ICS65.020.30CCSB44DB65/T4714—2023實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠全流程管理技術規(guī)范Laboratoryanimal——TechnicalspecificationforwholeprocessmanagementofRncat2024-02-23發(fā)布2024-04-10實施新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB65/T4714—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心提出。本文件由新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會歸口并組織實施。本文件起草單位：新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心、天康生物制藥有限公司、新疆維吾爾自治區(qū)標準化研究院。本文件主要起草人：安冉、張燕、袁江玲、艾山江·哈德爾、陳欣如、雒濤、趙國玉、艾山·艾比布勒、史深、卡迪麗亞·賽都拉、艾爾肯·塔西鐵木爾、蔣健、徐佳麗、張段段、李麗、胡小明、文紅梅、石佳瑋、曹劍。本文件實施應用中的疑問，請咨詢新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心。對本文件的修改意見及建議，請反饋至新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(烏魯木齊市龍泉街191號)、新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心(烏魯木齊市堿泉一街380號)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號)。新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心聯(lián)系電話傳真郵編：830002新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會聯(lián)系電話傳真郵編：830001新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：830004DB65/T4714—20231實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠全流程管理技術規(guī)范本文件規(guī)定了實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠的基本條件、生產(chǎn)管理、組織病理學檢查、遺傳質(zhì)量監(jiān)測、廢棄物處理及記錄檔案管理的要求。本文件適用于實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠的全流程管理及質(zhì)量的控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB14922實驗動物微生物、寄生蟲學等級及監(jiān)測GB14923實驗動物遺傳質(zhì)量控制GB14924.3實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分GB14925實驗動物環(huán)境及設施GB/T34791實驗動物質(zhì)量控制要求GB/Z34792實驗動物引種技術規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1先天性白內(nèi)障小鼠Rncat經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物和寄生蟲實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚，用于科學研究、教學、生產(chǎn)、檢驗以及其他科學實驗的，先天存在出生后自發(fā)晶體混濁形成白內(nèi)障的小鼠。3.2核心群coregroup保持先天性白內(nèi)障小鼠種群自身的傳代繁衍和為擴大繁殖提供種用動物，采用近親交配方式進行繁殖。3.3封閉群closedcolony以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的先天性白內(nèi)障小鼠種群，在不從其外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖5代以上。3.4符合先天性白內(nèi)障小鼠居住的要求，嚴格控制人員、物品和空氣的進出，適用于無特定病原體級實驗動物的環(huán)境。2DB65/T4714—2023實驗動物先天性白內(nèi)障小鼠的生產(chǎn)管理、組織病理學檢查以及遺傳質(zhì)量監(jiān)測的內(nèi)容與操作方法。4基本條件4.1人員、設施、繁殖與生產(chǎn)、使用、福利倫理等應按GB/T34791要求執(zhí)行。4.2飼料的營養(yǎng)成分及衛(wèi)生指標應符合GB14924的要求，墊料和飲水應符合GB14925的要求。4.3環(huán)境設施應符合GB14925的要求。5.1.1引種基本流程宜按照GB/Z34792規(guī)定執(zhí)行。5.1.2應放入規(guī)定的隔離檢疫室或隔離器中，隔離觀察2d后，無異常情況的轉(zhuǎn)入動物實驗室。如有異常的小鼠，應進行必要的微生物學質(zhì)量檢測。5.1.3核心群引種應按照GB14923要求。5.2.1日常飼養(yǎng)應根據(jù)地區(qū)、季節(jié)、設施設備條件的不同制定切實可行的管理操作規(guī)程。5.2.2人員進入動物設施應按照進入該級別動物設施的操作規(guī)程進行。5.2.3工作時留意是否有疾病征兆或死亡小鼠，并及時通知獸醫(yī)進行診斷。5.3核心群及血緣擴大群的保種5.3.1血緣擴大群可采用近親交配、組間循環(huán)的繁殖方法。將種鼠按事先定的配種方案置于繁殖盒中，建立繁殖卡。5.3.2封閉群動物遺傳質(zhì)量監(jiān)測按照GB14923規(guī)定執(zhí)行。5.3.3產(chǎn)仔數(shù)較少的核心群宜采用祖父子三世代五籠保種法，產(chǎn)仔數(shù)較多的核心群宜采用父子二世代五籠保種法。5.3.4血緣擴大群宜采用長期同居法或定期同居法交配繁殖。a)長期同居法：將1只雄鼠與1只雌鼠同居。在雌鼠分娩后幾小時內(nèi)可再行交配受孕；b)定期同居法：將1只雄鼠與6只雌鼠編為一繁殖單元。確保雄鼠籠內(nèi)有2只~3只雌鼠，同時將受孕雌鼠提出，置單籠分娩、哺乳、離乳，6只雌鼠均受孕為一期。5.4生產(chǎn)群的繁殖管理5.4.1選擇2月齡、健康、發(fā)育正常的小鼠為種鼠。5.4.2用于交配的種鼠，應編上個體號碼進行管理；在交配卡上記錄交配日期、個體號碼、胎次數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)、斷奶數(shù)等繁育指標；胎次數(shù)一般控制在5胎~6胎，超過胎次數(shù)或繁育性能不良的種鼠淘汰，補充新的種鼠。5.4.3哺育數(shù)一般為5只~8只，產(chǎn)仔數(shù)多于哺育數(shù)時，可淘汰多余的，也可補充同品系產(chǎn)仔數(shù)少的。5.4.4觀察母鼠和仔鼠各種狀態(tài)，核實淘汰不妊鼠。5.4.5小鼠初生后17d~22d離乳，淘汰畸形、發(fā)育極差、尾卷曲或斷尾的、無鼻毛以及腹瀉等異常DB65/T4714—20233的仔鼠。5.4.6一般從第2胎~4胎中選取生產(chǎn)群繁殖用種用動物，原則上從1窩中選取發(fā)育較好、體格健壯，先天性白內(nèi)障特征明顯的小鼠作為種用動物。選作種用的動物，記錄組、編號、性別、只數(shù)和出生年月5.5微生物、寄生蟲學質(zhì)量控制應按照GB14922中規(guī)定執(zhí)行，監(jiān)測工作應由專業(yè)人員完成。6組織病理學檢查6.1抽樣要求宜選擇4周齡以上先天性白內(nèi)障小鼠用于檢查，隨機抽樣。6.2檢查程序?qū)ο忍煨园變?nèi)障小鼠眼晶狀體進行取樣和檢查，檢查程序見圖1。編號外觀檢查小鼠眼品狀體取樣解剖病理檢查眼品體組織病理檢查結(jié)果判斷圖1檢查程序6.3檢查步驟封閉群先天性白內(nèi)障小鼠組織病理學檢查按照以下步驟進行：a)肉眼對小鼠眼晶狀體進行外觀檢查；b)使用裂隙燈對小鼠眼晶狀體進行檢查；4DB65/T4714—2023c)安樂死，實驗小鼠常規(guī)麻醉后處死；d)白內(nèi)障小鼠眼球大體解剖及取材，摘取白內(nèi)障小鼠眼球投入Davidson液中固定；e)組織病理學檢查；f)組織標本取材；g)病理組織制片，具體方法按附錄A執(zhí)行。常規(guī)石蠟切片，伊紅-蘇木精染色，必要時進行免疫組織化學鑒定；h)閱片及分析，具體方法按附錄B執(zhí)行。由具有病理診斷經(jīng)驗的病理學專業(yè)人員進行。6.4結(jié)果判斷6.4.1外觀檢查結(jié)合裂隙燈，可直接判斷有無晶狀體渾濁。6.4.2組織病理學檢查檢查結(jié)果分為四個等級，按照鏡檢晶狀體無病變、病變達到全晶狀體切面面積的1/5、3/5、整體病變分別判定為未見異常、輕微異常、中度異常和重度異常。6.4.3結(jié)論最后結(jié)論應包含外觀檢查結(jié)果和組織病理學檢查結(jié)果。7遺傳質(zhì)量監(jiān)測7.1遺傳質(zhì)量標準封閉群先天性白內(nèi)障小鼠應符合以下要求：a)具有明確的遺傳背景資料，來源清楚，有完整的資料，包括種群名稱、來源、遺傳基因特點及主要生物學特性等，并能充分表明新培育的或引種的封閉群先天性白內(nèi)障小鼠符合封閉群定義的規(guī)定；b)用于保種及生產(chǎn)的繁殖記錄卡應清楚完整，繁殖方法科學合理；c)經(jīng)遺傳檢測質(zhì)量合格，遺傳檢測抽樣方法及監(jiān)測頻次按照GB14923要求執(zhí)行。7.2遺傳質(zhì)量檢測方法及實施采用RT-PCR基因檢測方法進行。具體方法按附錄C執(zhí)行。按照附錄C.3.1,判斷是否符合先天性白內(nèi)障小鼠遺傳要求。8廢棄物處理開展實驗所產(chǎn)生的污水、廢棄物、小鼠尸體等應按照GB14925的要求進行處理。9記錄與檔案管理59.1應按照國家相關規(guī)定，制定相應的實驗動物檔案管理制度。9.2生產(chǎn)、保種、檢測及質(zhì)量控制等記錄應準確、清晰、完整。9.3各項資料定期進行整理歸檔，根據(jù)需要確定保存年限D(zhuǎn)B65/T4714—20236(規(guī)范性)取材和標本制作A.1光鏡標本制作取正常小鼠和白內(nèi)障小鼠各3只，常規(guī)麻醉后處死，行小鼠雙眼球摘除術，乳酸林格氏液沖洗眼球，將眼球置于眼球固定液中固定一周。A.2光鏡觀察在低倍鏡和高倍鏡下分別觀察晶狀體的前后囊膜和赤道部，同時觀察淺層皮質(zhì)和核心部纖維的排列狀態(tài)，比較兩組之間的形態(tài)學差異。A.3電鏡標本制作和檢查取正常小鼠和白內(nèi)障小鼠各4只，將小鼠常規(guī)麻醉后處死，行小鼠雙眼球摘除術，乳酸林格氏液沖洗眼球，在解剖鏡下從后部剪開鞏膜，完整取出小鼠晶狀體。透射電鏡標本平均切成4塊，掃描電鏡2只為完整晶狀體，另兩只平均切成2塊，立即放入2.5%戊二醛固定液。透射電鏡、掃描電鏡觀察病變情況。DB65/T4714—20237(規(guī)范性)切片病變的定量觀察B.1切片染色常規(guī)HE染色，切片厚度應≤4μm。B.2切片觀察光鏡下首先區(qū)分是否有病變及病變范圍，然后從臟器一端向另一端進行整體觀察和描述。B.3定量觀察將制作好的切片用切片掃描儀進行全片掃描，電腦分析病灶占位比例。B.4定量積分占比1/10的為小灶病變，積一分。依次類推全晶狀體病變?yōu)闈M分10分。DB65/T4714—20238(規(guī)范性)先天性白內(nèi)障小鼠遺傳檢測方法C.1樣本核酸提取C.1.1在樣本處理區(qū)進行。為防止RNA降解，所用試驗用具及溶液應無RNA酶，操作過程中應佩戴一次性橡膠或乳膠手套。C.1.2采集白內(nèi)障小鼠眼球組織，用RNA抽提試劑盒提取白內(nèi)障小鼠眼球組織的總RNA。上游引物：5'-CCGCTCGTACCTAAGTCGCT-3'下游引物：5'-CCTCAGGGAGAACTCTATGGTC-3'C.2.2擴增體系取出相應的RT-PCR試劑、引物探針等，在室溫下融化后，2000g離心5s。按樣品數(shù)量配制反應液，每個反應管包含：10×RT-PCR緩沖液2μL,25mmol/L氯化鎂溶液2μL,2.5mmol/LdNTPs溶液1.5μL,40U/μLRNA酶抑制劑0.5μL,DEPC水6.5μL。充分混合均勻，向每個反應管中各