-+++PS18+-+++PS40+-+++PS19+-+++PS41+-+++PS20+-+++PS42+-+++PS21+-+++PS43+-+++PS22+-+-+PS44+-+++通過鑒定結(jié)果可知：在分離得到的菌株中根、莖、葉部位的菌株進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)，結(jié)果幾乎為陰性，可以得出所分離獲得的菌株分解葡萄糖后產(chǎn)生的酸較少或產(chǎn)生的酸已轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)；接著從V-P試驗(yàn)結(jié)果大部分為陽性，可進(jìn)一步得出葡萄糖分解產(chǎn)生丙酮酸并被轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，通過紅色的程度可粗略估測(cè)產(chǎn)酸的多寡。過氧化氫酶反應(yīng)幾乎為陽性結(jié)果，從而可知分離得到的菌株含有過氧化氫酶，能分解添加的過氧化氫產(chǎn)生氧氣和水，故可得出菌株是好氧菌或兼性厭氧菌；淀粉酶水解試驗(yàn)均為陽性結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)中所分離得到的菌株都具有合成淀粉酶的能力，可以分解淀粉即液體培養(yǎng)基顏色無變化。3.4紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA鑒定3.4.1菌株的16SrDNA序列分析LaneM123456789101112菌株MakerPS37PS36PS35PS34PS36PS41PS42PS43PS44PS22PS28PS30圖3-6紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳通過DNA回收試劑盒從紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌提取的DNA，選擇純度、濃度較高的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得內(nèi)生細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖3-6所示，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將由內(nèi)生細(xì)菌DNA擴(kuò)增的16SrDNA核苷酸片段與DL2000DNAMaker進(jìn)行片段位置比較。僅在1800bp處有一清晰的明亮條帶。由此可見，獲得的DNA片段純度較高，且大部分DNA片段濃度較高。3.4.2菌株發(fā)育樹分析PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，獲得菌株16SrDNA堿基序列（見附錄5），通過分離純化的得到一種內(nèi)生細(xì)菌（如：PS43）。并將紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌菌株的16SrDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比較，了解到同一個(gè)種的16SrDNA序列同源性大于99%，同一個(gè)屬的可認(rèn)為同源性處于95%到99%之間。為此菌株選擇10個(gè)同源性超過95％的菌株（見表3-3），并使用MEGA（6.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]（見圖3-7）表3-3紅葉石楠內(nèi)生菌16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果菌株比對(duì)種屬（Alignmentgenera/species）同源性（Identityolm）PS43LysinibacillusmacroidesstrainTEDI-1116SribosomalRNAgene,partialsequence100%Lysinibacillussp.FWQSR5genefor16SribosomalRNA,partialsequence100%Lysinibacillussp.strainOL116SribosomalRNAgene,partialsequence100%LysinibacillusmacroidesstrainZCGT0516SribosomalRNAgene,partialsequence100%Lysinibacillussp.YS11chromosome,completegenome100%Lysinibacillusmacroidespartial16SrRNAgene,isolateIsolate47.2100%Bacillussp.OCC816SribosomalRNAgene,partialsequence100%Lysinibacillussp.HM-9016SribosomalRNAgene,partialsequence100%Lysinibacillussp.Vr42partial16SrRNAgene,strainVr42100%LysinibacillusfusiformisstrainBCH54016SribosomalRNAgene,partialsequence100%0.1圖3-7紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹3.4.3菌株鑒定結(jié)果結(jié)合本研究的多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以初步鑒定分離到的葉部位的內(nèi)生細(xì)菌為賴氨酸菌屬（Lysinibacillus）。4結(jié)論本文通過對(duì)鉛脅迫處理過后的紅葉石楠進(jìn)行根、莖、葉三部分內(nèi)生細(xì)菌的提取和分離，并通過純種分離方法在含有梯度濃度鉛離子的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化及篩選出對(duì)鉛重金屬具有良好耐受性的植物內(nèi)生菌，共分離到44株內(nèi)生細(xì)菌，并觀察到單菌落為：菌落呈圓形，乳白色，輪廓光滑。通過革蘭氏染色判定菌株都為革蘭氏陽性菌，用顯微鏡觀察純化得到的內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征，再進(jìn)一步進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)等鑒定菌株生理生化性質(zhì)。細(xì)菌的生理生化反應(yīng)初步分類鑒定菌株的類別，并初步了解不同鉛濃度下不同植物部位內(nèi)生細(xì)菌的反應(yīng)機(jī)制和解毒機(jī)制，并且減少內(nèi)生細(xì)菌的16SrDNA鑒定的費(fèi)用和實(shí)驗(yàn)數(shù)量。然后通過DNA回收試劑盒提取部分純化內(nèi)生細(xì)菌DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增及送檢測(cè)定。再利用BLAST對(duì)序列進(jìn)行比較，通過MEGA（6.0）軟件構(gòu)建菌株發(fā)育樹，初步鑒定分離到的葉部位的內(nèi)生細(xì)菌為賴氨酸桿菌屬（Lysinibacillus）。本實(shí)驗(yàn)缺少對(duì)內(nèi)生菌的分離過程中，高溫滅菌是否對(duì)培養(yǎng)基含有的營養(yǎng)成分以及后期培養(yǎng)條件是否對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的提取分離有影響的探究。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步篩選出本次實(shí)驗(yàn)中分離出的龍葵內(nèi)生細(xì)菌中耐鉛能力較強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌及確認(rèn)實(shí)驗(yàn)植物株受鉛脅迫的程度和內(nèi)生細(xì)菌的最高抗鉛的濃度。本實(shí)驗(yàn)的研究應(yīng)用在于植物體內(nèi)的不同部位可以積累鉛以及其他重金屬元素，所以可以用作污染土壤修復(fù)和根際過渡的材料。且現(xiàn)如今，內(nèi)生細(xì)菌的潛在價(jià)值正在不斷進(jìn)行開發(fā)，其重要性已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可[9]。參考文獻(xiàn):[1]黃文韜.紅葉石楠Photiniaxfraseri扦插繁殖技術(shù)[J].中國科技信息,2015(17):82-83.[2]楊金燕，楊肖娥，何振立.土壤中鉛的來源及生物的有效性[J].土壤通報(bào)，2005，36(5)：765-772.[3]尚中博.巰基煤矸石的制備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