2025年pcr上崗證歷年考試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.下列關(guān)于PCR技術(shù)基本原理的描述，錯誤的是：A.通過高溫變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈B.引物在退火階段與模板DNA特異性結(jié)合C.TaqDNA聚合酶在延伸階段催化dNTP連接D.每個循環(huán)僅需完成變性、退火兩步即可完成擴增答案：D（解析：PCR基本循環(huán)包括變性、退火、延伸三步，延伸是合成新鏈的關(guān)鍵步驟）2.引物設(shè)計時，若GC含量過高（>60%），最可能導(dǎo)致的問題是：A.引物與模板結(jié)合效率降低B.引物二聚體形成概率增加C.擴增產(chǎn)物長度異常D.退火溫度難以優(yōu)化答案：B（解析：GC含量過高易導(dǎo)致引物自身互補序列配對，形成二聚體）3.熒光定量PCR中，SYBRGreenⅠ染料法的主要缺點是：A.靈敏度低于探針法B.無法區(qū)分非特異性擴增產(chǎn)物C.實驗成本顯著高于探針法D.只能用于絕對定量答案：B（解析：SYBRGreenⅠ能結(jié)合所有雙鏈DNA，無法區(qū)分目標產(chǎn)物與引物二聚體等非特異性產(chǎn)物）4.進行RNA模板的RT-PCR時，若未去除基因組DNA污染，最可能出現(xiàn)的結(jié)果是：A.擴增效率顯著降低B.熔解曲線出現(xiàn)雙峰C.Ct值明顯小于預(yù)期D.產(chǎn)物條帶分子量偏大答案：C（解析：基因組DNA含完整外顯子，擴增時會與cDNA同時被擴增，導(dǎo)致Ct值提前）5.實驗室進行PCR檢測時，若某樣本重復(fù)檢測Ct值差異>2個循環(huán)，最可能的原因是：A.移液器校準不準確B.擴增儀孔間溫度差異C.模板濃度過低D.以上均可能答案：D（解析：移液器誤差、擴增儀孔間溫度不均、低濃度模板的隨機波動均可導(dǎo)致Ct值差異）6.關(guān)于PCR實驗室分區(qū)管理，正確的操作是：A.試劑準備區(qū)可同時處理樣本和配制反應(yīng)體系B.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的物品可帶入樣本處理區(qū)C.各區(qū)域工作服嚴格區(qū)分，不得交叉使用D.樣本處理區(qū)可使用普通離心機替代生物安全柜答案：C（解析：分區(qū)管理要求各區(qū)域物品、工作服專用，避免交叉污染）7.某實驗室使用質(zhì)粒標準品繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.95，斜率為-3.8，提示：A.標準品濃度梯度設(shè)置合理B.擴增效率約為85%（E=10^(-1/斜率)-1）C.存在嚴重的抑制物污染D.反應(yīng)體系中dNTP濃度過高答案：B（解析：擴增效率E=10^(-1/斜率)-1，代入斜率-3.8計算得E≈85%；R2>0.98為合格，0.95提示標準品梯度可能不均勻）8.進行新冠病毒核酸檢測時，若陽性對照Ct值>35，最可能的原因是：A.陽性對照保存時間過長導(dǎo)致降解B.擴增程序中延伸時間不足C.引物與目標序列存在錯配D.以上均可能答案：D（解析：模板降解、酶活性不足、引物錯配均可導(dǎo)致陽性對照Ct值異常升高）9.下列關(guān)于內(nèi)參基因的描述，錯誤的是：A.需在檢測樣本中穩(wěn)定表達B.擴增效率應(yīng)與目標基因一致C.可用于評估樣本RNA提取質(zhì)量D.內(nèi)參基因Ct值越大，說明樣本質(zhì)量越好答案：D（解析：內(nèi)參基因Ct值越小，說明樣本中內(nèi)參RNA含量越高，質(zhì)量越好）10.PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度過高最可能導(dǎo)致：A.引物與模板非特異性結(jié)合B.Taq酶活性被抑制C.dNTP與Mg2+結(jié)合減少D.擴增產(chǎn)物量顯著降低答案：A（解析：Mg2+濃度過高會降低引物退火特異性，導(dǎo)致非特異性擴增）11.凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物時，若出現(xiàn)“smearedband（拖尾條帶）”，最可能的原因是：A.上樣量過大B.電泳電壓過高C.模板DNA降解D.以上均可能答案：D（解析：上樣量過大、電壓過高導(dǎo)致條帶擴散、模板降解產(chǎn)生不同長度片段均可導(dǎo)致拖尾）12.關(guān)于PCR實驗室生物安全，錯誤的做法是：A.處理樣本時佩戴N95口罩和雙層手套B.離心管開蓋前用75%乙醇噴灑消毒C.廢棄的擴增產(chǎn)物直接投入普通垃圾桶D.實驗結(jié)束后用紫外燈照射工作臺30分鐘答案：C（解析：擴增產(chǎn)物含大量目標DNA，需經(jīng)高壓滅菌或化學處理后按醫(yī)療廢物處理）13.熒光定量PCR中，“Ct值”的定義是：A.熒光信號達到基線值時的循環(huán)數(shù)B.熒光信號超過閾值時的循環(huán)數(shù)C.熒光信號達到平臺期時的循環(huán)數(shù)D.熒光信號開始指數(shù)增長時的循環(huán)數(shù)答案：B（解析：Ct值（CycleThreshold）是熒光信號首次超過設(shè)定閾值時的循環(huán)次數(shù)）14.進行多重PCR時，為避免引物間相互作用，關(guān)鍵措施是：A.提高Taq酶濃度B.優(yōu)化各引物的退火溫度C.增加模板DNA用量D.減少dNTP濃度答案：B（解析：多重PCR需保證所有引物的退火溫度一致，避免因溫度差異導(dǎo)致擴增效率不均）15.某實驗室檢測結(jié)果出現(xiàn)“假陰性”，最不可能的原因是：A.樣本采集部位不準確B.逆轉(zhuǎn)錄酶失活（針對RNA模板）C.擴增儀溫度校準偏差D.陽性對照Ct值正常答案：D（解析：陽性對照Ct值正常說明反應(yīng)體系和儀器正常，假陰性更可能由樣本或前處理問題導(dǎo)致）二、多項選擇題（每題3分，共15分，少選、錯選均不得分）1.下列屬于PCR實驗室必須配備的設(shè)備有：A.生物安全柜B.高速冷凍離心機C.實時熒光定量PCR儀D.紫外透射儀E.純水制備系統(tǒng)答案：ABCE（解析：紫外透射儀用于凝膠成像，非必須；其他均為樣本處理、反應(yīng)體系配制、擴增的關(guān)鍵設(shè)備）2.關(guān)于PCR污染防控措施，正確的有：A.實驗室設(shè)置獨立的空氣流向（試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)）B.使用dUTP代替dTTP并配合UNG酶處理C.每次實驗后用10%次氯酸鈉擦拭工作臺D.樣本處理區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)使用同一套移液器E.擴增產(chǎn)物檢測后及時清理實驗臺面答案：ABCE（解析：不同區(qū)域需使用專用移液器，避免交叉污染）3.熒光定量PCR結(jié)果判讀時，需關(guān)注的參數(shù)包括：A.擴增曲線的形態(tài)（是否呈S型）B.熔解曲線的峰型（是否單一尖銳）C.內(nèi)參基因的Ct值（是否在正常范圍內(nèi)）D.標準曲線的R2和斜率E.陰性對照是否有擴增（Ct值是否>40）答案：ABCDE（解析：以上均為結(jié)果判讀的關(guān)鍵參數(shù)）4.提取病毒RNA時，導(dǎo)致得率降低的可能原因有：A.樣本保存時間過長（超過48小時未提?。〣.裂解液加入量不足（未完全裂解病毒顆粒）C.離心速度不足（未有效沉淀RNA-磁珠復(fù)合物）D.洗脫緩沖液pH過高（影響RNA與磁珠的解離）E.操作過程中未使用RNase-free耗材答案：ABCDE（解析：樣本保存、裂解效率、分離步驟、洗脫條件及RNase污染均會影響RNA得率）5.關(guān)于PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，正確的策略有：A.若出現(xiàn)非特異性擴增，可嘗試提高退火溫度B.若擴增效率低，可增加引物濃度（不超過1μM）C.若產(chǎn)物量少，可增加循環(huán)數(shù)至45次以上D.若模板為基因組DNA，需適當延長延伸時間E.使用熱啟動Taq酶可減少退火階段的非特異性擴增答案：ABDE（解析：循環(huán)數(shù)超過40次易導(dǎo)致平臺期效應(yīng)，增加非特異性產(chǎn)物，通常不超過40次）三、判斷題（每題2分，共10分，正確打“√”，錯誤打“×”）1.PCR擴增產(chǎn)物的長度由引物的退火位置決定。（√）解析：引物分別結(jié)合模板的上下游，擴增產(chǎn)物長度為兩引物結(jié)合位點之間的距離。2.進行RT-PCR時，若使用Oligo(dT)引物，只能擴增帶有polyA尾的RNA。（√）解析：Oligo(dT)通過與mRNA的polyA尾結(jié)合進行逆轉(zhuǎn)錄，無法擴增rRNA、tRNA等無polyA尾的RNA。3.熒光定量PCR中，絕對定量需要已知濃度的標準品，相對定量則不需要。（√）解析：相對定量通過比較目標基因與內(nèi)參基因的表達差異（如2^-ΔΔCt法），無需標準品。4.實驗室可將不同批次的PCR試劑混合使用，以避免浪費。（×）解析：不同批次試劑的成分（如酶活性、緩沖液pH）可能存在差異，混合使用會影響實驗結(jié)果的一致性。5.凝膠電泳時，DNAmarker的作用是判斷擴增產(chǎn)物的分子量大小。（√）解析：DNAmarker含已知分子量的片段，通過與目標條帶遷移率對比可確定產(chǎn)物大小。四、簡答題（每題8分，共24分）1.簡述PCR反應(yīng)體系的基本組成及各組分的作用。答案：PCR反應(yīng)體系主要包括：（1）模板DNA/RNA：擴增的目標核酸，提供復(fù)制的模板；（2）引物：與模板特異性結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶起始合成；（3）dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）：合成新鏈的原料；（4）DNA聚合酶（如Taq酶）：催化dNTP沿模板鏈延伸；（5）緩沖液（含Mg2+）：維持酶活性所需的pH和離子環(huán)境，Mg2+是酶的輔因子；（6）去離子水：作為反應(yīng)介質(zhì)，確保各組分濃度準確。2.熒光定量PCR中“熔解曲線分析”的原理及操作要點是什么？答案：原理：不同雙鏈DNA的解鏈溫度（Tm值）與其GC含量、長度及序列有關(guān)。通過逐漸升溫（55-95℃）并監(jiān)測熒光信號（SYBRGreenⅠ在雙鏈解離時熒光減弱），可繪制熔解曲線。單一峰型提示產(chǎn)物為特異性擴增，多峰或?qū)挿逄崾敬嬖谝锒垠w或非特異性產(chǎn)物。操作要點：①擴增結(jié)束后設(shè)置熔解程序（通常以0.1-0.5℃/秒的速率升溫）；②確保反應(yīng)體系中無殘留的單鏈DNA（避免非特異性結(jié)合）；③陰性對照應(yīng)無熔解峰（或峰型與陽性對照顯著不同）；④分析時注意區(qū)分引物二聚體峰（通常Tm值較低，<80℃）與目標產(chǎn)物峰（Tm值較高）。3.列舉PCR實驗室常見的污染類型及對應(yīng)的防控措施。答案：常見污染類型及防控措施：（1）氣溶膠污染：擴增產(chǎn)物形成的微小顆粒擴散到實驗室環(huán)境中。防控措施：分區(qū)操作（嚴格按試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)單向流動）；使用帶濾芯的移液器吸頭；每次實驗后用紫外燈照射（30分鐘以上）或10%次氯酸鈉擦拭臺面。（2）交叉污染：樣本間相互污染。防控措施：樣本處理時使用一次性耗材；不同樣本處理時更換手套；采用帶蓋離心管，避免開蓋時氣溶膠擴散。（3）試劑污染：配制反應(yīng)體系時引入外源性DNA。防控措施：試劑分裝保存（避免反復(fù)凍融）；試劑準備區(qū)使用專用移液器；配制體系時戴口罩、手套，避免說話。（4）基因組DNA污染（針對RNA模板）：RNA提取時殘留基因組DNA。防控措施：提取RNA后用DNaseⅠ處理；設(shè)計引物時跨外顯子（避免擴增基因組DNA）；設(shè)置無逆轉(zhuǎn)錄對照（RT-）檢測是否存在DNA污染。五、案例分析題（共21分）某臨床基因擴增實驗室對20份疑似新冠病毒感染樣本進行檢測，使用熒光定量PCR法（靶標為ORF1ab和N基因），實驗過程及結(jié)果如下：實驗過程：-試劑準備：在樣本處理區(qū)配制反應(yīng)體系（未使用專用移液器）；-樣本處理：使用同一支移液器吸頭連續(xù)提取10份樣本（未更換吸頭）；-擴增程序：95℃預(yù)變性3分鐘，95℃15秒，55℃30秒，72℃30秒（40個循環(huán)）；-質(zhì)量控制：陽性對照Ct值=32（ORF1ab）、33（N基因）；陰性對照無擴增（Ct>40）；檢測結(jié)果：-樣本1：ORF1abCt=38（擴增曲線呈平臺期），N基因無擴增；-樣本2-5：ORF1ab和N基因Ct值均>40；-樣本6-20：ORF1ab和N基因Ct值均在25-30之間。問題：1.分析實驗過程中存在的操作問題（6分）；2.解釋樣本1的檢測結(jié)果可能的原因（5分）；3.樣本2-5報告“陰性”是否合理？說明理由（5分）；4.提出改進實驗的具體措施（5分）。答案：1.實驗過程中的操作問題：（1）試劑準備應(yīng)在專用的試劑準備區(qū)進行，不應(yīng)在樣本處理區(qū)配制，易引入樣本污染；（2）樣本處理時未更換移液器吸頭，可能導(dǎo)致樣本間交叉污染；（3）未設(shè)置內(nèi)參基因（如人源RNA酶P基因），無法評估樣本采集和提取質(zhì)量；（4）擴增程序的退火溫度（55℃）可能過低，易導(dǎo)致非特異性擴增（需根據(jù)引物Tm值優(yōu)化）；（5）未對移液器進行校準（連續(xù)使用同一吸頭可能導(dǎo)致加樣量不準確）。2.樣本1檢測結(jié)果的可能原因：（1）樣本中病毒載量極低（接近檢測限），僅ORF1ab基因被部分擴增，N基因未達到檢測閾值；（2）ORF1ab擴增曲線呈平臺期，可能是循環(huán)數(shù)過多（40次）導(dǎo)致的平臺效應(yīng)，實際Ct值可能因熒光累積被誤判；（3）樣本采集或運輸過程中保存不當（如未及時低溫保存），病毒RNA部分降解；（4）引物與N基因靶標序列存在變異（如病毒突變導(dǎo)致引物結(jié)合效率降低）；（5）加樣誤差（如樣本加樣量不足）導(dǎo)致N基因未被擴增。3.樣本2-5報告“陰性”不合理，理由：（1）未設(shè)置內(nèi)參基因，無法排除樣本采集失敗（如采集到無效樣本）或RNA提取失?。ㄈ鏡NA降解）導(dǎo)致的假陰性；（2）新冠病毒檢測指南要求，若內(nèi)參基因無擴增（或Ct值>35），需重新采樣檢測；（3）樣本2-5可能為“無效樣本”（如咽拭子未采集到上皮細胞），而非真正陰性；（4）陰性結(jié)果需結(jié)合內(nèi)參基因判斷，僅目標基因無擴增不能直接判定為陰性。4.改進實