亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種發(fā)生于老年和老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是老年期癡呆最常見的類型。隨著全球人口老齡化的加劇，AD的發(fā)病率逐年上升，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)《世界阿爾茨海默病2018年報(bào)告》顯示，每3秒鐘，全球就會新增一位癡呆癥患者，其中約60%-70%患有阿爾茨海默病，我國目前約有1000萬阿爾茨海默病患者。臨床上，AD患者主要表現(xiàn)為記憶力和認(rèn)知功能持續(xù)惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并伴有各種精神癥狀和行為障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。AD的病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確，目前認(rèn)為是老化、遺傳和環(huán)境多種因素共同作用的結(jié)果。在眾多發(fā)病機(jī)制假說中，β類淀粉樣蛋白（βamyloidpeptide，Aβ）級聯(lián)假說影響較為廣泛。該假說認(rèn)為，Aβ在腦內(nèi)的沉積是AD病理改變的核心環(huán)節(jié)。Aβ是淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursorprotein，APP）經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶水解后形成的產(chǎn)物，主要有Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ1-43三種類型。其中，Aβ42/43具有較強(qiáng)的疏水性，容易沉積并產(chǎn)生神經(jīng)毒性。正常情況下，人體腦內(nèi)90％的Aβ為Aβ40，僅有少量的Aβ42/43。然而，在AD患者中，由于APP基因、早老素1基因、早老素2基因突變等遺傳因素的作用，腦內(nèi)Aβ42/Aβ40比例失衡，Aβ42/43增多。增多的Aβ42/43在腦內(nèi)沉積形成老年斑的核心，進(jìn)而引發(fā)一系列病理過程，如激活小膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)炎性反應(yīng)、損害線粒體導(dǎo)致能量代謝障礙和氧化應(yīng)激損害、激活細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活蛋白激酶促進(jìn)tau蛋白異常磷酸化，以及損害膽堿能神經(jīng)元引起乙酰膽堿系統(tǒng)病變等。這些病理改變又會進(jìn)一步促進(jìn)Aβ的生成增多和異常沉積，形成正反饋的級聯(lián)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元減少、遞質(zhì)異常，引發(fā)臨床認(rèn)知和行為癥狀。盡管Aβ沉積是否為AD發(fā)病的起始環(huán)節(jié)仍存在爭議，但大量研究表明，Aβ在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。為了深入研究AD的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法，科研人員建立了多種動物模型，其中APPPS1小鼠模型應(yīng)用廣泛。APPPS1小鼠模型由人類APP（Swedish）和PSEN1（A246E）基因共同轉(zhuǎn)染得到，該模型能夠較好地模擬人類AD的病理特征，如Aβ的過度表達(dá)與沉積、老年斑的形成、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元的丟失等，并且隨著年齡的增長，這些病理特征會逐漸加重。在大約4個(gè)月時(shí)，APPPS1小鼠皮層開始出現(xiàn)淀粉樣斑塊，6個(gè)月左右海馬中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，且斑塊的大小和數(shù)量會隨年齡增長而增加。此外，APPPS1小鼠還會出現(xiàn)tau蛋白的異常磷酸化，通常在12個(gè)月左右開始出現(xiàn)，并隨年齡增長而加劇。這些病理變化與AD患者的病理表現(xiàn)高度相似，為研究AD提供了良好的實(shí)驗(yàn)對象。通過對APPPS1小鼠模型的研究，科研人員能夠更深入地了解AD的發(fā)病機(jī)制，評估各種治療方法的效果，為AD的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。亞甲藍(lán)（MethyleneBlue，MB）作為一種傳統(tǒng)藥物，近年來在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。亞甲藍(lán)具有多種藥理作用，包括抗凋亡、抗炎、激活自噬、抑制形狀不規(guī)則的蛋白質(zhì)聚集以及抑制NO合酶等。在AD的發(fā)病機(jī)制以及腦缺血和創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）氧化應(yīng)激的發(fā)病機(jī)制中，均涉及進(jìn)行性炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、血腦屏障功能障礙和自噬的過度激活等過程，而亞甲藍(lán)的這些作用使其有可能對AD的病理過程產(chǎn)生影響。研究表明，亞甲藍(lán)可以通過多種途徑調(diào)節(jié)AD相關(guān)的病理生理過程，如抑制Aβ的聚集、減少tau蛋白的磷酸化、減輕神經(jīng)炎癥以及改善線粒體功能等。然而，目前關(guān)于亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究還相對較少，其具體作用機(jī)制尚未完全明確。深入研究亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，不僅有助于進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制，還可能為AD的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在AD發(fā)病機(jī)制的研究方面，Aβ級聯(lián)假說占據(jù)重要地位。該假說認(rèn)為Aβ在腦內(nèi)的異常沉積是AD病理改變的核心起始事件。Aβ由APP經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶水解產(chǎn)生，其中Aβ42/43因其特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，容易聚集形成淀粉樣斑塊，進(jìn)而引發(fā)一系列神經(jīng)毒性反應(yīng)。眾多研究圍繞Aβ的產(chǎn)生、聚集、清除以及其對神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制展開。有研究通過對AD患者腦樣本的分析，發(fā)現(xiàn)Aβ沉積與神經(jīng)元丟失、神經(jīng)炎癥等病理變化密切相關(guān)；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型研究中，也進(jìn)一步證實(shí)了Aβ的神經(jīng)毒性作用。然而，隨著研究的深入，Aβ級聯(lián)假說也面臨一些挑戰(zhàn)，例如部分研究發(fā)現(xiàn)Aβ沉積與AD臨床癥狀的嚴(yán)重程度并不完全一致，以及在沒有明顯Aβ沉積的情況下，也可能出現(xiàn)AD相關(guān)的病理改變，這表明AD的發(fā)病機(jī)制可能更為復(fù)雜，并非單一的Aβ級聯(lián)反應(yīng)所能完全解釋。除了Aβ級聯(lián)假說，tau蛋白異常磷酸化假說也備受關(guān)注。tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白，在維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。在AD患者中，tau蛋白發(fā)生異常過度磷酸化，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損和死亡。研究表明，tau蛋白的異常磷酸化可能與Aβ的沉積相互作用，共同促進(jìn)AD的發(fā)展，但tau蛋白磷酸化究竟是AD發(fā)病的原發(fā)因素還是繼發(fā)于Aβ異常，目前尚未明確。此外，還有遺傳假說、氧化應(yīng)激假說、神經(jīng)遞質(zhì)假說、免疫炎性機(jī)制假說、微循環(huán)障礙假說等多種學(xué)說從不同角度對AD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡述。遺傳因素在AD發(fā)病中起著重要作用，早發(fā)性AD多與APP、PS1、PS2等基因突變相關(guān)，而晚發(fā)性AD與載脂蛋白E（ApoE）ε4基因型密切相關(guān)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷、神經(jīng)遞質(zhì)失衡引起的神經(jīng)傳遞異常、免疫炎癥反應(yīng)造成的神經(jīng)組織損傷以及微循環(huán)障礙引發(fā)的腦供血不足等，都被認(rèn)為可能參與AD的發(fā)病過程，且這些因素之間相互關(guān)聯(lián)，共同影響著AD的發(fā)生和發(fā)展。在AD的治療研究領(lǐng)域，目前的治療方法主要包括藥物治療和非藥物治療。藥物治療方面，雖然有一些藥物被批準(zhǔn)用于臨床，但這些藥物大多只能緩解癥狀，無法阻止疾病的進(jìn)展。以膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑為代表的傳統(tǒng)藥物，主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)來改善患者的認(rèn)知和行為癥狀，但對Aβ沉積和tau蛋白異常等病理改變并無明顯作用。近年來，針對Aβ和tau蛋白的靶向治療成為研究熱點(diǎn)。一些單抗藥物如侖卡奈單抗和多奈單抗，能夠特異性地識別和清除Aβ，在臨床試驗(yàn)中顯示出一定的療效，可減緩早期AD患者認(rèn)知能力下降的速度。然而，這些藥物也存在副作用，如腦水腫、微出血等，且價(jià)格昂貴，限制了其臨床應(yīng)用。針對tau蛋白的治療藥物研發(fā)難度較大，目前仍處于探索階段，主要面臨藥物難以穿過血腦屏障以及如何精準(zhǔn)清除異常tau蛋白而不影響正常tau蛋白功能等問題。非藥物治療包括認(rèn)知訓(xùn)練、運(yùn)動療法、音樂療法、光照療法等，這些方法可以在一定程度上改善患者的認(rèn)知功能和生活質(zhì)量，但效果相對有限。亞甲藍(lán)作為一種傳統(tǒng)藥物，在AD治療研究中逐漸嶄露頭角。其具有多種藥理活性，為AD的治療提供了新的思路。在抗凋亡方面，亞甲藍(lán)能夠抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能。在抗炎作用上，亞甲藍(lán)可以抑制炎癥因子的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低炎癥對神經(jīng)組織的損傷。亞甲藍(lán)還能夠激活自噬，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器的清除，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。并且，亞甲藍(lán)能夠抑制形狀不規(guī)則的蛋白質(zhì)聚集，包括Aβ和tau蛋白的聚集，減少其對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。此外，亞甲藍(lán)還可以抑制NO合酶，減少一氧化氮的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激損傷。已有研究表明，亞甲藍(lán)可以改善AD動物模型的認(rèn)知功能，降低腦內(nèi)Aβ的水平，減少tau蛋白的磷酸化。然而，當(dāng)前關(guān)于亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究還不夠深入和系統(tǒng)。在現(xiàn)有研究中，對于亞甲藍(lán)作用于APPPS1小鼠的具體劑量、給藥時(shí)間和方式等方面的研究還存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果的可比性和一致性受到影響。對于亞甲藍(lán)調(diào)節(jié)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的具體分子機(jī)制，目前尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步深入研究，以揭示其在AD治療中的潛在價(jià)值和作用機(jī)制。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的作用機(jī)制。通過運(yùn)用行為學(xué)測試、免疫組化、蛋白免疫印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對比分析亞甲藍(lán)干預(yù)前后APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)中Aβ的沉積情況，以及相關(guān)蛋白如tau蛋白、炎癥因子、凋亡相關(guān)蛋白等的表達(dá)變化，全面評估亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠AD樣病理改變的影響。AD作為一種嚴(yán)重危害老年人健康的神經(jīng)退行性疾病，目前缺乏有效的根治方法。深入研究AD的發(fā)病機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物，對于改善AD患者的預(yù)后、減輕家庭和社會負(fù)擔(dān)具有至關(guān)重要的意義。亞甲藍(lán)作為一種具有多種藥理活性的藥物，在AD治療研究中展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究聚焦于亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，有望從分子和細(xì)胞水平揭示亞甲藍(lán)治療AD的作用機(jī)制，為AD的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。同時(shí)，本研究結(jié)果也可能為開發(fā)基于亞甲藍(lán)的新型AD治療藥物奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物本實(shí)驗(yàn)選用60只6月齡APPPS1轉(zhuǎn)基因小鼠，購自上海南方模式生物科技股份有限公司。該品系小鼠由人類APP（Swedish）和PSEN1（A246E）基因共同轉(zhuǎn)染得到，能夠穩(wěn)定表達(dá)突變基因，進(jìn)而模擬人類AD的病理進(jìn)程。同時(shí)，選取30只同背景、同月齡的野生型C57BL/6小鼠作為對照，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±5）%、12h光照/12h黑暗循環(huán)的SPF級動物房內(nèi)，自由攝食和飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后，將APPPS1小鼠隨機(jī)分為模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組，每組20只；野生型小鼠作為正常對照組，共30只。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需主要試劑如下：亞甲藍(lán)購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，用于制備不同濃度的給藥溶液；兔抗小鼠Aβ多克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化tau蛋白（p-tau）抗體、兔抗小鼠β-actin抗體均購自Abcam公司，用于免疫組化和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中特異性識別相應(yīng)蛋白；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)信號；BCA蛋白定量試劑盒購自ThermoFisherScientific公司，用于測定組織蛋白濃度；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Bio-Rad公司，用于蛋白免疫印跡結(jié)果的顯色檢測；其余常規(guī)試劑如甲醇、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅等均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：電子天平（Sartorius，精度0.0001g），用于稱量亞甲藍(lán)等試劑；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于組織勻漿的離心分離；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientificMultiskanGO），用于ELISA實(shí)驗(yàn)中吸光度的測定；熒光顯微鏡（OlympusIX73），用于免疫組化切片的觀察和拍照；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP），用于蛋白免疫印跡結(jié)果的成像分析；手術(shù)器械一套（包括手術(shù)刀、鑷子、剪刀等），用于小鼠的取材操作；灌流裝置，用于小鼠腦組織的灌流固定；石蠟包埋機(jī)（LeicaEG1150H）和切片機(jī)（LeicaRM2235），用于制作石蠟切片；恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于試劑的加熱和孵育過程。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1動物模型建立與處理APPPS1小鼠模型已由上海南方模式生物科技股份有限公司通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)直接購入6月齡APPPS1轉(zhuǎn)基因小鼠，其已穩(wěn)定表達(dá)人類APP（Swedish）和PSEN1（A246E）突變基因。小鼠購入后，在SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。亞甲藍(lán)給藥采用灌胃方式。將亞甲藍(lán)用生理鹽水配制成低劑量（10mg/kg）和高劑量（20mg/kg）兩種溶液。亞甲藍(lán)低劑量組小鼠每日灌胃給予10mg/kg亞甲藍(lán)溶液，亞甲藍(lán)高劑量組小鼠每日灌胃給予20mg/kg亞甲藍(lán)溶液，灌胃體積均為10mL/kg。模型組和正常對照組小鼠每日灌胃給予等體積的生理鹽水。給藥周期為連續(xù)8周，期間密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、飲水、活動量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等情況，并記錄體重變化。2.2.2行為學(xué)檢測采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)直徑120cm、高50cm的圓形水池和一個(gè)直徑10cm的透明平臺組成，水池分為四個(gè)象限，平臺固定在其中一個(gè)象限的中心位置，水面高出平臺1-2cm，并加入適量奶粉使水呈不透明狀態(tài)，以隱匿平臺。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段。定位航行實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5天，每天每個(gè)小鼠從不同象限的邊緣面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺的時(shí)間（逃避潛伏期），若60s內(nèi)未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺上停留15s，逃避潛伏期記為60s?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第6天進(jìn)行，撤除平臺，將小鼠從與平臺相對的象限邊緣放入水中，記錄60s內(nèi)小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間，以此評估小鼠對平臺位置的記憶保持能力。采用跳臺實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的被動回避學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)方形有機(jī)玻璃箱，底部為銅柵，箱內(nèi)一角放置一個(gè)高3.5cm、直徑6.5cm的絕緣平臺。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將小鼠置于平臺上，適應(yīng)環(huán)境3min后，給予銅柵通電（電壓36V，電流0.2mA），記錄小鼠從平臺跳下并受到電擊的潛伏期（首次錯(cuò)誤潛伏期）以及5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)（跳下平臺并受到電擊的次數(shù)）。24h后進(jìn)行記憶測試，再次將小鼠置于平臺上，記錄其首次錯(cuò)誤潛伏期和5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，與初次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，評估小鼠的記憶鞏固和再現(xiàn)能力。2.2.3樣本采集與處理行為學(xué)檢測結(jié)束后，將小鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，然后經(jīng)左心室插管，先用生理鹽水快速沖洗，待流出液澄清后，再用4%多聚甲醛固定液進(jìn)行灌流固定。灌流結(jié)束后，迅速取出小鼠大腦，置于4%多聚甲醛固定液中后固定24h，然后將大腦標(biāo)本進(jìn)行梯度蔗糖脫水（10%蔗糖溶液脫水12h，20%蔗糖溶液脫水12h，30%蔗糖溶液脫水至沉底）。脫水后的大腦標(biāo)本用于制作冰凍切片，切片厚度為10μm，用于免疫組化檢測。另取一部分小鼠，同樣麻醉后，迅速斷頭取腦，分離出海馬組織，將海馬組織置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，去除表面的血跡和雜質(zhì)，用濾紙吸干水分后，稱重并記錄。將海馬組織一部分置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于Westernblot檢測蛋白表達(dá)和qRT-PCR檢測基因表達(dá)；另一部分加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分勻漿，4℃、12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用于ELISA檢測Aβ含量。2.2.4檢測指標(biāo)與方法采用ELISA法檢測海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。具體操作步驟如下：將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，4℃過夜；次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5min；加入5%BSA封閉液，37℃孵育2h；棄去封閉液，洗滌后加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，37℃孵育2h；洗滌后加入HRP標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1h；再次洗滌后加入TMB底物顯色液，37℃避光顯色15-20min；最后加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。該方法基于雙抗體夾心原理，利用捕獲抗體和檢測抗體特異性識別Aβ，通過酶催化底物顯色，吸光度值與Aβ含量呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對Aβ含量的定量檢測。采用免疫組化法檢測海馬組織中Aβ、p-tau蛋白的表達(dá)和分布。具體操作如下：將冰凍切片用4%多聚甲醛固定15min，PBST洗滌3次；用0.3%TritonX-100通透15min，PBST洗滌；5%BSA封閉1h；加入一抗（兔抗小鼠Aβ多克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化tau蛋白抗體，稀釋比例1:200），4℃孵育過夜；PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1:500），37℃孵育1h；PBST洗滌后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析陽性信號的強(qiáng)度和分布情況。其原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合，通過二抗標(biāo)記的HRP催化DAB顯色，使陽性部位呈現(xiàn)棕色，從而直觀地觀察蛋白的表達(dá)和分布。采用Westernblot檢測海馬組織中Aβ、p-tau、總tau蛋白、炎癥因子（如IL-1β、TNF-α）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2）等的表達(dá)水平。具體步驟為：取適量海馬組織蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離；電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1-2h；加入一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜；TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1h；TBST洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。該方法通過電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后利用抗原抗體特異性結(jié)合，最后通過化學(xué)發(fā)光檢測目的蛋白，條帶灰度值反映蛋白表達(dá)量。采用qRT-PCR檢測海馬組織中APP、BACE1、PS1等與Aβ生成相關(guān)基因以及炎癥因子、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。具體操作：提取海馬組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；反應(yīng)體系包括cDNA、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。其原理是通過逆轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用PCR擴(kuò)增目的基因，根據(jù)熒光信號強(qiáng)度監(jiān)測擴(kuò)增過程，Ct值與起始模板量呈負(fù)相關(guān)，通過與內(nèi)參基因比較，計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示。對于多組間數(shù)據(jù)的比較，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步使用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行組間兩兩比較。對于兩組數(shù)據(jù)的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析前，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，確保數(shù)據(jù)符合相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析要求。在圖表繪制方面，使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行圖表制作，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀、清晰地呈現(xiàn)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在定位航行實(shí)驗(yàn)階段，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，正常對照組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，表明其學(xué)習(xí)能力正常，能夠快速找到隱藏平臺；模型組小鼠的逃避潛伏期明顯長于正常對照組，且縮短速度較慢，說明APPPS1小鼠存在空間學(xué)習(xí)障礙。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠的逃避潛伏期均短于模型組，且高劑量組縮短更為明顯（P<0.01），表明亞甲藍(lán)干預(yù)能夠改善APPPS1小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，且呈劑量依賴性，具體數(shù)據(jù)如圖1所示。[此處插入定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)變化的折線圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四條曲線，橫坐標(biāo)為訓(xùn)練天數(shù)，縱坐標(biāo)為逃避潛伏期（s），不同組別的曲線用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明][此處插入定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)變化的折線圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四條曲線，橫坐標(biāo)為訓(xùn)練天數(shù)，縱坐標(biāo)為逃避潛伏期（s），不同組別的曲線用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]在空間探索實(shí)驗(yàn)中，正常對照組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)較多，且在目標(biāo)象限的停留時(shí)間占總時(shí)間的比例較高，表明其對平臺位置有良好的記憶；模型組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)明顯少于正常對照組，在目標(biāo)象限的停留時(shí)間占比也顯著降低（P<0.01），說明APPPS1小鼠的空間記憶能力受損。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)均多于模型組，高劑量組差異更為顯著（P<0.01），在目標(biāo)象限的停留時(shí)間占比也明顯增加（P<0.05），說明亞甲藍(lán)能夠改善APPPS1小鼠的空間記憶能力，高劑量效果更為突出，具體數(shù)據(jù)如表1所示。[此處插入空間探索實(shí)驗(yàn)中不同組別小鼠穿越原平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為穿越原平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比（%），每個(gè)組別對應(yīng)兩個(gè)柱子，分別表示穿越原平臺次數(shù)和停留時(shí)間占比，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表1Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（[此處插入空間探索實(shí)驗(yàn)中不同組別小鼠穿越原平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為穿越原平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比（%），每個(gè)組別對應(yīng)兩個(gè)柱子，分別表示穿越原平臺次數(shù)和停留時(shí)間占比，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表1Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=20）組別穿越原平臺次數(shù)在目標(biāo)象限停留時(shí)間占比（%）正常對照組12.5±2.145.6±5.2模型組5.3±1.5**28.3±4.1**亞甲藍(lán)低劑量組7.8±1.8#34.5±4.5#亞甲藍(lán)高劑量組10.2±2.0##40.1±4.8##注：與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在初次實(shí)驗(yàn)中，正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠的首次錯(cuò)誤潛伏期和5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)無明顯差異。在24h后的記憶測試中，正常對照組小鼠的首次錯(cuò)誤潛伏期明顯延長，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，說明正常小鼠能夠較好地鞏固和再現(xiàn)記憶；模型組小鼠的首次錯(cuò)誤潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加（P<0.01），顯示APPPS1小鼠的被動回避學(xué)習(xí)記憶能力受損。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠的首次錯(cuò)誤潛伏期均長于模型組，錯(cuò)誤次數(shù)少于模型組，高劑量組差異更顯著（P<0.01），表明亞甲藍(lán)能夠改善APPPS1小鼠的被動回避學(xué)習(xí)記憶能力，高劑量效果更佳，具體數(shù)據(jù)如表2所示。[此處插入跳臺實(shí)驗(yàn)中不同組別小鼠初次實(shí)驗(yàn)和記憶測試的首次錯(cuò)誤潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為首次錯(cuò)誤潛伏期（s）和錯(cuò)誤次數(shù)，每個(gè)組別對應(yīng)四個(gè)柱子，分別表示初次實(shí)驗(yàn)的首次錯(cuò)誤潛伏期、初次實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)、記憶測試的首次錯(cuò)誤潛伏期、記憶測試的錯(cuò)誤次數(shù)，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表2跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果（[此處插入跳臺實(shí)驗(yàn)中不同組別小鼠初次實(shí)驗(yàn)和記憶測試的首次錯(cuò)誤潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為首次錯(cuò)誤潛伏期（s）和錯(cuò)誤次數(shù)，每個(gè)組別對應(yīng)四個(gè)柱子，分別表示初次實(shí)驗(yàn)的首次錯(cuò)誤潛伏期、初次實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤次數(shù)、記憶測試的首次錯(cuò)誤潛伏期、記憶測試的錯(cuò)誤次數(shù)，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表2跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=20）組別初次實(shí)驗(yàn)首次錯(cuò)誤潛伏期（s）初次實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)記憶測試首次錯(cuò)誤潛伏期（s）記憶測試錯(cuò)誤次數(shù)正常對照組20.5±3.25.6±1.285.6±10.22.1±0.5模型組21.3±3.55.8±1.335.2±8.1**7.6±1.5**亞甲藍(lán)低劑量組20.8±3.35.7±1.455.4±9.5#5.2±1.2#亞甲藍(lán)高劑量組21.1±3.45.9±1.370.1±10.0##3.8±1.0##注：與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.013.2亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ表達(dá)的影響ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42的含量顯著高于正常對照組（P<0.01），這與APPPS1小鼠模型中Aβ異常生成和沉積的病理特征相符。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42的含量均低于模型組，且高劑量組降低更為明顯（P<0.01），表明亞甲藍(lán)能夠劑量依賴性地降低APPPS1小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42的含量，具體數(shù)據(jù)如表3所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為Aβ40和Aβ42含量（pg/mgprotein），每個(gè)組別對應(yīng)兩個(gè)柱子，分別表示Aβ40和Aβ42含量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表3不同組別小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42含量（[此處插入不同組別小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42含量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為Aβ40和Aβ42含量（pg/mgprotein），每個(gè)組別對應(yīng)兩個(gè)柱子，分別表示Aβ40和Aβ42含量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]表3不同組別小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42含量（表3不同組別小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42含量（x±s，n=20，pg/mgprotein）組別Aβ40含量Aβ42含量正常對照組156.3±25.156.8±10.2模型組325.6±45.3**120.5±20.1**亞甲藍(lán)低劑量組256.8±35.2#95.6±15.3#亞甲藍(lán)高劑量組180.2±28.5##70.1±12.5##注：與正常對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組小鼠海馬組織中Aβ陽性染色較少，主要分布在神經(jīng)元周圍，且染色強(qiáng)度較弱。模型組小鼠海馬組織中Aβ陽性染色明顯增多，主要聚集在細(xì)胞外形成淀粉樣斑塊，染色強(qiáng)度較強(qiáng)，在海馬CA1、CA3和齒狀回等區(qū)域均有大量沉積。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中Aβ陽性染色均有所減少，高劑量組減少更為顯著，淀粉樣斑塊的數(shù)量和大小均明顯降低，表明亞甲藍(lán)能夠抑制APPPS1小鼠海馬組織中Aβ的沉積，高劑量效果更優(yōu)，具體如圖2所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織Aβ免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的Aβ陽性染色情況，Aβ陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織Aβ免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的Aβ陽性染色情況，Aβ陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明]Westernblot檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中Aβ蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.01）。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中Aβ蛋白的表達(dá)水平均低于模型組，高劑量組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了亞甲藍(lán)能夠抑制APPPS1小鼠海馬組織中Aβ蛋白的表達(dá)，且高劑量亞甲藍(lán)的抑制作用更強(qiáng)，具體數(shù)據(jù)和條帶圖如圖3所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織Aβ蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖，條帶圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組條帶，β-actin作為內(nèi)參，柱狀圖橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為Aβ蛋白相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織Aβ蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖，條帶圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組條帶，β-actin作為內(nèi)參，柱狀圖橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為Aβ蛋白相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]3.3亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1陽性染色較少，主要分布在神經(jīng)元胞漿內(nèi)，染色強(qiáng)度較弱。模型組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1陽性染色明顯增多，在海馬CA1、CA3和齒狀回等區(qū)域均有大量表達(dá)，染色強(qiáng)度較強(qiáng)。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1陽性染色均有所減少，高劑量組減少更為顯著，表明亞甲藍(lán)能夠抑制APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1的表達(dá)，且高劑量效果更明顯，具體如圖4所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的APP、PS1、BACE1陽性染色情況，陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的APP、PS1、BACE1陽性染色情況，陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明]免疫組化檢測IDE表達(dá)情況時(shí)，正常對照組小鼠海馬組織中IDE陽性染色較多，均勻分布在神經(jīng)元內(nèi)。模型組小鼠海馬組織中IDE陽性染色明顯減少，分布稀疏。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中IDE陽性染色均有所增加，高劑量組增加更為顯著，表明亞甲藍(lán)能夠促進(jìn)APPPS1小鼠海馬組織中IDE的表達(dá)，高劑量作用更突出，具體如圖5所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織IDE免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的IDE陽性染色情況，陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織IDE免疫組化染色圖，圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組圖片，每組圖片展示海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)域的IDE陽性染色情況，陽性部位呈棕色，圖片放大倍數(shù)一致，并配有清晰的標(biāo)尺和圖注說明]通過Westernblot對相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.01），而IDE蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常對照組（P<0.01）。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1蛋白的表達(dá)水平均低于模型組，高劑量組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；IDE蛋白的表達(dá)水平均高于模型組，高劑量組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步表明亞甲藍(lán)能夠調(diào)節(jié)APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1和IDE蛋白的表達(dá)，高劑量亞甲藍(lán)的調(diào)節(jié)作用更強(qiáng)，具體數(shù)據(jù)和條帶圖如圖6所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1、IDE蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖，條帶圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組條帶，β-actin作為內(nèi)參，柱狀圖橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為APP、PS1、BACE1、IDE蛋白相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1、IDE蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖，條帶圖中包含正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組四組條帶，β-actin作為內(nèi)參，柱狀圖橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)分別為APP、PS1、BACE1、IDE蛋白相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，并配有清晰的圖例說明]3.4亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)基因表達(dá)的影響通過qRT-PCR檢測APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1、IDE等相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P<0.01），表明APPPS1小鼠模型中Aβ生成相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，這與Aβ的異常生成和沉積密切相關(guān)。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1基因mRNA的表達(dá)水平均低于模型組，高劑量組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明亞甲藍(lán)能夠抑制APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1基因的表達(dá)，且高劑量亞甲藍(lán)的抑制作用更強(qiáng)，具體數(shù)據(jù)和柱狀圖如圖7所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因mRNA相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，分別代表正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組，并配有清晰的圖例說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織APP、PS1、BACE1基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因mRNA相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，分別代表正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組，并配有清晰的圖例說明]而在IDE基因mRNA表達(dá)水平上，模型組小鼠海馬組織中IDE基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于正常對照組（P<0.01），提示APPPS1小鼠模型中Aβ清除相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致Aβ清除障礙，進(jìn)而加重Aβ在腦內(nèi)的沉積。亞甲藍(lán)低劑量組和高劑量組小鼠海馬組織中IDE基因mRNA的表達(dá)水平均高于模型組，高劑量組差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明亞甲藍(lán)能夠促進(jìn)APPPS1小鼠海馬組織中IDE基因的表達(dá)，高劑量亞甲藍(lán)的促進(jìn)作用更為明顯，具體數(shù)據(jù)和柱狀圖如圖8所示。[此處插入不同組別小鼠海馬組織IDE基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因mRNA相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，分別代表正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組，并配有清晰的圖例說明][此處插入不同組別小鼠海馬組織IDE基因mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為基因mRNA相對表達(dá)量，柱子用不同顏色區(qū)分，分別代表正常對照組、模型組、亞甲藍(lán)低劑量組、亞甲藍(lán)高劑量組，并配有清晰的圖例說明]四、討論4.1亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響機(jī)制探討本研究通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)能夠顯著改善APPPS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的定位航行階段，亞甲藍(lán)干預(yù)組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，表明其空間學(xué)習(xí)能力得到提升；在空間探索階段，干預(yù)組小鼠穿越原平臺位置的次數(shù)增多，在目標(biāo)象限的停留時(shí)間占比增加，說明其空間記憶能力增強(qiáng)。跳臺實(shí)驗(yàn)中，亞甲藍(lán)干預(yù)組小鼠在記憶測試時(shí)的首次錯(cuò)誤潛伏期延長，錯(cuò)誤次數(shù)減少，顯示出被動回避學(xué)習(xí)記憶能力的改善。這些行為學(xué)上的改善與海馬結(jié)構(gòu)中Aβ水平的降低密切相關(guān)。Aβ在腦內(nèi)的異常沉積是AD的重要病理特征之一，也是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的關(guān)鍵因素。Aβ可以通過多種途徑損害神經(jīng)元功能，如誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、引發(fā)炎癥反應(yīng)、破壞突觸結(jié)構(gòu)和功能等。本研究中，ELISA、免疫組化和Westernblot結(jié)果均表明，亞甲藍(lán)能夠劑量依賴性地降低APPPS1小鼠海馬組織中Aβ40和Aβ42的含量，減少Aβ的沉積和蛋白表達(dá)。Aβ水平的降低可能減輕了其對神經(jīng)元的毒性作用，從而改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善還可能與相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。在蛋白水平上，APP、PS1、BACE1是Aβ生成過程中的關(guān)鍵蛋白，APP在BACE1和PS1的作用下被切割產(chǎn)生Aβ。本研究中，亞甲藍(lán)能夠抑制APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1蛋白的表達(dá)，減少Aβ的生成。同時(shí)，亞甲藍(lán)促進(jìn)了IDE蛋白的表達(dá)，IDE是一種重要的Aβ降解酶，其表達(dá)增加有助于加速Aβ的清除。在基因水平上，亞甲藍(lán)同樣抑制了APP、PS1、BACE1基因的表達(dá)，促進(jìn)了IDE基因的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了Aβ的生成和清除。這些蛋白和基因表達(dá)的變化協(xié)同作用，使得海馬組織中Aβ水平降低，進(jìn)而改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，亞甲藍(lán)可能通過其他機(jī)制改善APPPS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。亞甲藍(lán)具有抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，能夠減少自由基的產(chǎn)生，抑制炎癥因子的釋放。在AD的病理過程中，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會進(jìn)一步損傷神經(jīng)元，加重學(xué)習(xí)記憶障礙。亞甲藍(lán)的抗氧化和抗炎作用可能減輕了神經(jīng)元的損傷，為學(xué)習(xí)記憶能力的改善提供了有利的微環(huán)境。亞甲藍(lán)還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、促進(jìn)神經(jīng)元的存活和再生等途徑來改善學(xué)習(xí)記憶能力，這些機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。4.2亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ表達(dá)的影響機(jī)制分析Aβ的產(chǎn)生源于APP在β分泌酶（BACE1）和γ分泌酶（由PS1等組成）的依次作用下被切割。在APPPS1小鼠模型中，由于轉(zhuǎn)染的突變基因，APP、PS1和BACE1的表達(dá)異常升高，導(dǎo)致Aβ生成顯著增多。本研究結(jié)果顯示，亞甲藍(lán)能夠顯著抑制APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1和BACE1蛋白及基因的表達(dá)。亞甲藍(lán)可能通過與這些蛋白或基因的特定部位相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而減少APP、PS1和BACE1的表達(dá)量。有研究表明，某些小分子化合物可以通過與基因啟動子區(qū)域結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。亞甲藍(lán)可能具有類似的作用機(jī)制，通過與APP、PS1和BACE1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，從源頭減少Aβ的生成。Aβ的清除主要依賴于酶解途徑，其中胰島素降解酶（IDE）是一種重要的Aβ降解酶。在正常生理狀態(tài)下，IDE能夠有效地降解Aβ，維持腦內(nèi)Aβ的動態(tài)平衡。然而，在APPPS1小鼠模型中，本研究發(fā)現(xiàn)IDE的表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致Aβ清除障礙，進(jìn)而在腦內(nèi)大量沉積。亞甲藍(lán)干預(yù)后，APPPS1小鼠海馬組織中IDE的表達(dá)明顯增加，無論是在蛋白水平還是基因水平，均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)。亞甲藍(lán)可能通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)IDE基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加IDE的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物可以通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)IDE的表達(dá)。亞甲藍(lán)或許也能激活類似的信號通路，使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化并激活，與IDE基因啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)IDE基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)Aβ的清除能力，降低海馬組織中Aβ的水平。Aβ具有聚集傾向，其寡聚體和纖維狀聚集體具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性。亞甲藍(lán)的平面多環(huán)結(jié)構(gòu)使其能夠與Aβ分子相互作用，干擾Aβ的聚集過程。亞甲藍(lán)可能通過與Aβ的疏水區(qū)域結(jié)合，破壞Aβ分子間的相互作用，阻止Aβ寡聚體和纖維狀聚集體的形成。研究表明，亞甲藍(lán)可以插入到Aβ的β-折疊結(jié)構(gòu)中，改變其構(gòu)象，抑制Aβ的聚集。這種抑制作用減少了具有神經(jīng)毒性的Aβ聚集體的產(chǎn)生，降低了Aβ對神經(jīng)元的損傷，從而減輕AD的病理進(jìn)程。此外，亞甲藍(lán)還可能通過其抗氧化和抗炎作用，減輕Aβ聚集引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。在Aβ聚集過程中，會產(chǎn)生大量的自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激，同時(shí)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥。亞甲藍(lán)能夠清除自由基，抑制炎癥因子的釋放，緩解氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥對神經(jīng)元的損害，為神經(jīng)元提供一個(gè)相對穩(wěn)定的微環(huán)境，有利于維持神經(jīng)元的正常功能。4.3亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響及意義APPPS1小鼠海馬組織中APP、PS1和BACE1蛋白及基因的高表達(dá)，會導(dǎo)致Aβ生成顯著增多。亞甲藍(lán)能夠顯著抑制這些蛋白和基因的表達(dá)，這一調(diào)節(jié)作用具有重要意義。從蛋白層面來看，亞甲藍(lán)可能通過與APP、PS1和BACE1蛋白的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域相互作用，改變其空間構(gòu)象，從而抑制它們在Aβ生成過程中的酶切活性。從基因轉(zhuǎn)錄水平分析，亞甲藍(lán)可能作用于APP、PS1和BACE1基因的啟動子區(qū)域，影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，抑制基因的轉(zhuǎn)錄起始，進(jìn)而減少mRNA的合成，最終導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)量降低。這種對Aβ生成相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的抑制，從源頭上減少了Aβ的產(chǎn)生，對緩解AD病理進(jìn)程至關(guān)重要。Aβ的大量生成是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素，減少Aβ生成可有效降低其在腦內(nèi)沉積，減輕神經(jīng)毒性，保護(hù)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，為改善AD患者的認(rèn)知功能提供了基礎(chǔ)。IDE是Aβ降解的關(guān)鍵酶，在APPPS1小鼠模型中，其表達(dá)顯著降低，致使Aβ清除受阻。亞甲藍(lán)干預(yù)后，APPPS1小鼠海馬組織中IDE的表達(dá)在蛋白和基因水平均明顯增加。亞甲藍(lán)促進(jìn)IDE表達(dá)的機(jī)制可能涉及激活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。如激活PI3K/Akt信號通路，該通路被激活后，可使下游的轉(zhuǎn)錄因子如CREB等發(fā)生磷酸化而激活，磷酸化的CREB結(jié)合到IDE基因啟動子區(qū)域的相應(yīng)順式作用元件上，增強(qiáng)IDE基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)IDE蛋白的合成。IDE表達(dá)增加能夠增強(qiáng)Aβ的降解清除能力，維持腦內(nèi)Aβ的動態(tài)平衡，減少Aβ在海馬組織中的沉積和聚集，降低Aβ對神經(jīng)元的毒性損傷，對改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)功能具有積極作用。亞甲藍(lán)對APPPS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)中APP、PS1、BACE1和IDE蛋白及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，是其降低Aβ水平、改善AD病理進(jìn)程的重要分子機(jī)制。通過抑制Aβ生成相關(guān)蛋白和基因表達(dá)，減少Aβ的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)Aβ降解酶IDE的表達(dá)，加速Aβ的清除，亞甲藍(lán)從兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)對Aβ代謝進(jìn)行調(diào)控，為AD的治療提供了新的作用靶點(diǎn)和潛在治療策略，深入研究其作用機(jī)制有助于進(jìn)一步開發(fā)基于亞甲藍(lán)的AD治療藥物。4.4研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明亞甲藍(lán)能夠改善APPPS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，降低海馬組織中Aβ的表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，這為AD的治療提供了新的潛在策略。在臨床應(yīng)用前景方面，亞甲藍(lán)作為一種已在臨床上應(yīng)用多年的藥物，具有一定的安全性和耐受性，這為其進(jìn)一步開發(fā)用于AD治療提供了有利條件。如果后續(xù)的臨床試驗(yàn)?zāi)軌蜃C實(shí)亞甲藍(lán)對AD患者的有效性，那么它有可能成為一種新的AD治療藥物，為AD患者帶來新的治療選擇。亞甲藍(lán)的作用機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，包括抑制Aβ生成、促進(jìn)Aβ清除、抗氧化應(yīng)激和抗炎等，這種多靶點(diǎn)的作用方式可能比單一靶點(diǎn)的治療方法更具優(yōu)勢