(12)發(fā)明專利(10)授權(quán)公告號CN1128887(65)同一申請的已公布的文獻(xiàn)號(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)(85)PCT國際申請進(jìn)入國家階段日PCT/EP2019/0704312019(87)PCT國際申請的公布數(shù)據(jù)WO2020/025577EN2N·帕夫洛夫斯基(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京市金杜律師事務(wù)所專利代理師孟凡宏袁森US2012041216A1,2012.0(54)發(fā)明名稱編碼改進(jìn)的轉(zhuǎn)氨酶蛋白的核酸本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的の-轉(zhuǎn)氨酶(①-TA)活性的蛋白，編碼具有改進(jìn)的w-TA活性的各個(gè)蛋白的核酸分子，以及立體選擇性合成手性胺和21.一種具有w-TA活性的蛋白，其由如SEQIDNO18所示的位置1至476的氨基酸序列組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其選自以下：a)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置166的氨基酸是G和在位置327的氨基酸是Q;b)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是Q和在位置384的氨基酸是S;c)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置326的氨基酸是Q和在位置327的氨基酸是Q;d)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是Q;e)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置326的氨基酸是F和在位置327的氨基酸是Q;f)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是C;g)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是I;h)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是M;i)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置164的氨基酸是Y;j)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置164的氨基酸是S;k)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是V;1)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置409的氨基酸是R;m)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置327的氨基酸是S;n)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置271的氨基酸是I;o)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置329的氨基酸是G;p)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置409的氨基酸是P;q)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置414的氨基酸是M;r)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置165的氨基酸是K;s)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置414的氨基酸是R;t)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置414的氨基酸是H;u)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置165的氨基酸是C;v)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置164的氨基酸是C;w)根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，不過在位置409的氨基酸是K。3.一種核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分子，其編碼具有@-TA活性的蛋白，其選自以下：a)由SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子；b)編碼由SEQIDNO18所示的氨基酸序列中從位置1至476的氨基酸序列組成的蛋白的核酸分子；c)由于密碼子的簡并性，從a)或b)所定義的核酸分子衍生的核酸分子；d)由如SEQIDNO16所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子。5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的核酸分子，其編碼具有@-TA活性的蛋白，其選自a)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置496至498的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn和在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置979至981的密碼子具有核苷酸序列car;3b)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組c)由如SEQIDNO16或SEQIDe)由如SEQIDNO16或SEQIDf)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組j)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1k)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組m)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所4n)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置985至987的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn;o)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置1225至1227的密碼子具有核苷酸序列ccn;p)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置1240至1242的密碼子具有核苷酸序列atg;q)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置493至495的密碼子具有核苷酸序列aar;r)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置1240至1242的密碼子具有核苷酸序列mgn;s)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置1240至1242的密碼子具有核苷酸序列cay;t)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置493至495的密碼子具有核苷酸序列tgy;u)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置490至492的密碼子具有核苷酸序列tgy;v)由如SEQIDNO16或SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列組成的核酸分子，除此之外，在SEQIDNO16或SEQIDNO17中核苷酸位置1225至1227的密碼子具有核苷酸序列aar。6.一種重組核酸分子，其包含根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的核酸分子。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組核酸分子，其中所述重組核酸分子是載體或質(zhì)粒。8.一種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白，或包含根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的核酸分子，或者包含根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的重組核酸分子。9.一種用于生產(chǎn)胺的方法，其包括以下步驟：a)提供胺受體分子；b)提供胺供體分子；c)將步驟a)中提供的所述胺受體分子和步驟b)中提供的所述胺供體分子與根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白接觸。10.一種用于在包含(R)-和(S)-胺對映異構(gòu)體的組合物中降低胺對映異構(gòu)體的量的方a)提供包含(R)-和(S)-胺對映異構(gòu)體的組合物；5b)提供胺受體分子；c)將在步驟a)中提供的所述組合物和步驟b)中提供的所述胺受體與根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白接觸。6技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的@-轉(zhuǎn)氨酶(@-TA)活性的蛋白，編碼具有改進(jìn)的w-TA活性的各蛋白的核酸分子以及立體選擇性地合成手性胺和氨基酸或在對映異構(gòu)體混合物中增加手性胺異構(gòu)體的方法。[0002]生物催化可以基于自然界中可用的酶。通常，生產(chǎn)特定產(chǎn)品的需求產(chǎn)生了對特定酶的需求，該需求適合于經(jīng)濟(jì)上可行地大規(guī)模生產(chǎn)所需產(chǎn)品。酶工程是優(yōu)化酶以經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)給定產(chǎn)品的一種選擇。[0003]胺和氨基酸在自然界中無處不在，不僅作為蛋白和核酸的一部分，而且作為神經(jīng)遞質(zhì)(例如，腎上腺素和組胺),作為輔酶(例如，輔酶A的半胱胺)或復(fù)合脂質(zhì)(例如，磷脂酰乙醇胺的乙醇胺)的前體也非常重要。特別是藥學(xué)上分類為生物堿的高級置換胺顯示出各種結(jié)構(gòu)形式，以及在各種生命形式中發(fā)現(xiàn)的生物效應(yīng)。胺的生物活性，如抗生性、鎮(zhèn)痛性或神經(jīng)毒性活性，提高了其作為藥物的潛力，因此使其成為新藥研發(fā)上極有希望的候選者。手性胺立體中心的絕對構(gòu)型對于與生物分子的相互作用以及對生物系統(tǒng)的作用類型至關(guān)重要。為生產(chǎn)所需的靶分子，產(chǎn)生正確的手性通常是一項(xiàng)挑戰(zhàn)(Schaetzle,2011,InauguralDissertation,Ernst-Moritz-Arndt-UniversityofGreifswald,Germany,"Identification,characterizationandapplica[0004]制藥公司研發(fā)管線中的很多活性化合物都是手性的。光學(xué)活性胺屬于用于合成很多活性藥物和農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的重要化合物類別。例如，L-苯丙氨酸是動物飼料中的重要添加劑。沒有可用于化學(xué)合成對映異構(gòu)體純氨基酸的商業(yè)可行方法。然而，外消旋氨基酸的化學(xué)合成仍然很重要，因?yàn)樵谝恍┣闆r下通過生物催化方法可以將外消旋混合物拆分為純異構(gòu)體[0005]胺轉(zhuǎn)氨酶或@-轉(zhuǎn)氨酶(①-TA)是對生產(chǎn)手性伯胺具有重要意義的生物催化劑。@-TA利用吡哆醛-5′-磷酸(PLP)作為輔因子，催化氨基從氨基供體向羰基部分的轉(zhuǎn)移。因此，反應(yīng)混合物由兩種胺(氨基供體和產(chǎn)物)和兩種羰基化合物(酮底物和副產(chǎn)物)組成。已發(fā)現(xiàn)有(S)-選擇性和(R)-選擇轉(zhuǎn)氨酶兩者，且到目前為止已有很好的描述。這些酶具有高度的立體選擇性，因此，對于直接不對稱胺化具有很大的潛力，其中使用廉價(jià)的氨基供體直接從非手性酮中產(chǎn)生高對映體過量的手性胺(Fesko等，2013,J.MolecularCatalysisB,[0006]轉(zhuǎn)氨酶已在很多手性胺和氨基酸的生物催化合成中引起關(guān)注。轉(zhuǎn)氨酶可用于外消旋氨基酸的動力學(xué)拆分(從混合物中除去一種異構(gòu)體),也可用于從相應(yīng)的前手性酮底物開始的不對稱合成中?？梢詫⑥D(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)認(rèn)為是氧化還原反應(yīng)，其中供體的氧化脫氨基與受體的還原性胺結(jié)合在一起(Rudat等，2012,AMBExpress2:11)。[0007]Cann等(2012,Org.ProcessRes.Dev.16,1953-1966)公開了@-轉(zhuǎn)氨酶成功用于立體選擇性生產(chǎn)w-轉(zhuǎn)氨酶，@-轉(zhuǎn)氨酶是生產(chǎn)偏頭痛藥物的前體。討論了酶促合成與化學(xué)合成的優(yōu)缺點(diǎn)。7菌(Bacillusmegaterium)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的@-轉(zhuǎn)氨酶通過從氨[0009]Park等(2013,Organic&BiomolecularChemistry11,6929-693[0010]Park等(2013,ChemCatChem5,1734-1738)通過在一鍋反應(yīng)中使用外消旋芳基烷基胺作為氨基供體，證明了使用(R)-或(S)-選擇性@-轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行熱力學(xué)上有利的前手性[0011]使用2-丙基胺、1-丙基胺和外消旋-2-丁基胺作為氨基供體的w-轉(zhuǎn)氨酶催化反[0012]Shin&Kim(2001,Biosci.Biotechno.Biochem.65(8),1782-1788)公開了使用芳基茚滿作為胺供體，分離@-轉(zhuǎn)氨酶。發(fā)現(xiàn)酮酸類丙酮酸(ketoacidspyruvate)和乙醛酸(glyoxylate)或醛類丙醛(aldehydespropionaldehyde)和丁醛(butaraldehyde)是良好氨酶接觸來生產(chǎn)(S)-1-甲氧基-2-氨基丙烷。[0014]在Galkin等(1997,J.FermentationandBioengeneering83(3),299-300)中描酸形成二氧化碳來建立來自NAD的NADH再循環(huán)。丙酮酸通過D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)從丙D-苯丙氨酸和D-酪氨酸以低收率合成，D-正纈氨酸僅以接近30%生產(chǎn)而氨基丁酸則僅以外[0016]WO2015/195707A1(US2015361468A1)公開了通過轉(zhuǎn)基因細(xì)菌生產(chǎn)五碳聚合物構(gòu)建嵌段。細(xì)菌生合成途徑是由引入包含@-轉(zhuǎn)氨酶的多種酶操縱的。已發(fā)現(xiàn)@-轉(zhuǎn)氨酶催[0017]KR20030072067公開了嗜熱芽孢桿菌屬(thermophyllicBacillussp.)T30菌株8Information”)公開了將全細(xì)胞催化劑用于從相應(yīng)的前手性胺合成對映異構(gòu)體純的胺和拆分外消旋胺的用途。在大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)胞中表達(dá)了來自巨大芽孢桿菌SC6394,反硝化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesdenitrificans)Y2k-2,紫色色桿菌突變體和來源于節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter)屬種稱為CNB05-01的突變體的不同w-轉(zhuǎn)氨酶。將[0019]通過使用轉(zhuǎn)氨酶可獲得的產(chǎn)品范圍受到大多數(shù)天然存在的@-轉(zhuǎn)氨酶性質(zhì)的限來自脫氮副球菌的(S)-選擇性@-轉(zhuǎn)氨酶的變體(V153A)確實(shí)顯示出對線性酮酸(S)-1-苯桿菌(Arthrobactercitreus)@-轉(zhuǎn)氨酶的變體，顯示出提高的熱穩(wěn)定性和顯著改善的比公開了通過涉及w-轉(zhuǎn)氨酶的生物催化方法來制備復(fù)合抗糖尿病藥物西格列汀。生產(chǎn)了節(jié)桿菌屬(R)-選擇性@-轉(zhuǎn)氨酶(ATA-117)的各種變體。這些酶顯示出廣泛的底物范圍，對異野生型酶相比，含有27個(gè)氨基酸取代的節(jié)桿菌屬(R)-選擇性@-轉(zhuǎn)氨酶的優(yōu)化變體(ATA-[0022]WO2006/06339(US7,247,460)公開了與每種野生型熱穩(wěn)定的，具有增加的反應(yīng)速率和對高胺供體濃度的耐受性的檸檬富集的或純凈的產(chǎn)品方面，優(yōu)選在特定的和/或經(jīng)濟(jì)上可行的生產(chǎn)方法下需要進(jìn)一步改進(jìn)[0025]本發(fā)明提供了在其氨基酸序列中包含修飾的@-轉(zhuǎn)氨酶(@-TA)變體或在其氨基序列中包含另外的修飾的進(jìn)一步修飾的@-轉(zhuǎn)氨酶(①-TA)變體，與相應(yīng)的野生型@-TA相9比，這些變體和包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的進(jìn)一步修飾的變體具有改進(jìn)的反應(yīng)動力學(xué)、改善的底物接受性和改善的比活性。因此，本發(fā)明的變體和包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的變體，通過將其用于使用相應(yīng)的野生型@-TA不能實(shí)現(xiàn)的新胺化產(chǎn)品或相應(yīng)產(chǎn)品前體的生產(chǎn)方法中，能夠開發(fā)出經(jīng)濟(jì)高效的胺化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝。[0026]本文所述的@-TA的變體或進(jìn)一步修飾的變體具有優(yōu)于已知的野生型和其他已知的@-TA的優(yōu)點(diǎn)。特別地，本文所述的修飾的或變體@-TA具有可以產(chǎn)生對映異構(gòu)體富集的或者對映異構(gòu)體接近純的或純的化合物的優(yōu)點(diǎn)，比如例如，不能用相應(yīng)的野生型@-轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)的支鏈或芳香氨基酸。本文所述的進(jìn)一步修飾的w-TA變體具有可產(chǎn)生磷酸化-氨基酸的對映異構(gòu)體富集的、接近純的或純的化合物的優(yōu)點(diǎn)。[0027]SEQIDNO3中的位置1至477代表來自GenPept(PDB)的登錄號為No5G09_A的巨大芽孢桿菌的野生型@-轉(zhuǎn)氨酶(@-TA)的氨基酸序列。[0028]SEQIDNO6中的位置1至479代表來自GenPept(PDB)的登錄號為No5G2P_A的節(jié)桿菌屬的野生型w-TA的氨基酸序列。[0029]SEQIDNO9中的位置1至476代表來自GenPept(PDB)的登錄號為NoKRF52528.1的桿菌屬(土壤76801D1)的野生型w-TA的氨基酸序列。[0030]SEQIDNO12中的位置1至476代表來自W2006/06336A2的SEQIDNO16的節(jié)桿菌屬的w-TA變體的氨基酸序列。菌屬的野生型@-TA的氨基酸序列。[0032]本文描述了具有w-TA活性的蛋白，其中這些蛋白的氨基酸序列代表了具有w-TA活性的已知蛋白的變體。特別地，本文所述的具有w-TA活性的蛋白的氨基酸序列代表由SEQIDNO3中的位置1至477的氨基酸表示的，和/或由SEQIDNO6中的位置1至479的氨基酸表示的，和/或由SEQIDNO9中的位置1至476的氨基酸表示的，中的位置1至476的氨基酸表示的，和/或由SEQIDNO15中的位置1至476的氨基酸表示的IDNO9、SEQIDNO12和SEQIDNO15所示的每個(gè)序列的相應(yīng)氨基酸位置給出的氨基酸。[0033]使用縮寫“@-TA”并且在本文中指“@-轉(zhuǎn)氨酶”。[0034]如本文所用，術(shù)語“變體”指與本領(lǐng)域公知的主題不同的主題。關(guān)于核酸分子和蛋白，應(yīng)將變體理解為分別包含核酸序列或氨基酸序列，其偏離相應(yīng)的已知序列，但編碼具有相同功能或催化相同反應(yīng)的蛋白，例如，編碼具有@-TA活性的蛋白的功能。核酸分子序列和氨基酸序列與已知核酸序列和蛋白序列的偏離意味著與相應(yīng)的已知核酸相比，所述序列分別包含核苷酸或氨基酸的置換(取代)和/或缺失和/或插入。[0035]本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及具有w-TA活性的蛋白，其中所述蛋白選自以下：[0036]a)包含如SEQIDNO3所示的從位置1至477的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在位置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,和在位置414的氨基酸不是P;置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是T,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,和在位置414的氨基酸不是P;置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,和在位置414的氨基酸不是P;位置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S,不是E,在位置197的氨基酸不是T,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,和在位置414的氨基酸不是P;位置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸和在位置187的氨基酸不是S,不是E,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,和在位置414的氨基酸不是P;[0041]f)具有與a)、b)、c)、d)、e)或f)所示的任何氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的氨基酸序列的蛋白，不過在各種情況下對應(yīng)于位置25的氨基酸不是F,對應(yīng)于位置64的氨基酸不是L,對應(yīng)于位置88的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是T或M,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置327的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于11位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,和標(biāo)題“序列說明”段落的表4導(dǎo)出。[0043]第一個(gè)氨基酸序列中“對應(yīng)于位置x的氨基酸”(例如，在SEQIDNO3中的位置64)酸序列的氨基酸編號與第一個(gè)氨基酸序列的氨基酸編號不同，時(shí)，顯示在第一個(gè)氨基酸序列位置x的第二個(gè)氨基酸序列的氨基酸。[0044]在本發(fā)明的上下文中，就序列同一性或與之相同的序列而言，術(shù)語“同一性”應(yīng)理解為指在整個(gè)序列長度中第一核酸或氨基酸序列分別與另外的(第二)核酸或氨基酸序列所共享的相同氨基酸或核苷酸的數(shù)量，其以百分比表示?！癗eedle”中的全局或局部比對算法，通過兩個(gè)氨基酸或兩個(gè)核苷酸序列的比對來確定。這些軟件使用Needleman和Wunsch全局比對算法在兩個(gè)序列的整個(gè)長度上進(jìn)行比對，最大程和空位延伸罰分=0.5(核苷酸和蛋白比對兩者均使用)。對于核苷酸，默認(rèn)評分矩陣是10915-10919)。序列比對和序列同一性百分比的分?jǐn)?shù)例如可以使用可在EBI的萬維網(wǎng)站點(diǎn)(ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上訪問的軟件(如EMBOSS)確定?；蛘?，可以通過使用眾所周知序列相似性或同一性，但是優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)檢索命中并配對比對以最終確定序列同一性。具有w-TA活性的蛋白的同一性，以及分別通過比較SEQIDNO16或17中給出的核酸序列與其他蛋白或核酸分子來確定編碼具有w-TA活性的蛋白的核酸分子的同一性。如果要相目的百分比來確定同一性。優(yōu)選地，使用已知的和公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序ClustalWJulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE),EuropeanMolecularBiologyIGBMC(InstitutdeGénétiqueetdeBiologieMol67404IllkirchCedex,France;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI的所有鏡像網(wǎng)頁(EuropeanBioinformaticsInstitute,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SD,UK)。[0047]優(yōu)選地，使用1.8版的Clus[0048]優(yōu)選地，使用1.8版的ClustalW計(jì)算機(jī)程序來確定例如在本發(fā)明的背景中描述的核酸分子的核苷酸序列與其他核酸分子的核苷酸序列之間的同一性。在此，必須按照以下方式設(shè)置參數(shù)：[0049]KTUPLE=2,TOPDIAGS=4,PAIRGAP=5,DNAMATRIX:IUB,GAPOPEN=10,GAPEXT=5,MAXDIV=40,TRANSITIONS:非加權(quán)。[0050]同一性還指所討論的核酸分子或由其編碼的蛋白之間在功能上和/或結(jié)構(gòu)上等同。功能上等同指核酸分子序列或氨基酸序列編碼具有w-TA活性的蛋白。與上述分子同源并且表示這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變體，其代表具有相同生物學(xué)功能或催化相同反應(yīng)的修飾，即編碼具有@-TA活性的蛋白。其可以是天然存在的變體，例如來自其他物種的序列，也可以是突變，其中這些突變可以自然方式發(fā)生或通過定向誘變引入。此外，變體可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體可以是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。然而，關(guān)于本發(fā)明，決定性的是那些變體編碼具有@-TA活性的蛋白，并且包含本文所述的根據(jù)本發(fā)明的蛋白的氨基酸置換(置換)、缺失或插入。[0051]特殊類型的衍生物是例如由于遺傳密碼的簡并性而與本發(fā)明上下文中描述的核酸分子不同的核酸分子。[0052]根據(jù)NC-IUBMB(國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會)的規(guī)定，轉(zhuǎn)氨酶(TA)屬于轉(zhuǎn)移酶的類別(EC2)。轉(zhuǎn)移酶是將一個(gè)基團(tuán)(例如，甲基或糖基)從一個(gè)化合物(通常視為供體)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物(通常視為受體)的酶。轉(zhuǎn)移酶的組包括轉(zhuǎn)移含氮基團(tuán)的酶(EC2.6)。由TA催化的反應(yīng)在形式上可視為是氧化還原反應(yīng)，根據(jù)通用方程式(I),通過將-NH?基團(tuán)和-H轉(zhuǎn)移到含羰基的化合物上來交換(胺)供體的氧化脫氨基和羰基受體的還原胺化，以換取該基團(tuán)的=OR1-CH(-NH?)-R2+R3-CO-R?→R1-CO-R2+R3-CH(-NH?)-R?。[0053]同樣由TA所催化的逆反應(yīng)形式上可根據(jù)通用方程式(Ia)來描述R1-CO-R2+R3-CH(-NH?)-R?→R1-CH(-NH?)-R2+R3-CO-R[0054]TA是吡哆醛5′-磷酸(PLP)依賴性酶。TA催化反應(yīng)的獨(dú)特特征是氨基的轉(zhuǎn)移(通過良好建立的涉及共價(jià)底物-輔酶中間體機(jī)制),這證明了這些酶在轉(zhuǎn)移酶之間的分配是一個(gè)特殊的亞類，稱為轉(zhuǎn)氨酶或氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2.6.1)。[0055]TA在本領(lǐng)域中通常進(jìn)一步分類為α-TA和@-TA。該命名法基氨基酸的氨基的相對位置。對于胺而言，羧酸α-TA僅催化a-碳的氨基的氨基轉(zhuǎn)移，其中@-TA也作用于非α-胺并轉(zhuǎn)移相應(yīng)底物的遠(yuǎn)端氨基(Shin等，2003,ApplMicrobiolBiotechnol61,463-471)。然而，本領(lǐng)域已知一些@-TA能夠催化不帶有羧基的(伯)胺化合物的氨基轉(zhuǎn)移(Rudat等，2012,AMBExpress2(11);Shin等，2003,ApplMicrobiolBiotechnol61,463-[0056]如果蛋白具有TA活性，則特別可以用本領(lǐng)域已知和描述的方法檢測@-TA.Hwang&Kim(2004,EnzymeandMicrobiolTechnology34(5),429-436)開發(fā)了一種基于Cu-SO?/MeOH對α-氨基酸進(jìn)行藍(lán)色染色的蛋白@-TA活性檢測方法。Truppo等(2009,Org.Biomol.Chem.7,395-398)描述了基于多酶級聯(lián)pH指示劑測定的用于高通量篩選@-TA[0057]使用哪種方法來檢測根據(jù)本發(fā)明的蛋白是否具有w-TA的活性不是決定性的。優(yōu)選地，關(guān)于本發(fā)明，在“一般方法”第4項(xiàng)下描述的方法用于檢測根據(jù)@-TA的活性，特別是該方法用于檢測根據(jù)本發(fā)明的@-TA變體是否具有@-TA的活性。生的對映體過量于(R)-對映異構(gòu)體的(S)-對映異構(gòu)體。[0062]R1-CH(-NH?)-R2+R3-CO-R?242和/或245和/或311和/或353示的氨基酸序列在位置202和/或205和/或359和/或475和/或476可具有另外的氨基酸置[0065]除了上文b)或d)項(xiàng)所描述的w-TA變體，SEQIDNO6從位置1至479所示的氨基酸或186和/或195和/或205和/或252和/或268和/或409和/或436可具有另外的氨基酸置換，和/或在SEQIDNO6所示的氨基酸序列中在位置477和/或478和/或479的氨基酸可以被缺置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,在位置414的氨基酸不是P,在位置2的氨基酸不是S,在位置48的氨基酸不是D,在位置164的氨基酸不是Y,在位置202的氨基酸不是D,在位置205的氨基酸不是L,在位置242的氨基酸不是A,在位置245的氨基酸不是A,在位置311的氨基酸不是L,在位置353的氨基酸不是F,在位置359的氨基酸不是D,在位置424的氨基酸不是K,在位置475的氨基酸不是A,在位置476置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是T,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,在位置414的氨基酸不是P,在位置46的氨基酸不是T,在位置60的氨基酸不是C,在位置185的氨基酸不是C,在位置186的氨基酸不是S,在位置195的氨基酸不是S,在位置205的氨基酸不是Y,在位置252的氨基酸不是V,在位置268的氨基酸不是S,在位置409的氨基酸不是R,在位置置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,在位置414的氨基酸不是P,在位置2的氨基酸不是S,在位置48的氨基酸不是D,在位置69的氨基酸不是P,在位置90的氨基酸不是S,在位置164的氨基酸不是Y,在位置242的氨基酸不是A,在位置245的氨基酸不是A,在位置268的氨基酸不是T,在位置311的氨基酸不是L,在位置318的氨基酸不是E,在位置322的氨基酸不是R,在位置353的氨基酸不是S,在位置424位置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是T,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H和，位置414的氨基酸不是P,在位置46的氨基酸不是T,在位置60的氨基酸不是C,在位置185的氨基酸不是C,在位置186的氨基酸不是C,在位置195的氨基酸不是S,在位置205的氨基酸不是Y,在位置252的氨基酸不是V,在位置268的氨基酸不是S,在位置409的氨基酸不是位置25的氨基酸不是F,在位置64的氨基酸不是L,在位置88的氨基酸不是T,在位置157的氨基酸不是T,在位置165的氨基酸不是R,在位置169的氨基酸不是V,在位置174的氨基酸不是E,在位置187的氨基酸不是S,在位置197的氨基酸不是M,在位置239的氨基酸不是S,在位置327的氨基酸不是S,在位置328的氨基酸不是V,在位置384的氨基酸不是Y,在位置389的氨基酸不是I,在位置391的氨基酸不是D,在位置396的氨基酸不是K,在位置410的氨基酸不是H,在位置414的氨基酸不是P,在位置48的氨基酸不是D,在位置164的氨基酸不是Y,在位置242的氨基酸不是A,在位置245的氨基酸不是A,在位置255的氨基酸不是F,和在位置424的[0073]f)具有與a)中所定義的任何氨基酸序列(如SEQIDNO3所示從位置1至477的氨基酸序列)至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%相同的氨基酸序列氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是M,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,對應(yīng)于位置414的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置2的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置48的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置164的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置202的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置205的氨基酸不是L,對應(yīng)于位置242的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置245的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置311的氨基酸不是L,對應(yīng)于位置353的氨基酸不是F,對應(yīng)于位置359的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置424的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置475的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置476的氨基酸不是L,和[0074]g)具有與b)中所定義的任何氨基酸序列(如SEQIDNO6所示從位置1至476的氨基酸序列)至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%相同的氨基酸序列氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置327的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,對應(yīng)于位置414的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置46的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置60的氨基酸不是C,對應(yīng)于位置185的氨基酸不是C,對應(yīng)于位置186的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置195的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置205的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置252的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置268的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置409的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置436的氨基酸不是A,和對應(yīng)[0075]h)具有與c)中所定義的任何氨基酸序列(如SEQIDNO9所示從位置1至479的氨基酸序列)至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%相同的氨基酸序列氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是M,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,對應(yīng)于位置414的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置2的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置48的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置69的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置90的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置164的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置242的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置245的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置268的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置311的氨基酸不是L,對應(yīng)于位置318的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置322的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置353的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置424的氨基酸不是K,和對[0076]i)具有與d)中所定義的任何氨基酸序列(如SEQIDNO12基酸序列)至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%相同的氨基酸序列氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置327的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,對應(yīng)于位置414的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置46的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置60的氨基酸不是C,對應(yīng)于位置185的氨基酸不是C,對應(yīng)于位置186的氨基酸不是C,對應(yīng)于位置195的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置205的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置252的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置268的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置409的氨基酸不是R,和對應(yīng)于位置436的氨基酸不是A;基酸序列)至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%相同的氨基酸序列氨基酸不是T,對應(yīng)于位置157的氨基酸不是T,對應(yīng)于位置165的氨基酸不是R,對應(yīng)于位置169的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置174的氨基酸不是E,對應(yīng)于位置187的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置197的氨基酸不是M,對應(yīng)于位置239的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置327的氨基酸不是S,對應(yīng)于位置328的氨基酸不是V,對應(yīng)于位置384的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置389的氨基酸不是I,對應(yīng)于位置391的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置396的氨基酸不是K,對應(yīng)于位置410的氨基酸不是H,對應(yīng)于位置414的氨基酸不是P,對應(yīng)于位置48的氨基酸不是D,對應(yīng)于位置164的氨基酸不是Y,對應(yīng)于位置242的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置245的氨基酸不是A,對應(yīng)于位置255[0079]表1總結(jié)了與野生型@-TA的每個(gè)氨基酸序列(在SEQIDNO3中的位置1至477,或的位置1至476)相比以及與來自節(jié)桿菌屬的經(jīng)修飾的w-TA(在SEQIDNO12中的位置1至476)相比在根據(jù)本發(fā)明的w-TA變體蛋白的氨基酸序列(在SEQIDNO18中的位置1至476)2SGSGGGFFFFFRMTMTMMDGDGDGYCYCYYLLLLL工QQPQQQTTTTTAAASAAATTTTTAYFYFYFRRRRRQVVVVVAEEEEEGYCYCYYNSNSNNSSSSSNPSPSPPMTMTMADNNNNNLYCYCCSSSSSPAVAVAVATATATIVIVIII工I工F工NSTSNNLVLVVVAAEAAAKKRKKKSSSSSTVVVVVGFLFLLLDNNNNNYYYYYCI工I工工LDDDDDEKKKKKETRTRTTHHHHHRPPPPPLKEKEKEVAVAVVGGEGGGAQQQQLSSSSSEALE[0083]在表1中的“末端”表示在分別已知的(野生型)序列的氨基酸序列中存在的最后一個(gè)氨基酸之后的位置。[0084]因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及根據(jù)本發(fā)明的具有w-TA活性的蛋白，其選自以下[0085]a)包含如SEQIDNO18所示的位置1至476的氨基酸序列的蛋白；[0086]b)具有與如SEQIDNO18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的氨基酸序列的蛋白，不過對應(yīng)于SEQID414的氨基酸代表在SEQIDNO18中所示的氨基酸序列中各個(gè)位置所示的那些氨基酸；[0087]c)具有與如SEQIDNO18所示的位置1至476的氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的氨基酸序列的蛋白，不過對應(yīng)于SEQID中各個(gè)位置所示的那些氨基酸。[0088]在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明編碼w-TA的蛋白是包含如SEQIDNO18所示從位置1至476的氨基酸序列的蛋白。[0089]到目前位置，本文以上所述的蛋白在本文中通常稱為w-TA變體或根據(jù)本發(fā)明的蛋白變體。[0090]發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步的氨基酸修飾引入根據(jù)本發(fā)明的蛋白變體中進(jìn)一步改善了w-TA變體的活性，特別是在其底物特異性方面，這意味著與本文上文所述的@-TA變體相比，這些進(jìn)一步修飾的@-TA變體更適于產(chǎn)生對映異構(gòu)體富集的或接近純的產(chǎn)物。作為根據(jù)本發(fā)明的蛋白，與本文所述的@-TA變體相比，包含進(jìn)一步修飾的w-TA被進(jìn)一步修飾。包含進(jìn)一步修飾的@-TA變體特別適合于生產(chǎn)對映異構(gòu)體富集或?qū)τ钞悩?gòu)體接近純的磷酸氨基酸，并且在本文中指包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的@-TA變體或包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的根據(jù)本發(fā)明的蛋白。[0092]“對映異構(gòu)體富集的”在本文中指在組合物中兩種對映異構(gòu)體之一以比另一種對映異構(gòu)體更高的量存在，優(yōu)選地至少60%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，更優(yōu)選地65%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，又更優(yōu)選地至少70%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，甚至更優(yōu)選地至少75%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，甚至更優(yōu)選地至少80%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，特別優(yōu)選地至少85%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中，最優(yōu)選地至少90%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中或特別優(yōu)選地至少94%的一種對映異構(gòu)體存在于組合物中。[0093]“對映異構(gòu)體近乎純的”指在本文中兩種對映異構(gòu)體之一以至少95.0%的量存在于組合物中，優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少95.5%的量存在于組合物中，更優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少96.0%的量存在于組合物中，又更優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少96.5%的量存在于組合物中，甚至更優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少97.0%的量存在于組合物中，甚至更優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少98.0%的量存在于組合物中，特別優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少98.5%的量存在于組合物中，最優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少99.0%的量存在于組合物中或特別優(yōu)選地兩種對映異構(gòu)體之一以至少99.5%的量存在于組合物中。[0094]因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及具有w-TA變體的活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白變體，其中與根據(jù)本發(fā)明的蛋白相比根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列還包含氨基酸修飾。[0095]優(yōu)選地，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式關(guān)于具有包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的根據(jù)本發(fā)明的w-TA活性(①-TA變體)的蛋白的氨基酸序列，因此是具有w-TA活性的根據(jù)本發(fā)明的蛋白，其選自以下[0096]a)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置166的氨基酸是G和在位置327的氨基酸是Q;[0097]b)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是Q和在位置384的氨基酸是S;[0098]c)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置326的氨基酸是Q和在位置327的氨基酸是Q;[0099]d)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是Q;[0100]e)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置326的氨基酸是F和在位置327的氨基酸是Q;[0101]f)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是C;[0102]g)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是I;[0103]h)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是M;[0104]i)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置164的氨基酸是Y;[0105]j)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置164的氨基酸是S;[0106]k)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是V;[0107]1)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置409的氨基酸是R;[0108]m)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是S;[0109]n)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置271的氨基酸是I;[0110]o)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置329的氨基酸是G;[0111]p)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置409的氨基酸是P;[0112]q)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置414的氨基酸是M;[0113]r)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置165的氨基酸是K;[0114]s)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置414的氨基酸是R;[0115]t)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置414的氨基酸是H;[0116]u)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置165的氨基酸是C;[0117]v)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置327的氨基酸是V;[0118]w)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置164的氨基酸是C;[0119]x)根據(jù)本發(fā)明的蛋白，不過在位置409的氨基酸是K。[0120]本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式關(guān)于具有包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的w-TA活性的蛋白的氨基酸序列涉及具有w-TA活性的蛋白，其選自以下[0121]a)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQIDNO18中位置166的氨基酸S被G置換和在SEQIDNO18中位置327的氨基酸[0122]b)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQIDNO18中位置327的氨基酸T被Q置換和在SEQIDNO18中位置384[0123]c)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQIDNO18中位置326的氨基酸E被Q置換和在SEQIDNO18中位置327[0124]d)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0125]e)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此之外，在SEQIDNO18中位置326的氨基酸E被F置換和在SEQIDNO18中位置327的氨基酸[0126]f)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0127]g)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0128]h)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0129]i)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0130]j)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0131]k)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0132]1)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0133]m)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0134]n)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0135]o)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0136]p)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0137]q)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0138]r)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0139]s)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0140]t)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0141]u)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0142]v)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0143]w)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此[0144]x)具有SEQIDNO18所示的氨基酸序列從位置1至476的氨基酸序列的蛋白，除此u)、v)、w)或x)中所定義的任何氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或所定義的各氨基酸位置分別亦存在于與中所定義的任何氨基酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的蛋白序列的氨基酸序列中對應(yīng)的氨基酸位置。[0146]作為本發(fā)明的實(shí)施方式，包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的具有w-TA變體活性的優(yōu)選優(yōu)選的是如上定義的a)、b)和c)項(xiàng)下所定義的那些蛋白。[0147]表2總結(jié)了與SEQIDNO18中所示的氨基酸序列(從位置1至476)相比在包含進(jìn)一步的氨基酸修飾的@-TA的氨基酸序列中存在的另外的氨基酸修飾。修飾的列中的修飾的QTSCQTQEQTQTFECTITMTYFSFVTRTSTIVGSPTMLKQRLHLCQVTCFKT[0150]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的核酸分子。[0151]根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以是任何種類的核酸，只要核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白即可。核酸可以是核糖核酸分子(例如，RNA、mRNA)或脫氧核糖核酸分子(DNA,包括可包含或[0152]本發(fā)明特別感興趣的是編碼具有w-TA活性的蛋白的核酸分子，所述@-TA包含如SEQIDNO18中的位置1至476所示的氨基酸序列。[0153]因此，本發(fā)明還涉及編碼具有w-TA的活性的蛋白的核酸分子，其選自以下[0154]a)包含SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列的核酸分子；[0155]b)編碼包含SEQIDNO18所示的氨基酸序列中從位置1至476的氨基酸序列的蛋白的核酸分子；[0156]c)與SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的核酸分子，不過對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置73至75的密碼子具有核苷酸序列mgn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置190至192的密碼子具有核苷酸序列ath,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置262至264的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置469至471的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置493至495的密碼子具有核苷酸序列mgn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置505至507的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置520至522的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置589至591的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置559至561的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置715至717的密碼子具有核苷酸序列ccn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置979至981的密碼子具有核苷酸序列IDNO17中核苷酸位置1150至1152的密碼子具有核苷酸序列tgy,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1165至1167的密碼子具有核苷酸序列ytn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1171至1173的密碼子具有核苷酸序列g(shù)ar,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1186至1188的密碼子具有核苷酸序列g(shù)ar,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1228至1230的密碼子具[0157]d)與SEQIDNO17所示的核酸序列中從位置1至1428的核酸序列具有至少60%、優(yōu)選地70%、更優(yōu)選地80%、又更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%、甚至再更優(yōu)選地96%、特別優(yōu)選地97%、最優(yōu)選地98%或特別優(yōu)選地99%同一性的核酸分子，不過對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置4至6的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置73至75的密碼子具有核苷酸序列mgn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置136至138的密碼子具有核苷酸序列atg,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置142至144的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置178至180的密碼子具有核苷酸序列tay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置190至192的密碼子具有核苷酸序列ath,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置205至207的密碼子具有核苷酸序列car,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置262至264的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置268至270的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置469至471的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置490至492的密碼子具有核苷酸序列tty,對17中核苷酸位置505至507的密碼子具有核苷酸序列g(shù)cn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置520至522的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置553至555的密碼子具有核苷酸序列tay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置556至558的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置559至561的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置583至585的密碼子具有核苷酸序列ccn,對應(yīng)于SEQID位置604至606的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置613至615的密碼子具有核苷酸序列tgy,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置715至717的密碼子具有核苷酸序列ccn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置724至726的密碼子具有核苷酸序列IDNO17中核苷酸位置754至756的密碼子具有核苷酸序列ath,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置763至765的密碼子具有核苷酸序列ath,對應(yīng)于SEQIDNO804的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置931至933的密碼子具有核苷酸序列g(shù)tn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置952至954的密碼子具有核苷酸序列IDNO17中核苷酸位置979至981的密苷酸位置982至984的密碼子具有核苷酸序列g(shù)gn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1057至1059的密碼子具有核苷酸序列ytn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1075至1077的密碼子具有核苷酸序列aay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1150至1152的密碼子具有核苷酸序列tay,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1165至1167的密碼子具有核苷酸序列ytn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1171至1173的密碼子具有核苷酸序列g(shù)ar,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1186至1188的密碼子具有核苷酸序列g(shù)ar,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1225至1227的密碼子具有核苷酸序列acn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1228至1230的密碼子具有核苷酸序列mgn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1240至1242的密碼子具有核苷酸序列ytn,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1270至1272的密碼子具有核苷酸序列g(shù)ar,對應(yīng)于SEQIDNO17中核苷酸位置1306至1308的密碼子具有核苷IDNO