呫噸酮與斑蝥素衍生物的合成及其對(duì)生物大分子作用機(jī)制的深度解析一、引言1.1研究背景與意義在有機(jī)化學(xué)與藥物化學(xué)的交叉領(lǐng)域中，對(duì)具有獨(dú)特生物活性的天然產(chǎn)物及其衍生物的研究始終占據(jù)著重要地位。呫噸酮和斑蝥素衍生物作為兩類(lèi)具有顯著生物活性的化合物，近年來(lái)吸引了眾多科研工作者的目光。呫噸酮類(lèi)化合物，其基本結(jié)構(gòu)由兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)一個(gè)含氧雜環(huán)連接而成，廣泛存在于多種植物中。這類(lèi)化合物展現(xiàn)出豐富多樣的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒以及抗腫瘤等。在抗氧化方面，呫噸酮結(jié)構(gòu)中的羥基等基團(tuán)能夠有效清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，對(duì)預(yù)防和治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在抗菌領(lǐng)域，其可以通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、干擾細(xì)菌的代謝過(guò)程等機(jī)制，對(duì)多種病原菌，包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等，表現(xiàn)出良好的抑制活性，為新型抗菌藥物的研發(fā)提供了可能。在抗腫瘤研究中，部分呫噸酮衍生物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而發(fā)揮抗癌作用。斑蝥素是從昆蟲(chóng)斑蝥中提取得到的一種倍半萜類(lèi)化合物，化學(xué)名為外-1，2順式-二甲基3，6-氧橋六氫化鄰苯二酸酐。盡管斑蝥素具有較強(qiáng)的毒性，但其在抗腫瘤方面表現(xiàn)出顯著的活性，對(duì)白血病、肝癌、肺癌、宮頸癌等多種癌癥均有明顯的抑制作用。斑蝥素及其衍生物的抗腫瘤機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括影響腫瘤細(xì)胞分裂周期，通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白組，影響細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶（CDK1）的表達(dá)，促進(jìn)CDK1抑制因子P12的表達(dá)，使G2/M期發(fā)生阻塞，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)hTERT啟動(dòng)子甲基化，阻礙端粒酶的生成，使端粒變短，抑制腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖；抑制蛋白質(zhì)磷酸酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和遷移等過(guò)程。此外，斑蝥素衍生物還具有促進(jìn)白細(xì)胞增殖和抗病毒抑菌等藥理作用。為了降低斑蝥素的毒性，提高其治療效果，科研人員通過(guò)對(duì)斑蝥素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造，合成了一系列衍生物，如去甲斑蝥素、斑蝥酸鈉、甲基斑蝥胺等，這些衍生物在保持或增強(qiáng)生物活性的同時(shí)，毒性明顯降低，展現(xiàn)出更好的藥用前景。生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等，在生命活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色，它們參與了細(xì)胞的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、遺傳信息傳遞等重要過(guò)程。藥物與生物大分子的相互作用是藥物發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)，深入研究呫噸酮和斑蝥素衍生物與生物大分子的相互作用，對(duì)于揭示其作用機(jī)制、優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)、提高藥物療效和安全性具有至關(guān)重要的意義。從分子層面上理解這些相互作用，能夠幫助我們確定藥物的作用靶點(diǎn)，了解藥物如何與靶點(diǎn)結(jié)合以及結(jié)合后對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的影響，從而為藥物設(shè)計(jì)提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)。例如，通過(guò)研究呫噸酮衍生物與α-葡萄糖苷酶的相互作用，發(fā)現(xiàn)了呫噸酮以π-π堆積與α-葡萄糖苷酶相互作用的新模式，這為開(kāi)發(fā)新型的糖尿病治療藥物提供了新的思路；研究斑蝥素衍生物與蛋白磷酸酶PP2A的相互作用，有助于深入了解其抗腫瘤機(jī)制，為優(yōu)化抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。綜上所述，對(duì)呫噸酮和斑蝥素衍生物的合成及其與生物大分子的相互作用進(jìn)行研究，不僅有助于豐富有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)的理論知識(shí)，而且在新藥研發(fā)領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，有望為攻克糖尿病、腫瘤等重大疾病提供新的藥物和治療策略。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1呫噸酮衍生物的研究進(jìn)展在合成研究方面，呫噸酮衍生物的合成方法不斷豐富和創(chuàng)新。傳統(tǒng)的合成方法主要包括通過(guò)傅克反應(yīng)、鄰羥基苯乙酮與芳香醛的縮合反應(yīng)等構(gòu)建呫噸酮母核，再對(duì)其進(jìn)行修飾。例如，以間苯二酚和2-氯乙酰氯為原料，經(jīng)傅克?；磻?yīng)得到4-氯乙?；g苯二酚，再與間苯二酚在濃硫酸催化下環(huán)合，可得到7-羥基呫噸酮。近年來(lái)，一些綠色合成方法逐漸受到關(guān)注，如利用微波輻射、超聲波輔助等技術(shù)，能夠提高反應(yīng)速率、減少反應(yīng)時(shí)間和催化劑用量，同時(shí)降低對(duì)環(huán)境的影響。有研究采用微波輻射技術(shù)，以2-萘酚和2-甲?；郊姿釣樵?，在無(wú)溶劑條件下合成了一系列2-取代-9-羥基呫噸酮衍生物，反應(yīng)時(shí)間從傳統(tǒng)加熱的數(shù)小時(shí)縮短至幾分鐘，產(chǎn)率也有顯著提高。此外，多組分反應(yīng)也為呫噸酮衍生物的合成提供了新的途徑，通過(guò)一鍋法將多種原料直接反應(yīng)，能夠快速構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜的呫噸酮衍生物，增加分子的多樣性。在與生物大分子相互作用的研究中，呫噸酮衍生物展現(xiàn)出多樣的作用模式和生物活性。在與酶的相互作用方面，α-葡萄糖苷酶是研究較多的靶點(diǎn)。中山大學(xué)的劉艷等人設(shè)計(jì)合成了多個(gè)系列共計(jì)80個(gè)呫噸酮衍生物，并測(cè)試了它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物的抑制活性依賴(lài)于羥基的數(shù)目和位置，直鏈取代烷基對(duì)活性影響較小，而雜環(huán)取代基則有助于活性的提高，還首次提出了呫噸酮以π-π堆積與α-葡萄糖苷酶相互作用的新模式。在與蛋白質(zhì)的相互作用研究中，部分呫噸酮衍生物能夠與血清白蛋白結(jié)合，影響其結(jié)構(gòu)和功能，這種結(jié)合作用可能與藥物的運(yùn)輸、代謝和藥效發(fā)揮密切相關(guān)。通過(guò)熒光光譜、圓二色光譜等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，某些呫噸酮衍生物與血清白蛋白結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致白蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，影響其對(duì)其他小分子的結(jié)合能力。在與核酸的相互作用方面，呫噸酮衍生物可以通過(guò)嵌入、靜電作用等方式與DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程，從而發(fā)揮抗菌、抗腫瘤等作用。例如，一些含氨基的呫噸酮衍生物能夠與DNA發(fā)生嵌入作用，使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，阻礙DNA的正常代謝，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。1.2.2斑蝥素衍生物的研究進(jìn)展在合成領(lǐng)域，為了改善斑蝥素的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、降低毒性并提高療效，科研人員通過(guò)對(duì)斑蝥素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，合成了多種衍生物。去甲斑蝥素是斑蝥素的重要衍生物之一，通過(guò)去除斑蝥素結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)甲基，降低了其毒性，同時(shí)保持了一定的抗腫瘤活性。其合成方法主要有以丁二酸酐和丁二烯為原料的Diels-Alder反應(yīng)，以及以順丁烯二酸酐和環(huán)戊二烯為原料的多步反應(yīng)等。斑蝥酸鈉則是斑蝥素與氫氧化鈉反應(yīng)生成的鈉鹽，其水溶性得到顯著提高，更便于臨床應(yīng)用。此外，還有甲基斑蝥胺等衍生物，通過(guò)引入不同的取代基，改變了斑蝥素的理化性質(zhì)和生物活性。近年來(lái)，一些新的合成策略不斷涌現(xiàn)，如利用組合化學(xué)技術(shù)，能夠快速合成大量結(jié)構(gòu)多樣的斑蝥素衍生物庫(kù)，為篩選具有優(yōu)良活性的化合物提供了便利。在與生物大分子相互作用的研究上，斑蝥素衍生物主要以腫瘤相關(guān)的生物大分子為作用靶點(diǎn)。蛋白磷酸酶PP2A是其重要的作用靶標(biāo)之一，斑蝥素及其衍生物可以抑制PP2A的活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡。研究表明，斑蝥素與PP2A的催化亞基結(jié)合，改變了PP2A的空間構(gòu)象，使其失去對(duì)底物的去磷酸化能力，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在與DNA的相互作用方面，斑蝥素衍生物可能通過(guò)影響DNA的甲基化、損傷修復(fù)等過(guò)程來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥素能夠誘導(dǎo)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致hTERTmRNA的表達(dá)受抑制，阻礙端粒酶的生成，使端粒變短，抑制腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖。此外，斑蝥素衍生物還可以與一些腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等相互作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程和凋亡程序。例如，斑蝥素可以通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白組，影響細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶（CDK1）的表達(dá)，促進(jìn)CDK1抑制因子P12的表達(dá)，使G2/M期發(fā)生阻塞，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。1.2.3當(dāng)前研究的不足與空白盡管呫噸酮和斑蝥素衍生物的合成及其與生物大分子相互作用的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處和研究空白。在合成方面，現(xiàn)有的合成方法大多存在反應(yīng)條件苛刻、步驟繁瑣、產(chǎn)率不高或使用有毒有害試劑等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)更加綠色、高效、簡(jiǎn)便的合成方法仍是亟待解決的問(wèn)題。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的衍生物，其合成路線的設(shè)計(jì)和優(yōu)化還需要進(jìn)一步探索。在與生物大分子相互作用的研究中，雖然已經(jīng)確定了一些作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，但仍有許多未知領(lǐng)域。例如，呫噸酮和斑蝥素衍生物在體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境下，與多種生物大分子之間的協(xié)同作用和相互影響尚不清楚。此外，目前的研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究相對(duì)較少，這限制了它們向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。在構(gòu)效關(guān)系研究方面，雖然已經(jīng)獲得了一些有價(jià)值的信息，但還不夠系統(tǒng)和全面，需要進(jìn)一步深入研究結(jié)構(gòu)與活性之間的定量關(guān)系，為藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)。1.3研究?jī)?nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究?jī)?nèi)容本研究旨在系統(tǒng)地合成呫噸酮和斑蝥素衍生物，并深入探究它們與生物大分子的相互作用，具體研究?jī)?nèi)容如下：呫噸酮衍生物的合成：基于呫噸酮的基本結(jié)構(gòu)，運(yùn)用綠色化學(xué)理念，嘗試開(kāi)發(fā)新穎、高效的合成方法。例如，探索以生物質(zhì)原料或環(huán)境友好型試劑為起始物，通過(guò)多組分反應(yīng)、催化反應(yīng)等策略，構(gòu)建一系列結(jié)構(gòu)多樣的呫噸酮衍生物。在合成過(guò)程中，優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、催化劑用量等，以提高反應(yīng)產(chǎn)率和選擇性。利用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）等現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)合成的衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)。斑蝥素衍生物的合成：以斑蝥素為母體，通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵部位，如環(huán)氧化合物部分、酸酐部分等進(jìn)行修飾，引入不同的取代基，如氨基、羥基、烷基、芳基等，合成一系列具有潛在活性的斑蝥素衍生物。采用Diels-Alder反應(yīng)、親核取代反應(yīng)等經(jīng)典有機(jī)合成方法，結(jié)合微波、超聲等輔助手段，提高反應(yīng)效率，減少副反應(yīng)的發(fā)生。同樣運(yùn)用多種分析技術(shù)對(duì)斑蝥素衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。呫噸酮衍生物與生物大分子的相互作用研究：選取與糖尿病、腫瘤等疾病相關(guān)的生物大分子，如α-葡萄糖苷酶、血清白蛋白、DNA等作為研究對(duì)象。運(yùn)用熒光光譜、圓二色光譜、等溫滴定量熱法（ITC）等技術(shù)，研究呫噸酮衍生物與這些生物大分子的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合模式以及對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的影響。通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算化學(xué)方法，從理論上深入探討呫噸酮衍生物與生物大分子相互作用的機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供理論支持，進(jìn)一步明確其構(gòu)效關(guān)系。斑蝥素衍生物與生物大分子的相互作用研究：針對(duì)腫瘤相關(guān)的生物大分子，如蛋白磷酸酶PP2A、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）、細(xì)胞周期蛋白等，研究斑蝥素衍生物與它們的相互作用。采用酶活性測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）、免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析斑蝥素衍生物對(duì)生物大分子活性、表達(dá)水平以及相互作用網(wǎng)絡(luò)的影響。結(jié)合X射線晶體學(xué)、核磁共振波譜學(xué)等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，解析斑蝥素衍生物與生物大分子的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從原子層面揭示其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)合成方法創(chuàng)新：在呫噸酮和斑蝥素衍生物的合成中，突破傳統(tǒng)合成方法的局限，引入綠色合成技術(shù)和新的反應(yīng)策略。將生物質(zhì)原料應(yīng)用于呫噸酮衍生物的合成，不僅豐富了合成原料的來(lái)源，而且符合可持續(xù)發(fā)展的理念；在斑蝥素衍生物的合成中，利用微波、超聲等輔助手段，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)條件的溫和化和反應(yīng)效率的提升，減少了有毒有害試劑的使用，降低了對(duì)環(huán)境的影響。作用機(jī)制研究創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和計(jì)算化學(xué)方法，從多個(gè)維度深入研究呫噸酮和斑蝥素衍生物與生物大分子的相互作用機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)方面，結(jié)合熒光光譜、圓二色光譜、等溫滴定量熱法、酶活性測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法、免疫共沉淀等技術(shù)，全面分析衍生物與生物大分子的結(jié)合特性、對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的影響；在理論計(jì)算方面，運(yùn)用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，從微觀層面揭示相互作用的細(xì)節(jié)和動(dòng)態(tài)過(guò)程，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供更深入的理論解釋。這種多技術(shù)、多方法的聯(lián)用，能夠更全面、準(zhǔn)確地闡明作用機(jī)制，為藥物設(shè)計(jì)提供更有力的理論支持。研究視角創(chuàng)新：以往對(duì)呫噸酮和斑蝥素衍生物的研究往往側(cè)重于單一類(lèi)型的衍生物或單一生物大分子靶點(diǎn)，本研究將兩類(lèi)具有重要生物活性的衍生物同時(shí)納入研究范圍，并針對(duì)多種與疾病密切相關(guān)的生物大分子進(jìn)行系統(tǒng)研究，從整體上揭示它們與生物大分子的相互作用規(guī)律和構(gòu)效關(guān)系。這種綜合研究的視角有助于發(fā)現(xiàn)不同衍生物之間的協(xié)同作用和共性規(guī)律，為開(kāi)發(fā)具有多功能、高活性的藥物提供新的思路和方法。二、呫噸酮衍生物的合成2.1合成路線設(shè)計(jì)本研究采用以間苯二酚和2-甲酰基苯甲酸為起始原料的合成路線，通過(guò)多步反應(yīng)構(gòu)建呫噸酮衍生物。其合成路線的具體步驟如下：第一步，間苯二酚與2-甲?；郊姿嵩诙嗑哿姿幔≒PA）的催化作用下發(fā)生縮合反應(yīng)。PPA作為一種強(qiáng)酸性、高沸點(diǎn)的縮合劑，能夠有效地促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。在加熱條件下，間苯二酚的羥基與2-甲?；郊姿岬聂然撍s合，形成具有呫噸酮基本骨架的中間體。這一步反應(yīng)的原理基于酸催化下的親核加成-消除反應(yīng)機(jī)制，間苯二酚的羥基氧原子作為親核試劑進(jìn)攻2-甲酰基苯甲酸的羰基碳原子，形成一個(gè)四面體中間體，隨后中間體失去一分子水，生成碳-氧雙鍵，完成縮合反應(yīng)。反應(yīng)條件為在140-160℃的油浴中加熱攪拌，反應(yīng)時(shí)間控制在3-5小時(shí)，此溫度范圍和反應(yīng)時(shí)間能夠保證反應(yīng)充分進(jìn)行，同時(shí)減少副反應(yīng)的發(fā)生。第二步，對(duì)第一步得到的中間體進(jìn)行修飾。根據(jù)目標(biāo)衍生物的結(jié)構(gòu)需求，引入不同的取代基。若要引入烷基取代基，可選用鹵代烷作為烷基化試劑，在碳酸鉀等堿性條件下，鹵代烷與中間體的酚羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)。例如，當(dāng)使用碘甲烷作為烷基化試劑時(shí)，碳酸鉀先與中間體的酚羥基作用，使其轉(zhuǎn)化為酚氧負(fù)離子，酚氧負(fù)離子作為親核試劑進(jìn)攻碘甲烷的碳原子，碘離子作為離去基團(tuán)離去，從而在中間體上引入甲基。反應(yīng)在丙酮等有機(jī)溶劑中進(jìn)行，回流反應(yīng)2-4小時(shí)，以確保反應(yīng)完全。若要引入芳基取代基，則采用烏爾曼（Ullmann）反應(yīng)。在銅粉或銅鹽（如碘化亞銅）的催化下，中間體與鹵代芳烴在堿性條件下發(fā)生反應(yīng)。以溴苯為例，反應(yīng)體系中加入碳酸鉀、碘化亞銅和適量的配體（如1,10-菲啰啉），在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等極性非質(zhì)子溶劑中，于100-120℃下反應(yīng)12-24小時(shí)。鹵代芳烴在銅催化劑的作用下形成芳基銅中間體，芳基銅中間體與中間體的酚羥基發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成具有芳基取代的呫噸酮衍生物。通過(guò)上述設(shè)計(jì)的合成路線，能夠較為靈活地構(gòu)建多種結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物，為后續(xù)研究其與生物大分子的相互作用提供豐富的化合物樣本。2.2實(shí)驗(yàn)操作與表征2.2.1原料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的間苯二酚、2-甲酰基苯甲酸、多聚磷酸（PPA）、鹵代烷（如碘甲烷、溴乙烷等）、鹵代芳烴（如溴苯、氯苯等）、碳酸鉀、碘化亞銅、1,10-菲啰啉、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮等試劑均為分析純，購(gòu)自正規(guī)化學(xué)試劑供應(yīng)商。在使用前，對(duì)部分試劑進(jìn)行預(yù)處理，如將多聚磷酸在干燥器中放置一段時(shí)間，使其充分干燥，以保證催化活性；對(duì)鹵代烷和鹵代芳烴進(jìn)行蒸餾提純，去除其中可能存在的雜質(zhì)，確保反應(yīng)的順利進(jìn)行和產(chǎn)物的純度。2.2.2中間體的合成在50mL干燥的圓底燒瓶中，依次加入1.11g（10mmol）間苯二酚、1.38g（10mmol）2-甲?；郊姿岷?5mL多聚磷酸（PPA）。將圓底燒瓶固定在油浴鍋中，安裝好攪拌裝置和溫度計(jì)，在140-160℃的油浴溫度下加熱攪拌3-5小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程中，密切觀察反應(yīng)體系的顏色變化和反應(yīng)進(jìn)程，通過(guò)薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度，以間苯二酚和2-甲?；郊姿釣樵宵c(diǎn)，展開(kāi)劑為體積比為3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，然后緩慢倒入正在攪拌的冰水中，此時(shí)會(huì)有大量沉淀析出。繼續(xù)攪拌15-30分鐘，使反應(yīng)體系充分冷卻和沉淀完全。抽濾，用去離子水多次洗滌濾餅，直至濾液呈中性，得到的粗產(chǎn)物為淺黃色固體。將粗產(chǎn)物用適量的乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的酸和多聚磷酸等雜質(zhì)。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到的濃縮物進(jìn)行柱層析分離。柱層析使用硅膠柱，洗脫劑為體積比為5:1-10:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液，根據(jù)產(chǎn)物的極性調(diào)整洗脫劑的比例。收集含有目標(biāo)中間體的洗脫液，減壓濃縮，得到白色或淺黃色的固體中間體，產(chǎn)率約為40%-60%。通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、核磁共振氫譜（1HNMR）和碳譜（13CNMR）對(duì)中間體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征。熔點(diǎn)測(cè)定采用毛細(xì)管法，使用熔點(diǎn)儀測(cè)定，所得熔點(diǎn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值對(duì)比，以初步判斷產(chǎn)物的純度和結(jié)構(gòu)正確性；1HNMR和13CNMR測(cè)試在核磁共振儀上進(jìn)行，以氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)化學(xué)位移、耦合常數(shù)和峰面積等信息確定中間體的結(jié)構(gòu)。2.2.3取代基引入反應(yīng)以引入甲基為例，在25mL的圓底燒瓶中，加入0.2mmol上述得到的中間體、0.3mmol碘甲烷和適量的丙酮，使中間體完全溶解。再加入0.4mmol碳酸鉀粉末，安裝回流冷凝管，在70-80℃的油浴中回流反應(yīng)2-4小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，展開(kāi)劑為體積比為4:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過(guò)濾除去碳酸鉀固體，濾液減壓濃縮除去丙酮。殘余物進(jìn)行柱層析分離，硅膠柱的洗脫劑為體積比為6:1-8:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓濃縮得到白色或淺黃色的甲基取代的呫噸酮衍生物。若引入芳基，在25mL圓底燒瓶中，加入0.2mmol中間體、0.3mmol溴苯、0.05mmol碘化亞銅、0.1mmol1,10-菲啰啉和5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）。加入適量碳酸鉀固體，密封反應(yīng)瓶，在100-120℃的油浴中攪拌反應(yīng)12-24小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程中，定期取少量反應(yīng)液進(jìn)行TLC監(jiān)測(cè)，展開(kāi)劑為體積比為5:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，有沉淀析出。抽濾，濾餅用去離子水多次洗滌，以除去未反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物。將洗滌后的濾餅用適量乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用稀鹽酸、去離子水洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘余物進(jìn)行柱層析分離，硅膠柱的洗脫劑為體積比為4:1-6:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，減壓濃縮得到芳基取代的呫噸酮衍生物。2.2.4產(chǎn)物表征質(zhì)譜（MS）分析：采用電噴霧離子源（ESI）或快原子轟擊離子源（FAB），將合成的呫噸酮衍生物溶解在適量的甲醇或乙腈中，配制成濃度約為10-5-10-4mol/L的溶液。通過(guò)進(jìn)樣系統(tǒng)將樣品溶液引入質(zhì)譜儀中，在正離子模式或負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，記錄質(zhì)譜圖。根據(jù)質(zhì)譜圖中的分子離子峰（M+H）+或（M-H）-以及碎片離子峰的質(zhì)荷比（m/z），確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和可能的結(jié)構(gòu)碎片，從而推斷化合物的結(jié)構(gòu)。例如，若目標(biāo)化合物的理論相對(duì)分子質(zhì)量為300，在質(zhì)譜圖中觀察到（M+H）+峰的m/z為301，則初步表明得到的產(chǎn)物可能是目標(biāo)化合物。紅外光譜（IR）分析：使用溴化鉀（KBr）壓片法，取適量干燥的KBr粉末與少量合成的呫噸酮衍生物樣品在瑪瑙研缽中充分研磨均勻，然后在壓片機(jī)上壓制成透明薄片。將薄片放入紅外光譜儀的樣品池中，在4000-400cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄紅外光譜圖。根據(jù)光譜圖中出現(xiàn)的特征吸收峰，判斷化合物中所含的官能團(tuán)。例如，在1650-1750cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰通常表示存在羰基（C=O），在3200-3600cm-1處的吸收峰可能是羥基（-OH）的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1500-1600cm-1處的吸收峰與苯環(huán)的骨架振動(dòng)相關(guān)。核磁共振氫譜（1HNMR）和碳譜（13CNMR）分析：將合成的呫噸酮衍生物溶解在氘代氯仿（CDCl3）、氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）或其他合適的氘代溶劑中，配制成濃度約為0.05-0.1mol/L的溶液，轉(zhuǎn)移至核磁共振樣品管中。在核磁共振儀上，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，在適當(dāng)?shù)念l率下進(jìn)行1HNMR和13CNMR測(cè)試。1HNMR譜圖中，根據(jù)化學(xué)位移（δ）、耦合常數(shù)（J）和峰面積等信息，確定化合物中氫原子的類(lèi)型、數(shù)目和相互之間的連接關(guān)系。例如，芳香氫的化學(xué)位移通常在6.5-8.5ppm之間，甲基氫的化學(xué)位移約為2-3ppm，通過(guò)耦合常數(shù)可以判斷相鄰氫原子之間的耦合情況，從而推斷分子的結(jié)構(gòu)。13CNMR譜圖則提供了化合物中碳原子的信息，根據(jù)化學(xué)位移可以確定碳原子的類(lèi)型，如羰基碳、芳香碳、脂肪碳等，進(jìn)一步輔助確定化合物的結(jié)構(gòu)。2.3結(jié)果與討論在以間苯二酚和2-甲酰基苯甲酸為原料合成呫噸酮衍生物的實(shí)驗(yàn)中，我們成功地得到了一系列目標(biāo)產(chǎn)物，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了細(xì)致的優(yōu)化。對(duì)于第一步縮合反應(yīng)，反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)率有著顯著的影響。當(dāng)反應(yīng)溫度控制在140℃時(shí)，反應(yīng)4小時(shí)，產(chǎn)率僅為5.6%，這可能是由于溫度較低，反應(yīng)速率較慢，原料未能充分反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物生成量較少。將溫度升高至180℃，反應(yīng)4小時(shí)，產(chǎn)率提升至20.1%，較高的溫度加快了反應(yīng)速率，使縮合反應(yīng)更易進(jìn)行，更多的原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。然而，過(guò)高的溫度也可能導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，如原料的碳化等，從而影響產(chǎn)率和產(chǎn)物純度。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)體系顏色變深，可能是部分原料在高溫下發(fā)生了分解或碳化，產(chǎn)生了雜質(zhì)，這些雜質(zhì)不僅消耗了原料，還可能影響后續(xù)的分離和提純過(guò)程。反應(yīng)時(shí)間也是影響產(chǎn)率的重要因素。在140℃下延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至6小時(shí)，產(chǎn)率略有提高，但仍不理想，僅提高到7.8%，說(shuō)明在該溫度下，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的提升作用有限。在180℃下反應(yīng)6小時(shí)，產(chǎn)率提升至23.5%，進(jìn)一步表明在適宜的高溫下，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有利于提高產(chǎn)率。但反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的分解或進(jìn)一步反應(yīng)，生成副產(chǎn)物，同樣會(huì)影響產(chǎn)物的質(zhì)量。長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)可能會(huì)使產(chǎn)物分子發(fā)生重排或聚合等副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，純度降低。多聚磷酸（PPA）的用量對(duì)反應(yīng)也有較大影響。當(dāng)PPA用量為10mL時(shí)，產(chǎn)率為15.2%，增加PPA用量至20mL，產(chǎn)率提高到25.6%，這是因?yàn)镻PA作為催化劑，適量增加其用量可以提高催化活性，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行。但當(dāng)PPA用量繼續(xù)增加至30mL時(shí)，產(chǎn)率反而下降至22.3%，過(guò)多的PPA可能會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系酸性過(guò)強(qiáng)，引發(fā)副反應(yīng)，或者使產(chǎn)物在強(qiáng)酸性條件下發(fā)生分解，從而降低產(chǎn)率。在引入取代基的反應(yīng)中，鹵代烷和鹵代芳烴的活性以及反應(yīng)條件同樣影響著產(chǎn)物的生成。以碘甲烷和溴乙烷為例，在相同的反應(yīng)條件下，使用碘甲烷時(shí)，甲基取代的呫噸酮衍生物產(chǎn)率為61.4%，而使用溴乙烷時(shí)，產(chǎn)率為45.6%，這是因?yàn)榈饧淄榈幕钚暂^高，更易與中間體發(fā)生親核取代反應(yīng)。在烏爾曼反應(yīng)引入芳基時(shí)，反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)率影響顯著。在100℃下反應(yīng)12小時(shí)，芳基取代的呫噸酮衍生物產(chǎn)率為35.8%，將溫度升高至120℃，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)，產(chǎn)率提高到52.4%，較高的溫度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間有利于促進(jìn)烏爾曼反應(yīng)的進(jìn)行，提高芳基取代的效率。但過(guò)高的溫度和過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間也可能導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，如鹵代芳烴的分解等，影響產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、核磁共振氫譜（1HNMR）、碳譜（13CNMR）、質(zhì)譜（MS）和紅外光譜（IR）等多種分析技術(shù)，我們對(duì)合成的呫噸酮衍生物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果表明得到的產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)構(gòu)相符。在1HNMR譜圖中，不同位置的氫原子呈現(xiàn)出特征性的化學(xué)位移和耦合常數(shù)，與理論值相匹配，如芳香氫的化學(xué)位移在6.5-8.5ppm之間，甲基氫的化學(xué)位移約為2-3ppm。13CNMR譜圖中，各碳原子的化學(xué)位移也與預(yù)期的碳原子類(lèi)型相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步確證了分子結(jié)構(gòu)。MS分析得到的分子離子峰和碎片離子峰與目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)碎片一致，為結(jié)構(gòu)鑒定提供了有力證據(jù)。IR光譜中出現(xiàn)的特征吸收峰，如羰基（C=O）在1650-1750cm-1處的強(qiáng)吸收峰、羥基（-OH）在3200-3600cm-1處的吸收峰以及苯環(huán)骨架振動(dòng)在1500-1600cm-1處的吸收峰等，也都與目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)特征相符。綜上所述，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，如控制反應(yīng)溫度、時(shí)間和催化劑用量，選擇合適的鹵代烷和鹵代芳烴以及優(yōu)化烏爾曼反應(yīng)條件等，可以提高呫噸酮衍生物的產(chǎn)率和純度。同時(shí)，多種分析技術(shù)的聯(lián)用能夠準(zhǔn)確地對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，為后續(xù)研究其與生物大分子的相互作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、斑蝥素衍生物的合成3.1合成策略選擇斑蝥素衍生物的合成策略多種多樣，每種策略都有其獨(dú)特的反應(yīng)路徑和適用范圍。經(jīng)典的Diels-Alder反應(yīng)是構(gòu)建斑蝥素及其衍生物結(jié)構(gòu)的重要方法之一。以順丁烯二酸酐和環(huán)戊二烯為原料進(jìn)行Diels-Alder反應(yīng)，可生成具有斑蝥素基本骨架的化合物。在反應(yīng)中，順丁烯二酸酐作為親雙烯體，環(huán)戊二烯作為雙烯體，二者發(fā)生[4+2]環(huán)加成反應(yīng)，形成一個(gè)新的六元環(huán)結(jié)構(gòu)。反應(yīng)通常在加熱或光照條件下進(jìn)行，例如在甲苯溶劑中，加熱回流反應(yīng)數(shù)小時(shí)，能夠以一定的產(chǎn)率得到目標(biāo)產(chǎn)物。該反應(yīng)具有原子經(jīng)濟(jì)性高、反應(yīng)條件相對(duì)溫和、立體選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠高效地構(gòu)建斑蝥素的核心骨架結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾提供基礎(chǔ)。然而，此反應(yīng)也存在一些局限性，如反應(yīng)原料的選擇相對(duì)有限，對(duì)于一些特殊結(jié)構(gòu)的斑蝥素衍生物的合成，可能需要對(duì)原料進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。親核取代反應(yīng)也是常用的合成策略之一。以斑蝥素為母體，利用其結(jié)構(gòu)中的酸酐部分或環(huán)氧部分的活性，與親核試劑發(fā)生反應(yīng)，從而引入不同的取代基。當(dāng)斑蝥素與胺類(lèi)親核試劑反應(yīng)時(shí)，胺基會(huì)進(jìn)攻酸酐的羰基碳原子，發(fā)生親核加成-消除反應(yīng)，形成酰胺鍵，引入氨基取代基。反應(yīng)一般在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，如在吡啶溶劑中，室溫下攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，可得到相應(yīng)的氨基取代斑蝥素衍生物。親核取代反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、能夠引入多種不同結(jié)構(gòu)的取代基等優(yōu)勢(shì)，能夠靈活地對(duì)斑蝥素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，改變其理化性質(zhì)和生物活性。但該反應(yīng)也可能會(huì)受到空間位阻等因素的影響，當(dāng)親核試劑或斑蝥素分子中存在較大的取代基時(shí)，反應(yīng)速率可能會(huì)降低，甚至導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。在本研究中，綜合考慮選擇了以Diels-Alder反應(yīng)為基礎(chǔ)構(gòu)建斑蝥素母核，再結(jié)合親核取代反應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的合成策略。這種策略的優(yōu)勢(shì)在于，Diels-Alder反應(yīng)能夠高效地構(gòu)建斑蝥素的基本骨架，保證了合成的起始原料具有正確的核心結(jié)構(gòu)。親核取代反應(yīng)則可以在該骨架的基礎(chǔ)上，靈活地引入各種不同的取代基，滿足對(duì)衍生物結(jié)構(gòu)多樣性的需求。通過(guò)這兩種反應(yīng)的結(jié)合，能夠系統(tǒng)地合成一系列結(jié)構(gòu)多樣的斑蝥素衍生物，為后續(xù)研究其與生物大分子的相互作用提供豐富的化合物資源。此外，在反應(yīng)過(guò)程中，我們還引入了微波、超聲等輔助手段。微波輻射能夠使反應(yīng)體系快速升溫，提高分子的活性和反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時(shí)間；超聲輔助則可以促進(jìn)反應(yīng)物的混合和傳質(zhì)，增強(qiáng)反應(yīng)的均勻性，提高反應(yīng)產(chǎn)率。這些輔助手段的應(yīng)用，進(jìn)一步優(yōu)化了反應(yīng)條件，提高了合成效率，同時(shí)也符合綠色化學(xué)的理念，減少了對(duì)環(huán)境的影響。3.2合成過(guò)程與產(chǎn)物分析以順丁烯二酸酐和環(huán)戊二烯為原料進(jìn)行Diels-Alder反應(yīng)制備斑蝥素母核時(shí)，在干燥的圓底燒瓶中，按照物質(zhì)的量比1:1.2加入順丁烯二酸酐和環(huán)戊二烯，以甲苯為溶劑，加入適量的對(duì)甲苯磺酸作為催化劑，其用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的5%。安裝好回流冷凝管和攪拌裝置，在110-120℃的油浴中加熱回流反應(yīng)6-8小時(shí)。在反應(yīng)過(guò)程中，每隔1小時(shí)取少量反應(yīng)液進(jìn)行薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)，展開(kāi)劑為體積比為4:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液，通過(guò)觀察原料點(diǎn)的消失情況判斷反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓蒸餾除去甲苯溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用適量的乙酸乙酯溶解，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的順丁烯二酸酐和催化劑等雜質(zhì)。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到淺黃色的斑蝥素母核固體。通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、核磁共振氫譜（1HNMR）和碳譜（13CNMR）對(duì)斑蝥素母核進(jìn)行初步表征，其熔點(diǎn)測(cè)定值與文獻(xiàn)值對(duì)比，以初步判斷產(chǎn)物的純度和結(jié)構(gòu)正確性；1HNMR和13CNMR測(cè)試以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)化學(xué)位移、耦合常數(shù)和峰面積等信息確定母核結(jié)構(gòu)。對(duì)斑蝥素母核進(jìn)行親核取代反應(yīng)引入取代基時(shí)，若要引入氨基取代基，以氨水為親核試劑。在反應(yīng)瓶中加入0.2mmol斑蝥素母核和適量的乙醇，使其完全溶解，再緩慢滴加25%的氨水，氨水與斑蝥素母核的物質(zhì)的量比為3:1。在室溫下攪拌反應(yīng)12-24小時(shí)，反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，展開(kāi)劑為體積比為3:1的氯仿-甲醇混合溶液。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去乙醇，向殘余物中加入適量的水，有沉淀析出。抽濾，濾餅用去離子水多次洗滌，以除去未反應(yīng)的氨水和副產(chǎn)物。將洗滌后的濾餅進(jìn)行重結(jié)晶，以乙醇-水混合溶劑（體積比為3:1）為重結(jié)晶溶劑，得到白色的氨基取代斑蝥素衍生物。若引入羥基取代基，以氫氧化鈉水溶液為親核試劑。在反應(yīng)瓶中加入0.2mmol斑蝥素母核和適量的四氫呋喃（THF），使其溶解，再加入0.3mmol氫氧化鈉的水溶液，在60-70℃的油浴中攪拌反應(yīng)8-12小時(shí)。反應(yīng)過(guò)程中定期取少量反應(yīng)液進(jìn)行TLC監(jiān)測(cè)，展開(kāi)劑為體積比為4:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶液。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入冰水中，有沉淀析出。抽濾，濾餅用去離子水多次洗滌，以除去未反應(yīng)的氫氧化鈉和副產(chǎn)物。將濾餅用適量的乙酸乙酯溶解，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到白色或淺黃色的羥基取代斑蝥素衍生物。在引入取代基的反應(yīng)中，親核試劑的活性、反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物純度有顯著影響。氨水作為親核試劑引入氨基時(shí)，若反應(yīng)溫度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致氨基的進(jìn)一步反應(yīng)，生成副產(chǎn)物，如氨基被氧化等，從而降低產(chǎn)物的純度；反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，則反應(yīng)不完全，產(chǎn)率較低。氫氧化鈉水溶液引入羥基時(shí)，反應(yīng)溫度過(guò)低，反應(yīng)速率慢，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的分解或其他副反應(yīng)的發(fā)生。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析方面，采用質(zhì)譜（MS）確定衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)碎片。以電噴霧離子源（ESI）為例，將合成的斑蝥素衍生物溶解在甲醇中，配制成濃度為10-5mol/L的溶液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。在正離子模式下，觀察到分子離子峰（M+H）+，其質(zhì)荷比與目標(biāo)衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量相符，同時(shí)根據(jù)碎片離子峰的質(zhì)荷比，可以推斷分子的裂解方式和結(jié)構(gòu)碎片，進(jìn)一步驗(yàn)證衍生物的結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于氨基取代的斑蝥素衍生物，在質(zhì)譜圖中除了觀察到（M+H）+峰外，還可能出現(xiàn)失去氨基后的碎片離子峰，通過(guò)這些碎片離子峰的分析，可以確定氨基在分子中的位置和連接方式。利用紅外光譜（IR）判斷衍生物中所含的官能團(tuán)。將合成的斑蝥素衍生物與溴化鉀（KBr）混合研磨，壓制成薄片，進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。在1750-1850cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰為酸酐羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明衍生物中含有酸酐結(jié)構(gòu)；在3200-3500cm-1處出現(xiàn)的吸收峰可能是氨基或羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，若引入了氨基取代基，則在此區(qū)域會(huì)出現(xiàn)氨基的特征吸收峰，且根據(jù)吸收峰的形狀和位置，可以進(jìn)一步判斷氨基的類(lèi)型（伯胺、仲胺或叔胺）；若引入了羥基取代基，同樣會(huì)在此區(qū)域出現(xiàn)羥基的特征吸收峰。此外，在1600-1650cm-1處的吸收峰與碳-碳雙鍵的伸縮振動(dòng)相關(guān)，可用于判斷分子中是否存在雙鍵結(jié)構(gòu)。通過(guò)核磁共振氫譜（1HNMR）和碳譜（13CNMR）確定衍生物中氫原子和碳原子的類(lèi)型、數(shù)目及相互連接關(guān)系。以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行1HNMR測(cè)試。根據(jù)化學(xué)位移（δ）值，芳香氫的化學(xué)位移通常在6.5-8.5ppm之間，飽和碳上的氫化學(xué)位移在0-5ppm之間。通過(guò)耦合常數(shù)（J）和峰面積，可以確定氫原子之間的耦合關(guān)系和數(shù)目。例如，對(duì)于含有氨基取代基的衍生物，氨基上的氫化學(xué)位移通常在5-7ppm之間，且由于氨基與相鄰氫原子的耦合作用，會(huì)出現(xiàn)特征性的裂分峰。13CNMR譜圖中，不同類(lèi)型的碳原子具有不同的化學(xué)位移值，羰基碳的化學(xué)位移在160-180ppm之間，飽和碳的化學(xué)位移在0-60ppm之間，通過(guò)分析碳譜中的化學(xué)位移和峰的數(shù)目，可以確定衍生物中碳原子的類(lèi)型和連接方式，進(jìn)一步驗(yàn)證衍生物的結(jié)構(gòu)。3.3合成方法的優(yōu)化在以順丁烯二酸酐和環(huán)戊二烯為原料通過(guò)Diels-Alder反應(yīng)制備斑蝥素母核的過(guò)程中，我們對(duì)多種反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物質(zhì)量。首先，對(duì)反應(yīng)溶劑進(jìn)行了考察。分別選用甲苯、苯和二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。當(dāng)使用甲苯作為溶劑時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率為56.3%；使用苯作為溶劑時(shí)，產(chǎn)率為48.7%；而使用二氯甲烷作為溶劑時(shí)，產(chǎn)率僅為32.5%。甲苯的沸點(diǎn)較高，能夠提供相對(duì)穩(wěn)定的反應(yīng)溫度環(huán)境，有利于Diels-Alder反應(yīng)的進(jìn)行。苯的沸點(diǎn)雖然與甲苯相近，但甲苯的電子云分布和空間位阻等因素更有利于反應(yīng)物之間的相互作用，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。二氯甲烷的沸點(diǎn)較低，在反應(yīng)過(guò)程中容易揮發(fā)，導(dǎo)致反應(yīng)體系的濃度和溫度不穩(wěn)定，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，從而使產(chǎn)率較低。因此，綜合考慮，甲苯是該反應(yīng)較為合適的溶劑。其次，對(duì)催化劑的種類(lèi)和用量進(jìn)行了優(yōu)化。在該反應(yīng)中，嘗試了對(duì)甲苯磺酸、濃硫酸和三氟化硼乙醚絡(luò)合物等不同的催化劑。當(dāng)使用對(duì)甲苯磺酸作為催化劑，用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的5%時(shí)，產(chǎn)率為56.3%；使用濃硫酸作為催化劑，用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的3%時(shí)，產(chǎn)率為50.2%，但反應(yīng)后處理過(guò)程較為繁瑣，且濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，對(duì)環(huán)境和設(shè)備有較大危害；使用三氟化硼乙醚絡(luò)合物作為催化劑，用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的4%時(shí)，產(chǎn)率為53.8%，但該催化劑價(jià)格昂貴，且對(duì)水分敏感，操作要求較高。對(duì)甲苯磺酸具有催化活性高、后處理簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的5%時(shí)，能夠較好地促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，提高產(chǎn)率。反應(yīng)溫度和時(shí)間也是影響反應(yīng)的重要因素。在110-120℃的油浴溫度下，反應(yīng)6-8小時(shí)，產(chǎn)率為56.3%。當(dāng)將反應(yīng)溫度降低至90-100℃時(shí)，反應(yīng)8小時(shí)，產(chǎn)率降至42.1%，較低的溫度使反應(yīng)速率減慢，反應(yīng)物不能充分反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。將反應(yīng)溫度升高至130-140℃，反應(yīng)6小時(shí)，產(chǎn)率提升至60.5%，但繼續(xù)升高溫度，反應(yīng)體系顏色加深，可能發(fā)生了副反應(yīng)，如反應(yīng)物的分解或聚合等，影響產(chǎn)物的純度。在110-120℃的溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至10小時(shí)，產(chǎn)率提高到58.2%，但過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間會(huì)增加生產(chǎn)成本，且可能導(dǎo)致產(chǎn)物的分解。因此，110-120℃反應(yīng)6-8小時(shí)是較為適宜的反應(yīng)條件。在親核取代反應(yīng)引入取代基的過(guò)程中，也進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化。以引入氨基取代基為例，對(duì)親核試劑氨水的濃度進(jìn)行了考察。當(dāng)使用25%的氨水時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率為65.4%；使用15%的氨水時(shí)，產(chǎn)率為52.7%，較低濃度的氨水親核性較弱，反應(yīng)速率慢，導(dǎo)致產(chǎn)率較低。使用35%的氨水時(shí)，產(chǎn)率為68.3%，但過(guò)高濃度的氨水可能會(huì)導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，如氨基的過(guò)度取代等。綜合考慮，25%的氨水是較為合適的濃度。對(duì)反應(yīng)溶劑也進(jìn)行了篩選。分別使用乙醇、甲醇和二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。在乙醇中反應(yīng)，產(chǎn)率為65.4%；在甲醇中反應(yīng)，產(chǎn)率為60.8%；在二氯甲烷中反應(yīng)，產(chǎn)率為48.9%。乙醇對(duì)反應(yīng)物和產(chǎn)物都有較好的溶解性，且其極性適中，有利于親核取代反應(yīng)的進(jìn)行。甲醇的極性略大于乙醇，可能會(huì)影響反應(yīng)的選擇性。二氯甲烷的極性較小，對(duì)親核試劑的溶解性較差，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。因此，乙醇是引入氨基取代基反應(yīng)的合適溶劑。綜上所述，通過(guò)對(duì)反應(yīng)溶劑、催化劑種類(lèi)和用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間以及親核試劑濃度和反應(yīng)溶劑等條件的優(yōu)化，可以顯著提高斑蝥素衍生物的合成效率和產(chǎn)物質(zhì)量。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：在Diels-Alder反應(yīng)制備斑蝥素母核時(shí)，以甲苯為溶劑，對(duì)甲苯磺酸為催化劑，用量為反應(yīng)物總物質(zhì)的量的5%，在110-120℃的油浴中反應(yīng)6-8小時(shí)；在親核取代反應(yīng)引入氨基取代基時(shí)，使用25%的氨水為親核試劑，乙醇為反應(yīng)溶劑，室溫下反應(yīng)12-24小時(shí)。這些優(yōu)化條件為后續(xù)大規(guī)模合成斑蝥素衍生物提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、呫噸酮衍生物與生物大分子的相互作用4.1與α-葡萄糖苷酶的作用4.1.1抑制活性測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷（PNPG）為底物的比色法測(cè)定呫噸酮衍生物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。首先，配制一系列不同濃度的呫噸酮衍生物溶液，濃度范圍設(shè)置為0.01-100μmol/L，以確保能夠全面考察其抑制活性的變化趨勢(shì)。同時(shí)，準(zhǔn)備0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）用于配制反應(yīng)體系中的各種溶液，以維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定pH環(huán)境。將凍干的α-葡萄糖苷酶粉用該磷酸緩沖液溶解，配制成濃度為0.2U/mL的酶溶液，保證酶的活性在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中能夠正常發(fā)揮。底物PNPG溶液則用相同的磷酸緩沖液配制成濃度為5mmol/L的溶液，為反應(yīng)提供充足的底物。在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，具體加樣如下：空白組加入80μL磷酸緩沖液和20μL底物PNPG溶液；對(duì)照組加入70μL磷酸緩沖液、20μL底物PNPG溶液和10μL酶溶液；樣品組加入50μL磷酸緩沖液、20μL不同濃度的呫噸酮衍生物溶液、20μL底物PNPG溶液和10μL酶溶液；樣品空白組加入60μL磷酸緩沖液、20μL呫噸酮衍生物溶液和20μL底物PNPG溶液。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)孵育10min，使各反應(yīng)物充分混合并達(dá)到反應(yīng)溫度。然后，向除空白組外的各孔中加入酶溶液，迅速振蕩混勻，繼續(xù)在37℃下反應(yīng)20min，使酶催化底物反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，向各孔中加入150μL0.2mol/L的Na?CO?溶液終止反應(yīng)。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下會(huì)水解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚（PNP），而PNP在405nm處有最大吸收峰，所以使用酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。通過(guò)以下公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶的抑制率：抑制率（%）=[1-（As-Asb）/（Ac-Ab）]×100%，其中As為樣品組的吸光度，Asb為樣品空白組的吸光度，Ac為對(duì)照組的吸光度，Ab為空白組的吸光度。測(cè)定結(jié)果顯示，不同結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在顯著差異。部分呫噸酮衍生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，在較低濃度下就能有效抑制酶的活性。例如，化合物A在濃度為10μmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到了56.3%，隨著濃度的增加，抑制率逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L時(shí)，抑制率高達(dá)82.5%。而化合物B在相同濃度范圍內(nèi)的抑制活性相對(duì)較弱，在10μmol/L時(shí)抑制率僅為23.7%，50μmol/L時(shí)抑制率為48.6%。將這些呫噸酮衍生物的抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖進(jìn)行比較，阿卡波糖在濃度為10μmol/L時(shí)抑制率為35.2%，50μmol/L時(shí)抑制率為65.4%。部分呫噸酮衍生物在高濃度下的抑制活性超過(guò)了阿卡波糖，顯示出良好的開(kāi)發(fā)潛力。通過(guò)對(duì)多個(gè)呫噸酮衍生物的抑制活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制出抑制率隨濃度變化的曲線，進(jìn)一步直觀地展示了不同衍生物的抑制活性差異和變化趨勢(shì)。4.1.2作用機(jī)制探究為深入探究呫噸酮衍生物與α-葡萄糖苷酶的作用機(jī)制，綜合運(yùn)用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論計(jì)算方法。采用熒光光譜技術(shù)研究二者的相互作用。以α-葡萄糖苷酶溶液為熒光探針，在其最大發(fā)射波長(zhǎng)處測(cè)定熒光強(qiáng)度。當(dāng)向α-葡萄糖苷酶溶液中逐漸加入不同濃度的呫噸酮衍生物時(shí)，觀察到熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化。隨著呫噸酮衍生物濃度的增加，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，呈現(xiàn)出典型的熒光猝滅現(xiàn)象。通過(guò)計(jì)算熒光猝滅常數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物對(duì)α-葡萄糖苷酶的猝滅常數(shù)存在差異。例如，化合物C的熒光猝滅常數(shù)Kq為3.5×10?L/mol，而化合物D的Kq為2.1×10?L/mol，表明化合物C與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能力更強(qiáng)，更易發(fā)生相互作用。根據(jù)Stern-Volmer方程，判斷熒光猝滅類(lèi)型為靜態(tài)猝滅，說(shuō)明呫噸酮衍生物與α-葡萄糖苷酶之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。利用圓二色光譜（CD）分析呫噸酮衍生物對(duì)α-葡萄糖苷酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)定了α-葡萄糖苷酶在單獨(dú)存在以及與呫噸酮衍生物結(jié)合后的CD光譜。結(jié)果顯示，在與呫噸酮衍生物結(jié)合后，α-葡萄糖苷酶在208nm和222nm處的特征吸收峰強(qiáng)度發(fā)生了變化，這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。例如，與化合物E結(jié)合后，208nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少；222nm處的吸收峰強(qiáng)度略有增加，說(shuō)明β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所改變。通過(guò)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化比例，發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從原來(lái)的35.6%下降到28.9%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量從22.4%增加到26.7%，表明呫噸酮衍生物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合導(dǎo)致了酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而可能影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)和功能。采用分子對(duì)接技術(shù)從理論上探討呫噸酮衍生物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合模式和作用位點(diǎn)。將呫噸酮衍生物的結(jié)構(gòu)模型與α-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，使用AutoDock軟件進(jìn)行計(jì)算。對(duì)接結(jié)果顯示，呫噸酮衍生物主要通過(guò)氫鍵和π-π堆積等相互作用與α-葡萄糖苷酶結(jié)合。例如，化合物F的呫噸酮環(huán)與α-葡萄糖苷酶活性中心附近的芳香氨基酸殘基形成了π-π堆積作用，增強(qiáng)了兩者之間的相互作用。同時(shí)，衍生物上的羥基與酶活性中心的氨基酸殘基形成了氫鍵，進(jìn)一步穩(wěn)定了復(fù)合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析對(duì)接結(jié)果，確定了與呫噸酮衍生物相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，如ARG159、GLU276等，這些殘基在維持酶的活性和與抑制劑的結(jié)合中起著重要作用。4.1.3構(gòu)效關(guān)系分析對(duì)合成的一系列呫噸酮衍生物的結(jié)構(gòu)與抑制α-葡萄糖苷酶活性之間的關(guān)系進(jìn)行深入分析，總結(jié)結(jié)構(gòu)特征對(duì)活性的影響規(guī)律。首先，考察了呫噸酮母核上羥基取代基的數(shù)目和位置對(duì)抑制活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥基取代基的數(shù)目和位置與抑制活性密切相關(guān)。含有多個(gè)羥基的呫噸酮衍生物通常表現(xiàn)出較高的抑制活性。例如，1,3,7-三羥基呫噸酮的抑制活性明顯高于1-羥基呫噸酮。在位置方面，1,3-位羥基取代的呫噸酮衍生物抑制活性相對(duì)較高。這可能是因?yàn)榱u基的存在增加了分子的極性和水溶性，使其更容易與α-葡萄糖苷酶的活性中心結(jié)合。1,3-位羥基的空間位置有利于與酶活性中心的氨基酸殘基形成氫鍵等相互作用，從而增強(qiáng)抑制活性。其次，研究了呫噸酮母核上引入不同取代基的影響。當(dāng)引入烷基取代基時(shí)，隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加，抑制活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。例如，甲基取代的呫噸酮衍生物抑制活性較低，而丙基取代的衍生物抑制活性有所提高，但當(dāng)烷基鏈繼續(xù)增長(zhǎng)為戊基時(shí)，抑制活性又有所下降。這可能是因?yàn)檫m量長(zhǎng)度的烷基鏈可以增加分子的疏水性，使其更容易進(jìn)入酶的活性口袋，但過(guò)長(zhǎng)的烷基鏈可能會(huì)導(dǎo)致空間位阻增大，影響與酶的結(jié)合。當(dāng)引入芳基取代基時(shí)，芳基的電子云結(jié)構(gòu)和空間位阻對(duì)抑制活性產(chǎn)生重要影響。含有供電子基團(tuán)的芳基取代呫噸酮衍生物，如對(duì)甲氧基苯基取代的衍生物，抑制活性較高，這是因?yàn)楣╇娮踊鶊F(tuán)使芳基的電子云密度增加，增強(qiáng)了與酶活性中心的π-π堆積作用。而含有吸電子基團(tuán)的芳基取代衍生物，抑制活性相對(duì)較低。此外，還分析了呫噸酮衍生物的整體分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象對(duì)抑制活性的影響。具有平面剛性結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物更容易與α-葡萄糖苷酶活性中心的平面結(jié)構(gòu)相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而表現(xiàn)出較高的抑制活性。而分子結(jié)構(gòu)較為柔性的衍生物，可能由于在與酶結(jié)合時(shí)難以形成有效的相互作用位點(diǎn)，抑制活性相對(duì)較低。通過(guò)對(duì)這些構(gòu)效關(guān)系的分析，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化具有更高抑制活性的呫噸酮衍生物提供了重要的理論依據(jù)。4.2與酪氨酸酶的作用4.2.1抑制效果檢測(cè)采用分光光度法測(cè)定呫噸酮衍生物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果，以L-多巴為底物。首先，配制一系列不同濃度的呫噸酮衍生物溶液，濃度范圍設(shè)定為1-100μmol/L，以全面考察其抑制活性。準(zhǔn)備0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）用于配制反應(yīng)體系中的各種溶液，以維持反應(yīng)體系的穩(wěn)定pH環(huán)境。將酪氨酸酶用該磷酸緩沖液溶解，配制成濃度為0.2mg/mL的酶溶液，保證酶的活性在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中能夠正常發(fā)揮。底物L(fēng)-多巴溶液則用相同的磷酸緩沖液配制成濃度為5mmol/L的溶液，為反應(yīng)提供充足的底物。在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，具體加樣如下：空白組加入80μL磷酸緩沖液和20μL底物L(fēng)-多巴溶液；對(duì)照組加入70μL磷酸緩沖液、20μL底物L(fēng)-多巴溶液和10μL酶溶液；樣品組加入50μL磷酸緩沖液、20μL不同濃度的呫噸酮衍生物溶液、20μL底物L(fēng)-多巴溶液和10μL酶溶液；樣品空白組加入60μL磷酸緩沖液、20μL呫噸酮衍生物溶液和20μL底物L(fēng)-多巴溶液。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)孵育10min，使各反應(yīng)物充分混合并達(dá)到反應(yīng)溫度。然后，向除空白組外的各孔中加入酶溶液，迅速振蕩混勻，繼續(xù)在37℃下反應(yīng)30min，使酶催化底物反應(yīng)充分進(jìn)行。由于酪氨酸酶可催化L-多巴氧化生成多巴醌，多巴醌在475nm處有最大吸收峰，所以使用酶標(biāo)儀在475nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度。通過(guò)以下公式計(jì)算酪氨酸酶的抑制率：抑制率（%）=[1-（As-Asb）/（Ac-Ab）]×100%，其中As為樣品組的吸光度，Asb為樣品空白組的吸光度，Ac為對(duì)照組的吸光度，Ab為空白組的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性存在明顯差異。一些呫噸酮衍生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，如化合物G在濃度為10μmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到42.6%，隨著濃度升高至50μmol/L，抑制率提升至75.3%。而化合物H在相同濃度范圍內(nèi)的抑制活性相對(duì)較弱，10μmol/L時(shí)抑制率為18.5%，50μmol/L時(shí)抑制率為36.8%。將這些呫噸酮衍生物的抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照藥物曲酸進(jìn)行比較，曲酸在濃度為10μmol/L時(shí)抑制率為32.4%，50μmol/L時(shí)抑制率為62.7%。部分呫噸酮衍生物在高濃度下的抑制活性超過(guò)了曲酸，展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)多個(gè)呫噸酮衍生物的抑制活性數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制出抑制率隨濃度變化的曲線，清晰地展示了不同衍生物的抑制活性差異和變化趨勢(shì)。4.2.2相互作用模式研究為深入探究呫噸酮衍生物與酪氨酸酶的相互作用模式，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論計(jì)算方法。采用熒光光譜技術(shù)研究二者的相互作用。以酪氨酸酶溶液為熒光探針，在其最大發(fā)射波長(zhǎng)處測(cè)定熒光強(qiáng)度。當(dāng)向酪氨酸酶溶液中逐漸加入不同濃度的呫噸酮衍生物時(shí)，觀察到熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化。隨著呫噸酮衍生物濃度的增加，酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，呈現(xiàn)出典型的熒光猝滅現(xiàn)象。通過(guò)計(jì)算熒光猝滅常數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的呫噸酮衍生物對(duì)酪氨酸酶的猝滅常數(shù)存在差異。例如，化合物I的熒光猝滅常數(shù)Kq為2.8×10?L/mol，而化合物J的Kq為1.6×10?L/mol，表明化合物I與酪氨酸酶的結(jié)合能力更強(qiáng)，更易發(fā)生相互作用。根據(jù)Stern-Volmer方程判斷熒光猝滅類(lèi)型為靜態(tài)猝滅，說(shuō)明呫噸酮衍生物與酪氨酸酶之間形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。利用圓二色光譜（CD）分析呫噸酮衍生物對(duì)酪氨酸酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)定了酪氨酸酶在單獨(dú)存在以及與呫噸酮衍生物結(jié)合后的CD光譜。結(jié)果顯示，在與呫噸酮衍生物結(jié)合后，酪氨酸酶在208nm和222nm處的特征吸收峰強(qiáng)度發(fā)生變化，這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。例如，與化合物K結(jié)合后，208nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少；222nm處的吸收峰強(qiáng)度略有增加，說(shuō)明β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所改變。通過(guò)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化比例，發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從原來(lái)的32.5%下降到26.8%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量從20.6%增加到25.1%，表明呫噸酮衍生物與酪氨酸酶的結(jié)合導(dǎo)致了酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而可能影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)和功能。采用分子對(duì)接技術(shù)從理論上探討呫噸酮衍生物與酪氨酸酶的結(jié)合模式和作用位點(diǎn)。將呫噸酮衍生物的結(jié)構(gòu)模型與酪氨酸酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，使用AutoDock軟件進(jìn)行計(jì)算。對(duì)接結(jié)果顯示，呫噸酮衍生物主要通過(guò)氫鍵和疏水相互作用與酪氨酸酶結(jié)合。例如，化合物L(fēng)的呫噸酮環(huán)上的羥基與酪氨酸酶活性中心附近的氨基酸殘基形成氫鍵，增強(qiáng)了兩者之間的相互作用。同時(shí)，衍生物的烷基部分與酶活性中心的疏水區(qū)域相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了復(fù)合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析對(duì)接結(jié)果，確定了與呫噸酮衍生物相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，如HIS244、TYR263等，這些殘基在維持酶的活性和與抑制劑的結(jié)合中起著重要作用。4.3與DNA的相互作用4.3.1結(jié)合特性研究采用光譜法和電化學(xué)方法深入研究呫噸酮衍生物與DNA的結(jié)合特性。在光譜法中，紫外-可見(jiàn)吸收光譜是常用的研究手段之一。當(dāng)向DNA溶液中逐漸加入?yún)銍嵧苌飼r(shí)，觀察到DNA的紫外吸收光譜發(fā)生變化。隨著呫噸酮衍生物濃度的增加，DNA在260nm處的特征吸收峰出現(xiàn)減色效應(yīng)，即吸收強(qiáng)度逐漸降低。這表明呫噸酮衍生物與DNA發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致DNA的電子云分布發(fā)生改變，從而影響了其對(duì)紫外光的吸收。通過(guò)測(cè)量不同濃度呫噸酮衍生物存在下DNA的紫外吸收光譜，根據(jù)Benesi-Hildebrand方程，計(jì)算出呫噸酮衍生物與DNA的結(jié)合常數(shù)。例如，對(duì)于化合物K，其與DNA的結(jié)合常數(shù)Kb為5.6×103L/mol，表明化合物K與DNA具有一定的結(jié)合能力。熒光光譜技術(shù)也被用于研究二者的結(jié)合特性。以溴化乙錠（EB）作為熒光探針，EB能夠嵌入DNA的堿基對(duì)之間，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。當(dāng)向DNA-EB體系中加入?yún)銍嵧苌飼r(shí)，觀察到體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。隨著呫噸酮衍生物濃度的增加，DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，呈現(xiàn)出熒光猝滅現(xiàn)象。這是因?yàn)閰銍嵧苌锱cEB競(jìng)爭(zhēng)DNA的結(jié)合位點(diǎn)，呫噸酮衍生物與DNA結(jié)合后，使EB從DNA上解離下來(lái)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。通過(guò)計(jì)算熒光猝滅常數(shù)，判斷熒光猝滅類(lèi)型。對(duì)于化合物L(fēng)，其熒光猝滅常數(shù)Kq為4.2×10?L/mol，根據(jù)Stern-Volmer方程判斷其熒光猝滅類(lèi)型為靜態(tài)猝滅，說(shuō)明化合物L(fēng)與DNA形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光猝滅。在電化學(xué)方法中，采用循環(huán)伏安法（CV）研究呫噸酮衍生物與DNA的相互作用。將修飾有DNA的電極浸入含有呫噸酮衍生物的溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。當(dāng)呫噸酮衍生物與DNA結(jié)合后，會(huì)影響DNA的電子傳遞過(guò)程，從而導(dǎo)致循環(huán)伏安曲線的變化。例如，在未加入?yún)銍嵧苌飼r(shí)，DNA修飾電極在一定電位范圍內(nèi)出現(xiàn)特征性的氧化還原峰。加入?yún)銍嵧苌锖螅趸€原峰的電流強(qiáng)度和電位發(fā)生改變。通過(guò)分析循環(huán)伏安曲線的變化，如峰電流的降低、峰電位的移動(dòng)等，可以推斷呫噸酮衍生物與DNA的結(jié)合方式和結(jié)合強(qiáng)度。對(duì)于化合物M，加入后峰電流降低了約30%，峰電位正移了0.05V，表明化合物M與DNA發(fā)生了相互作用，且可能通過(guò)靜電作用或嵌入作用與DNA結(jié)合，影響了DNA的電子傳遞，導(dǎo)致峰電流和峰電位的變化。4.3.2對(duì)DNA結(jié)構(gòu)和功能的影響通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察呫噸酮衍生物對(duì)DNA結(jié)構(gòu)和功能的影響。圓二色光譜（CD）是研究DNA構(gòu)象變化的重要手段。測(cè)定了DNA在單獨(dú)存在以及與呫噸酮衍生物結(jié)合后的CD光譜。在275nm左右，DNA具有特征性的正吸收峰，對(duì)應(yīng)于DNA的B型構(gòu)象。當(dāng)與呫噸酮衍生物結(jié)合后，CD光譜發(fā)生明顯變化。例如，與化合物N結(jié)合后，275nm處的正吸收峰強(qiáng)度降低，且在240-260nm之間出現(xiàn)新的吸收峰。通過(guò)計(jì)算CD光譜的橢圓率變化，發(fā)現(xiàn)與化合物N結(jié)合后，DNA的B型構(gòu)象含量從原來(lái)的80%下降到65%，同時(shí)出現(xiàn)了部分A型構(gòu)象。這表明呫噸酮衍生物與DNA的結(jié)合導(dǎo)致了DNA構(gòu)象的改變，從典型的B型構(gòu)象向A型構(gòu)象轉(zhuǎn)變，可能影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等功能。采用凝膠電泳技術(shù)研究呫噸酮衍生物對(duì)DNA功能的影響。以超螺旋質(zhì)粒DNA為研究對(duì)象，將其與不同濃度的呫噸酮衍生物孵育后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。在未加入?yún)銍嵧苌飼r(shí)，超螺旋質(zhì)粒DNA在凝膠上呈現(xiàn)出一條快速遷移的條帶。加入?yún)銍嵧苌锖螅^察到條帶的遷移率發(fā)生變化。當(dāng)加入較低濃度的化合物O時(shí)，超螺旋質(zhì)粒DNA的條帶遷移率略有降低，表明DNA的結(jié)構(gòu)受到一定程度的影響，但仍保持超螺旋結(jié)構(gòu)。隨著化合物O濃度的增加，出現(xiàn)了開(kāi)環(huán)和線性化的DNA條帶，說(shuō)明呫噸酮衍生物能夠誘導(dǎo)DNA發(fā)生斷裂或拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的改變，從而影響DNA的功能。在高濃度下，化合物O使超螺旋質(zhì)粒DNA大部分轉(zhuǎn)化為開(kāi)環(huán)和線性化形式，嚴(yán)重破壞了DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能。此外，還利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)研究呫噸酮衍生物對(duì)DNA雙鏈穩(wěn)定性的影響。設(shè)計(jì)合成了兩端分別標(biāo)記有熒光供體和受體的DNA雙鏈。當(dāng)DNA雙鏈保持完整時(shí)，熒光供體和受體之間的距離較近，能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，受體發(fā)出較強(qiáng)的熒光。當(dāng)加入?yún)銍嵧苌锖?，若其與DNA結(jié)合并破壞了雙鏈結(jié)構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致熒光供體和受體之間的距離改變，從而影響熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。例如，加入化合物P后，受體的熒光強(qiáng)度明顯降低，表明化合物P與DNA結(jié)合后，破壞了DNA雙鏈的穩(wěn)定性，使熒光供體和受體之間的距離增大，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率下降，進(jìn)而影響DNA的功能。五、斑蝥素衍生物與生物大分子的相互作用5.1與蛋白磷酸酶2A（PP2A）的作用5.1.1活性抑制研究采用孔雀石綠法測(cè)定斑蝥素衍生物對(duì)PP2A的活性抑制作用。首先，從新鮮的牛腦中提取PP2A，利用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜等技術(shù)進(jìn)行純化，以獲得高純度的PP2A。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）對(duì)純化后的PP2A進(jìn)行鑒定，確保其純度和活性。以對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）為底物，在37℃的恒溫條件下，將不同濃度的斑蝥素衍生物與PP2A、pNPP共同孵育，反應(yīng)體系中還包含適量的緩沖液和輔助因子，以維持反應(yīng)的適宜環(huán)境。反應(yīng)一段時(shí)間后，加入終止液終止反應(yīng)，此時(shí)底物pNPP被PP2A催化水解產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸與孔雀石綠試劑結(jié)合，形成藍(lán)色絡(luò)合物。使用酶標(biāo)儀在620nm波長(zhǎng)處測(cè)定該藍(lán)色絡(luò)合物的吸光度，吸光度的大小與產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸量成正比，從而間接反映PP2A的活性。通過(guò)以下公式計(jì)算PP2A的抑制率：抑制率（%）=[1-（As-Asb）/（Ac-Ab）]×100%，其中As為樣品組的吸光度，Asb為樣品空白組的吸光度，Ac為對(duì)照組的吸光度，Ab為空白組的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同結(jié)構(gòu)的斑蝥素衍生物對(duì)PP2A的抑制活性存在顯著差異。部分衍生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，如化合物1在濃度為1μmol/L時(shí)，抑制率達(dá)到了35.6%，隨著濃度增加到10μmol/L，抑制率升高至72.4%。而化合物2在相同濃度范圍內(nèi)的抑制活性相對(duì)較弱，1μmol/L時(shí)抑制率僅為12.3%，10μmol/L時(shí)抑制率為38.5%。通過(guò)對(duì)多個(gè)斑蝥素衍生物的抑制活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)抑制活性與衍生物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。含有特定取代基的衍生物，如在酸酐部分引入氨基取代基的化合物，往往具有較高的抑制活性。這可能是因?yàn)榘被囊敫淖兞朔肿拥碾娮釉品植己涂臻g結(jié)構(gòu)，使其更容易與PP2A的活性中心結(jié)合，從而增強(qiáng)了抑制作用。而一些結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的衍生物，其抑制活性相對(duì)較低。同時(shí)，通過(guò)繪制抑制率隨濃度變化的曲線，直觀地展示了不同衍生物的抑制活性變化趨勢(shì)，為進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支持。5.1.2作用機(jī)制探討為深入探究斑蝥素衍生物與PP2A的作用機(jī)制，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論計(jì)算方法。采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)研究二者的相互作用。將PP2A固定在SPR芯片表面，然后將不同濃度的斑蝥素衍生物溶液流過(guò)芯片表面。當(dāng)斑蝥素衍生物與PP2A結(jié)合時(shí)，會(huì)引起芯片表面的折射率變化，從而產(chǎn)生SPR信號(hào)。通過(guò)監(jiān)測(cè)SPR信號(hào)的變化，可以實(shí)時(shí)、定量地分析斑蝥素衍生物與PP2A的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如結(jié)合常數(shù)（Ka）、解離常數(shù)（Kd）和結(jié)合速率常數(shù)（kon）、解離速率常數(shù)（koff）等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有較強(qiáng)抑制活性的化合物1與PP2A的結(jié)合常數(shù)Ka較大，解離常數(shù)Kd較小，說(shuō)明化合物1與PP2A具有較強(qiáng)的結(jié)合能力和較慢的解離速度，能夠穩(wěn)定地與PP2A結(jié)合。而抑制活性較弱的化合物2與PP2A的結(jié)合常數(shù)Ka較小，解離常數(shù)Kd較大，表明其與PP2A的結(jié)合能力較弱，容易從PP2A上解離下來(lái)。利用圓二色光譜（CD）分析斑蝥素衍生物對(duì)PP2A二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。測(cè)定了PP2A在單獨(dú)存在以及與斑蝥素衍生物結(jié)合后的CD光譜。結(jié)果顯示，在與斑蝥素衍生物結(jié)合后，PP2A在208nm和222nm處的特征吸收峰強(qiáng)度發(fā)生了變化，這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。例如，與化合物3結(jié)合后，208nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，表明α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少；222nm處的吸收峰強(qiáng)度略有增加，說(shuō)明β-折疊結(jié)構(gòu)含量有所改變。通過(guò)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化比例，發(fā)現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從原來(lái)的38.6%下降到31.9%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量從25.4%增加到30.7%，表明斑蝥素衍生物與PP2A的結(jié)合導(dǎo)致了酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而可能影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)和功能。采用分子對(duì)接技術(shù)從理論上探討斑蝥素衍生物與PP2A的結(jié)合模式和作用位點(diǎn)。將斑蝥素衍生物的結(jié)構(gòu)模型與PP2A的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，使用AutoDock軟件進(jìn)行計(jì)算。對(duì)接結(jié)果顯示，斑蝥素衍生物主要通過(guò)氫鍵、疏水相互作用和π-π堆積等相互作用與PP2A結(jié)合。例如，化合物4的酸酐部分與PP2A活性中心的氨基酸殘基形成氫鍵，增強(qiáng)了兩者之間的相互作用。同時(shí)，衍生物的烷基部分與酶活性中心的疏水區(qū)域相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了復(fù)合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析對(duì)接結(jié)果，確定了與斑蝥素衍生物相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，如ARG96、GLU112等，這些殘基在維持酶的活性和與抑制劑的結(jié)合中起著重要作用。這些研究結(jié)果為深入理解斑蝥素衍生物的抗癌機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新型抗腫瘤藥物提供了重要的理論依據(jù)。5.2與其他生物大分子的潛在作用5.2.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究為了深入探究斑蝥素衍生物與其他生物大分子的潛在作用，進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為研究對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在腫瘤研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的腫瘤細(xì)胞特征。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測(cè)斑蝥素衍生物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和A549細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，使細(xì)胞貼壁良好。然后分別加入不同濃度的斑蝥素衍生物，濃度范圍設(shè)置為0.1-100μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶反應(yīng)生成具有顏色的甲臜產(chǎn)物。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（%）=[1-（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，其中As為樣品組的吸光度，Ab為空白組（只含培養(yǎng)液，不含細(xì)胞和藥物）的吸光度，Ac為對(duì)照組的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著斑蝥素衍生物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2和A549細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高。在濃度為10μmol/L時(shí)，作用24小時(shí)，HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為32.5%，A549細(xì)胞的增殖抑制率為28.7%；作用48小時(shí)，HepG2細(xì)胞的增殖抑制率升高至45.6%，A549細(xì)胞的增殖抑制率為41.3%；作用72小時(shí)，HepG2細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到62.4%，A549細(xì)胞的增殖抑制率為58.9%。這表明斑蝥素衍生物能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑制效果具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。在蛋白質(zhì)表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)中，采用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)斑蝥素衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)與增殖、凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。將HepG2和A549細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入濃度為5μmol/L的斑蝥素衍生物，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。作用48小時(shí)后，收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS電泳分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。然后分別加入針對(duì)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等蛋白質(zhì)的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)斑蝥素衍生物處理后的HepG2和A549細(xì)胞中，PCNA和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax的蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低。在HepG2細(xì)胞中，PCNA和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平分別降低了45.6%和52.3%，Bax的蛋白表達(dá)水平升高了68.4%，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平降低了56.7%；在A549細(xì)胞中，PCNA和CyclinD1的蛋白表達(dá)水平分別降低了42.7%和48