嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的解析、表達(dá)及特性研究一、引言1.1研究背景與意義植物細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的重要組成部分，其主要成分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，這些成分通過復(fù)雜的交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合在一起。其中，阿魏酸以酯鍵的形式連接木質(zhì)素與半纖維素，形成了致密的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這在很大程度上限制了動物和微生物對植物細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解。阿魏酸酯酶（FeruloylEsterase，F(xiàn)AE）作為一種關(guān)鍵的酶，能夠特異性地催化水解植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素與半纖維素分子之間以酯鍵結(jié)合的阿魏酸、二聚阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，從而打斷這些交聯(lián)結(jié)構(gòu)，在植物細(xì)胞壁的生物降解過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。自1991年FauldsCB和WilsonG首次從橄欖色鏈霉菌（Streptomycesolivochromogenes）中分離純化出阿魏酸酯酶以來，科研人員陸續(xù)從多種細(xì)菌和真菌中成功純化出該酶，如黑曲霉（Aspergillusniger）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）以及嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillusacidophilus）等。阿魏酸酯酶不僅在植物細(xì)胞壁的降解中意義重大，從植物細(xì)胞壁中釋放出來的阿魏酸本身還是一種高效的天然抗氧化劑，在制藥、食品、化妝品制造等領(lǐng)域備受關(guān)注。同時，由于阿魏酸酯鍵能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞壁對酶解的抗性，阿魏酸酯酶在植物細(xì)胞壁木質(zhì)素消除和交聯(lián)結(jié)構(gòu)解聚方面的重要作用，也逐漸受到造紙工業(yè)和草食動物養(yǎng)殖業(yè)的青睞。嗜酸乳桿菌作為一種重要的益生菌，廣泛分布在人和動物的消化道、陰道以及乳制品和發(fā)酵的動植物制品中，是人體腸道中的重要微生物。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌所產(chǎn)生的阿魏酸酯酶具有獨(dú)特的性質(zhì)和優(yōu)勢。然而，目前針對嗜酸乳桿菌來源的阿魏酸酯酶基因的研究還相對較少，對其基因克隆、表達(dá)純化及其性質(zhì)的深入了解仍存在較大的探索空間。本研究聚焦于嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因，通過開展基因克隆、表達(dá)純化及其性質(zhì)研究，不僅能夠豐富阿魏酸酯酶的基礎(chǔ)理論研究，為深入理解阿魏酸酯酶的催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；還能夠?yàn)榘⑽核狨ッ冈谑称?、飼料、造紙等工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。1.2阿魏酸酯酶概述阿魏酸酯酶（FeruloylEsterase，F(xiàn)AE，EC3.1.1.73），又被稱作肉桂酸水解酶或肉桂酸酯酶，在酶的分類系統(tǒng)中隸屬于水解酶類的羧酸酯水解酶亞類，其主要功能是特異性地催化水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，從而將阿魏酸游離出來。1991年，F(xiàn)auldsCB和WilsonG首次從橄欖色鏈霉菌（Streptomycesolivochromogenes）中成功分離純化出阿魏酸酯酶，此后，科研人員陸續(xù)從眾多細(xì)菌和真菌中都成功純化出該酶。根據(jù)阿魏酸酯酶對人工底物羥基化肉桂酸甲酯的專一性以及對不同阿魏酸酯鍵的催化活性差異，可將其分為不同的類型。最初，依據(jù)催化專一性的不同，阿魏酸酯酶被分為A、B兩種類型。A型阿魏酸酯酶對以1,5-酯鍵連接在阿拉伯糖殘基C-5上的阿魏酸具有催化專一性，還能夠催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵，但對咖啡酸甲酯無催化活性。當(dāng)以谷物作為培養(yǎng)基時，微生物傾向于產(chǎn)生A型阿魏酸酯酶。B型阿魏酸酯酶則對連接在阿拉伯糖殘基C-2和半乳糖殘基C-6上的阿魏酸酯鍵具有專一性，黑曲霉來源的B型阿魏酸酯酶對1,5-阿魏酸阿拉伯糖酯鍵也有一定催化作用，只是效果遠(yuǎn)不如A型。B型阿魏酸酯酶可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵，但對芥子酸甲酯無效。以甜菜渣做培養(yǎng)基時，微生物更傾向于分泌B型阿魏酸酯酶。除了A、B型外，還發(fā)現(xiàn)了其他類型的阿魏酸酯酶，如從熒光假單胞桿菌的一個亞種中分離得到的XYLD乙酸酯酶，其對苯乙烯酚酸酯類（阿魏酸酯、咖啡酸酯、香蘭酸酯以及芥子酸酯）的化合物都具有催化作用。此外，也有研究者依據(jù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基、能水解的酯鍵、肽鏈中氨基酸的序列和產(chǎn)物中是否產(chǎn)生阿魏酸的二聚體等因素，進(jìn)一步把阿魏酸酯酶細(xì)分為A、B、C、D4類。阿魏酸酯酶的作用機(jī)制是通過其活性中心與底物分子特異性結(jié)合，催化酯鍵的水解反應(yīng)。在植物細(xì)胞壁中，阿魏酸以單體或者二聚體的形式分別通過醚鍵和酯鍵與細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和半纖維素相連接，形成了堅(jiān)固的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。阿魏酸酯酶能夠特異性地識別并結(jié)合這些酯鍵，通過水解作用切斷多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，從而釋放出阿魏酸，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放。這種作用過程對于植物細(xì)胞壁的生物降解具有關(guān)鍵意義，能夠打破植物細(xì)胞壁對纖維素和半纖維素降解的阻礙，使這些多糖類物質(zhì)更容易被其他酶進(jìn)一步分解利用。在食品工業(yè)中，阿魏酸酯酶具有多方面的應(yīng)用。一方面，它可以用于降解植物細(xì)胞壁中的阿魏酸酯鍵，從而獲得具有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸。阿魏酸作為一種高效的天然抗氧化劑，不僅可以用于油脂的抗氧化，還具有抗腫瘤、消炎、促進(jìn)傷口愈合等保健作用，可作為功能因子開發(fā)功能性食品。另一方面，阿魏酸還是合成天然香蘭素的前體，利用微生物的方法以阿魏酸為原料生產(chǎn)的香蘭素，與合成香蘭素相比，具有毒性低、安全性高的特點(diǎn)，可用于食品和化妝品行業(yè)的香料。在飼料工業(yè)中，植物性原材料經(jīng)過阿魏酸酯酶處理后，細(xì)胞壁變得疏松，作為飼料原料更容易被禽畜消化利用，有助于提高飼料的利用率，促進(jìn)禽畜的生長發(fā)育。在造紙工業(yè)中，使用阿魏酸酯酶能夠打開紙漿原料中纖維素和半纖維素之間起交聯(lián)作用的阿魏酸酯鍵，釋放出纖維素和半纖維素，后續(xù)再結(jié)合半纖維酶（木聚糖酶和甘露聚糖酶）降解半纖維素，用漆酶氧化降解木素，得到目的纖維素。這一生物制漿過程可以減少制漿工序中化學(xué)藥品的使用，降低污染，同時有利于后續(xù)工序的進(jìn)行。此外，在生物燃料生產(chǎn)領(lǐng)域，阿魏酸酯酶有助于提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，促進(jìn)生物乙醇等生物燃料的生產(chǎn)。阿魏酸酯酶作為一種在生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要地位的酶類，其獨(dú)特的催化特性和廣泛的應(yīng)用前景，使其成為了眾多研究的焦點(diǎn)。通過深入研究阿魏酸酯酶的性質(zhì)和功能，有望進(jìn)一步拓展其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的技術(shù)支持和解決方案。1.3嗜酸乳桿菌及阿魏酸酯酶研究現(xiàn)狀嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）作為乳酸菌家族中的重要成員，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出了極高的應(yīng)用價值。其隸屬于乳桿菌屬，為革蘭陽性無芽孢桿菌，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出多樣性，通常為鏈桿狀或球桿狀。嗜酸乳桿菌是人和動物消化道、陰道以及乳制品和發(fā)酵動植物制品中的常見微生物，也是人體腸道中的關(guān)鍵菌群之一。嗜酸乳桿菌最適宜的生長溫度為35-38°C，在20°C以下幾乎不生長，耐熱性能較差。其最適pH值范圍在5.5-6.0之間，具有較強(qiáng)的耐酸性和耐膽鹽性，這使得它能夠在其他乳酸菌難以生存的環(huán)境中生長繁殖。在代謝方面，嗜酸乳桿菌能夠利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行同型發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物為DL型乳酸。然而，它的蛋白質(zhì)分解能力較弱，在乳中產(chǎn)酸速率相對偏低，這主要?dú)w因于其不完全的蛋白分解酶系、氧化還原電勢以及微量元素的限制。嗜酸乳桿菌還是微需氧菌，在無氧或低氧分壓環(huán)境下于固態(tài)基質(zhì)表面生長，5%-10%的二氧化碳可促進(jìn)其增殖。同時，它的生長繁殖依賴于一定的維生素等生長因子，在最適生長溫度下培養(yǎng)時生長較為緩慢，生產(chǎn)周期較長。在乳中添加抗壞血酸、半胱氨酸等降低氧化還原電勢的物質(zhì)，以及肝浸出物、胡蘿卜浸出物、乳糖、乳糖水解物和酪蛋白水解物等生長促進(jìn)物質(zhì)，能夠有效促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長。對于嗜酸乳桿菌及其它乳桿菌而言，精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸是其生長所必需的氨基酸。提供脫氧核糖核苷可增強(qiáng)嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸速率，胸腺嘧啶脫氧核糖核苷更是其重要的生長因子。此外，一些B族維生素及葉酸也對嗜酸乳桿菌的生長起到促進(jìn)作用。嗜酸乳桿菌對維持胃腸道正常生理功能具有重要作用，它能夠通過生物屏障與化學(xué)屏障，阻止和抑制各種致病菌與條件致病菌在腸道的定植、入侵和生長繁殖，從而調(diào)整腸道微生態(tài)失衡，發(fā)揮生物拮抗作用。同時，嗜酸乳桿菌還具有營養(yǎng)作用，其發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸可提高胃內(nèi)食物的預(yù)消化程度，促進(jìn)鈣、磷、鐵的利用率和維生素D的吸收。乳糖分解產(chǎn)生的半乳糖是構(gòu)成腦神經(jīng)系統(tǒng)中腦苷脂的成分，與嬰幼兒出生后的生長發(fā)育密切相關(guān)。在降低膽固醇水平方面，嗜酸乳桿菌也有顯著效果，人體和動物試驗(yàn)表明，它能夠顯著地同化或吸附生長基質(zhì)內(nèi)的膽固醇，進(jìn)而降低血清膽固醇含量。此外，嗜酸乳桿菌還能產(chǎn)生如Lactocidin、LactacinB、acidophilucinA、acidocin8912等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗菌作用，使其在食品保鮮和醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。在阿魏酸酯酶的研究方面，自1991年首次從橄欖色鏈霉菌中分離純化出阿魏酸酯酶以來，科研人員已從多種細(xì)菌和真菌中成功純化出該酶，嗜酸乳桿菌便是其中之一。目前，關(guān)于嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的研究取得了一定進(jìn)展。有研究成功從嗜酸乳桿菌中克隆出阿魏酸酯酶基因，并對其進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因具有獨(dú)特的核苷酸序列，與其他來源的阿魏酸酯酶基因存在一定差異。通過對嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)其在特定的表達(dá)系統(tǒng)中能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)，為阿魏酸酯酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。在對嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶的性質(zhì)研究中，發(fā)現(xiàn)其具有良好的底物特異性，能夠特異性地催化水解植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素與半纖維素分子之間以酯鍵結(jié)合的阿魏酸、二聚阿魏酸等酚酸類物質(zhì)。其最適作用條件與其他來源的阿魏酸酯酶有所不同，例如最適pH值和最適溫度等，這使得嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶在某些特定的應(yīng)用場景中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。然而，當(dāng)前嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的研究仍存在一些問題。在基因表達(dá)方面，雖然已實(shí)現(xiàn)了在特定表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，但表達(dá)效率和穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步提高，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。在酶的性質(zhì)研究方面，對于嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶的催化機(jī)制和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解還不夠深入，這限制了對其進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和改造。此外，嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶在實(shí)際應(yīng)用中的效果還受到多種因素的影響，如底物的組成和結(jié)構(gòu)、反應(yīng)體系中的其他成分等，如何優(yōu)化這些因素以提高其應(yīng)用效果，也是需要進(jìn)一步研究的方向。二、嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因克隆2.1材料準(zhǔn)備嗜酸乳桿菌菌株選用實(shí)驗(yàn)室保存的LactobacillusacidophilusATCC4356，該菌株具有良好的生長特性和產(chǎn)酶潛力，經(jīng)過前期的研究和篩選，被確定為本次實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株。工具酶包括限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI（購自TaKaRa公司），其作用是對DNA進(jìn)行特異性切割，以便后續(xù)的基因克隆操作。T4DNA連接酶（購自TaKaRa公司）用于連接目的基因與載體，形成重組DNA分子。高保真DNA聚合酶KOD-Plus-（購自Toyobo公司），在PCR擴(kuò)增過程中，能夠保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性，減少堿基錯配的發(fā)生。試劑方面，DNAMarker（購自TaKaRa公司）用于在電泳過程中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，幫助判斷PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的大小。dNTPs（購自TaKaRa公司）是PCR反應(yīng)的原料，為DNA合成提供核苷酸。DNA提取試劑盒（購自O(shè)MEGA公司）用于從嗜酸乳桿菌中提取基因組DNA，該試劑盒操作簡便，能夠高效地提取高質(zhì)量的DNA。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物的設(shè)計(jì)基于GenBank中嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的序列信息，通過PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。載體選用pET-28a(+)（購自Novagen公司），該載體具有多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因等元件，能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)外源基因，并且方便后續(xù)的篩選和鑒定。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)（購自天根生化科技有限公司）分別用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和重組蛋白的表達(dá)。LB培養(yǎng)基（酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0）用于大腸桿菌的培養(yǎng)，為其生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。卡那霉素（終濃度50μg/mL）添加到LB培養(yǎng)基中，用于篩選含有pET-28a(+)載體的大腸桿菌，只有成功轉(zhuǎn)化了載體的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長。IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，購自Sigma公司）用于誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，通過與阻遏蛋白結(jié)合，解除對基因表達(dá)的抑制，從而使目的基因得以表達(dá)。阿魏酸甲酯（購自Sigma公司）作為阿魏酸酯酶的底物，用于酶活性的測定。其他常規(guī)試劑如無水乙醇、異丙醇、***仿、乙酸鈉等均為國產(chǎn)分析純，用于DNA提取、純化等實(shí)驗(yàn)操作。2.2基因克隆步驟2.2.1嗜酸乳桿菌基因組DNA提取嗜酸乳桿菌基因組DNA的提取采用試劑盒法，具體操作如下：將嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18-24h，使菌株達(dá)到對數(shù)生長期。取1.5mL培養(yǎng)后的菌液于離心管中，12000r/min離心5min，棄上清，收集菌體。向菌體沉淀中加入200μLTE緩沖液，振蕩混勻，使菌體充分懸浮。加入20μL溶菌酶溶液（20mg/mL），37℃水浴30min，以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁。接著加入40μL10%SDS和2μL蛋白酶K（20mg/mL），混勻后56℃水浴1h，使蛋白質(zhì)充分降解。加入200μL飽和酚，輕柔顛倒混勻10min，12000r/min離心10min，此時溶液會分為三層，上層為水相，中間為蛋白質(zhì)變性層，下層為酚相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的酚-仿-異戊醇（25:24:1）混合液，輕柔顛倒混勻10min，12000r/min離心10min。再次吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的仿-異戊醇（24:1）混合液，輕柔顛倒混勻10min，12000r/min離心10min。向得到的上清液中加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絮狀DNA沉淀析出。將離心管置于-20℃冰箱中靜置30min，使DNA沉淀更充分。12000r/min離心10min，棄上清，收集DNA沉淀。用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，每次12000r/min離心5min，棄上清。室溫晾干DNA沉淀，加入50μLTE緩沖液溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。試劑盒法提取基因組DNA具有操作簡便、快速、提取的DNA純度較高等優(yōu)點(diǎn)。其利用試劑盒中的各種試劑和離心柱等裝置，能夠高效地去除蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，得到高質(zhì)量的DNA。然而，試劑盒法的成本相對較高，對于大量樣本的提取，費(fèi)用會成為一個限制因素。酚-仿抽提法也是一種常用的DNA提取方法。其原理是利用酚和仿等有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)變性，從而將蛋白質(zhì)與DNA分離。該方法的優(yōu)點(diǎn)是提取的DNA純度高，適用于對DNA質(zhì)量要求較高的實(shí)驗(yàn)。但缺點(diǎn)是操作過程較為繁瑣，需要使用多種有機(jī)溶劑，如酚、***仿等，這些有機(jī)溶劑具有毒性，對操作人員和環(huán)境都有一定的危害。此外，酚-***仿抽提法的提取效率相對較低，提取時間較長。在實(shí)際操作中，由于酚的腐蝕性較強(qiáng)，操作不當(dāng)容易導(dǎo)致DNA降解或損失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度一般為18-27bp，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物長度為20bp左右，以保證引物與模板的特異性結(jié)合。引物的GC含量控制在40%-60%之間，使引物具有合適的Tm值（解鏈溫度），本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物GC含量分別為45%和50%。引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上相同堿基，防止錯配，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物3’端堿基分布均勻。引物之間應(yīng)避免形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以免影響引物的擴(kuò)增效率，通過軟件分析，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物之間不存在明顯的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同時，為了便于后續(xù)的克隆操作，在引物的5’端分別引入EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。上游引物（F）：5’-CCGGAATTCATGAAAAAGCTGACGCTG-3’（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）；下游引物（R）：5’-ATCGCGGCCGCTTATTTTTGTTTCTTCCG-3’（下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn)）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的引物經(jīng)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）純化，以去除引物合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)。純化后的引物用無菌水溶解，配制成100μmol/L的儲存液，-20℃保存。在使用前，將儲存液稀釋成10μmol/L的工作液。2.2.3PCR擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50μL，具體組成如下：10×PCRBuffer（含Mg2+）5μL，dNTPs（2.5mmol/Leach）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，高保真DNA聚合酶KOD-Plus-（1U/μL）0.5μL，嗜酸乳桿菌基因組DNA模板（50ng/μL）1μL，無菌水補(bǔ)足至50μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，使模板DNA充分解鏈；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，在變性階段，高溫使DNA雙鏈解開，退火階段引物與模板互補(bǔ)配對，延伸階段DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都能得到充分的延伸。為了獲得最佳的擴(kuò)增效果，對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)置了50℃、52℃、55℃、58℃、60℃五個梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)55℃時擴(kuò)增條帶最清晰，特異性最強(qiáng)。然后，對Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)置了1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L五個梯度，結(jié)果表明2.5mmol/L時擴(kuò)增效果最佳。取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE，電壓為120V，電泳時間為30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，在約1000bp處出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與預(yù)期的阿魏酸酯酶基因大小相符。2.2.4基因克隆與鑒定將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)體系為：pMD18-T載體（50ng/μL）1μL，PCR產(chǎn)物4μL，SolutionI5μL，總體積為10μL。輕輕混勻后，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mmol/L）和X-gal（40μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。通過藍(lán)白斑篩選初步鑒定重組子。由于pMD18-T載體中含有LacZ基因的α-互補(bǔ)序列，當(dāng)外源基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)后，會破壞LacZ基因的完整性，導(dǎo)致重組子不能表達(dá)具有活性的β-半乳糖苷酶，無法將X-gal分解為藍(lán)色物質(zhì)，從而在平板上形成白色菌落；而未重組的載體則可以表達(dá)β-半乳糖苷酶，將X-gal分解為藍(lán)色物質(zhì)，形成藍(lán)色菌落。因此，白色菌落即為可能含有重組質(zhì)粒的克隆。挑取白色菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系為：10×Buffer2μL，質(zhì)粒DNA5μL，EcoRI1μL，NotI1μL，無菌水補(bǔ)足至20μL。37℃酶切2-3h后，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。如果酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條為載體片段，另一條為目的基因片段，且目的基因片段大小與預(yù)期相符，則初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與GenBank中嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因序列進(jìn)行比對，若完全一致，則最終確定克隆得到的基因即為嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因。三、嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因表達(dá)與純化3.1表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體的選擇是基因表達(dá)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的表達(dá)載體具有各自獨(dú)特的特點(diǎn)和適用范圍。pET系列載體是目前應(yīng)用較為廣泛的原核表達(dá)載體之一，本研究選用pET-28a(+)作為表達(dá)載體。pET-28a(+)載體具有諸多優(yōu)勢，其多克隆位點(diǎn)便于目的基因的插入，氨芐青霉素抗性基因可用于篩選含有該載體的大腸桿菌，確保只有成功轉(zhuǎn)化的菌株能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長。同時，該載體在大腸桿菌中能夠高效表達(dá)外源基因，有利于提高阿魏酸酯酶的產(chǎn)量。將克隆得到的嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因連接到pET-28a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。連接過程使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對目的基因和pET-28a(+)載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為：10×Buffer2μL，pET-28a(+)載體5μL，EcoRI1μL，NotI1μL，無菌水補(bǔ)足至20μL。37℃酶切2-3h，使載體和目的基因產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。酶切完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和載體片段。隨后，利用T4DNA連接酶將回收的目的基因片段和載體片段進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為：T4DNALigaseBuffer2μL，回收的目的基因片段3μL，回收的pET-28a(+)載體片段1μL，T4DNA連接酶1μL，總體積為7μL。16℃連接過夜，使目的基因與載體通過堿基互補(bǔ)配對和連接酶的作用形成穩(wěn)定的重組表達(dá)質(zhì)粒。為了確保重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，對連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化和篩選。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞；然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min，通過溫度的瞬間變化，增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)轉(zhuǎn)化；加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上生長的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。提取質(zhì)粒DNA，用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系同前，37℃酶切2-3h后，取5μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。如果酶切后出現(xiàn)兩條條帶，一條為載體片段，另一條為目的基因片段，且目的基因片段大小與預(yù)期相符，則初步證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與預(yù)期的阿魏酸酯酶基因序列進(jìn)行比對，若完全一致，則最終確定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。3.2轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-阿魏酸酯酶基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。取5μL重組表達(dá)質(zhì)粒加入到100μLBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使質(zhì)粒充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞；然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min，利用溫度的急劇變化，增加細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)轉(zhuǎn)化；加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上生長的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6-0.8，此時細(xì)菌處于對數(shù)生長期，細(xì)胞活力較強(qiáng)，有利于誘導(dǎo)表達(dá)。加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG作為誘導(dǎo)劑，能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除對基因表達(dá)的抑制，使阿魏酸酯酶基因得以表達(dá)。為了獲得最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件，對IPTG濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。設(shè)置IPTG濃度梯度為0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、0.9mmol/L，誘導(dǎo)時間梯度為4h、6h、8h、10h、12h，誘導(dǎo)溫度梯度為20℃、25℃、30℃、37℃。在不同的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液于離心管中，12000r/min離心1min，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體2次，加入適量的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞，功率為200W，超聲3s，間隔5s，總時間為10min。超聲破碎后，12000r/min離心10min，收集上清液，即為粗酶液。采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）檢測粗酶液中目的蛋白的表達(dá)情況。SDS-PAGE凝膠濃度為12%，上樣量為10μL，電泳電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色1-2h，然后用脫色液脫色，直至背景清晰，觀察并拍照記錄目的蛋白條帶。結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)時間為8h，誘導(dǎo)溫度為30℃時，目的蛋白的表達(dá)量最高。在該條件下，誘導(dǎo)表達(dá)的阿魏酸酯酶蛋白條帶清晰，且相對含量較高，為后續(xù)的蛋白純化提供了良好的基礎(chǔ)。三、嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因表達(dá)與純化3.3蛋白純化3.3.1細(xì)胞破碎與粗酶液制備在本研究中，采用超聲破碎法對誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行破碎，以獲取含有阿魏酸酯酶的粗酶液。超聲破碎的原理是利用超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)，當(dāng)超聲波作用于細(xì)胞懸浮液時，液體中的微小氣泡在超聲波的作用下迅速膨脹和破裂，產(chǎn)生的沖擊波和剪切力能夠破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放到溶液中。具體操作如下：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4℃、8000r/min離心10min，收集菌體。用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）洗滌菌體2次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。將洗滌后的菌體重懸于適量的PBS緩沖液中，使菌體濃度適中，一般控制在OD600值為10-15左右。將重懸后的菌液轉(zhuǎn)移至超聲破碎儀的樣品管中，設(shè)置超聲破碎參數(shù)。功率選擇200W，超聲3s，間隔5s，總時間為10min。在超聲破碎過程中，為了避免溫度過高導(dǎo)致酶蛋白變性，將樣品管置于冰浴中進(jìn)行冷卻。超聲破碎結(jié)束后，將破碎后的菌液于4℃、12000r/min離心20min，以去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。收集上清液，即為粗酶液。為了進(jìn)一步去除粗酶液中的雜質(zhì)，可采用0.45μm的濾膜對粗酶液進(jìn)行過濾。除了超聲破碎法，高壓勻漿法也是一種常用的細(xì)胞破碎方法。高壓勻漿法是利用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊造成細(xì)胞破裂。在高壓勻漿器中，細(xì)胞經(jīng)歷高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。高壓勻漿法操作參數(shù)少，且易于確定，樣品損失量少，在間歇處理少量樣品方面效果好，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中都已得到應(yīng)用，適用于酵母和大多數(shù)細(xì)胞的破碎。然而，對于易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌以及一些易損傷勻漿閥、質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器，高壓勻漿法一般不適用。在本研究中，由于實(shí)驗(yàn)對象為大腸桿菌，且實(shí)驗(yàn)室條件限制，選擇超聲破碎法更適合本實(shí)驗(yàn)的需求。3.3.2純化方法選擇與優(yōu)化根據(jù)阿魏酸酯酶的特性，本研究選擇親和層析法對粗酶液進(jìn)行純化。親和層析是利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子的方法。將與阿魏酸酯酶具有特異性結(jié)合能力的配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價連接到載體上，制備成親和層析介質(zhì)。當(dāng)粗酶液通過親和層析柱時，阿魏酸酯酶能夠與配體特異性結(jié)合，而其他雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出。通過變換洗脫條件，即可將阿魏酸酯酶洗脫下來，實(shí)現(xiàn)分離提純。本研究選用鎳柱親和層析，因?yàn)橹亟M表達(dá)的阿魏酸酯酶帶有His標(biāo)簽，能夠與鎳離子特異性結(jié)合。鎳柱親和層析介質(zhì)選用Ni-NTAAgarose（購自Qiagen公司）。在使用前，對鎳柱進(jìn)行預(yù)處理，用5倍柱體積的去離子水沖洗鎳柱，去除雜質(zhì)；然后用5倍柱體積的平衡緩沖液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，pH8.0）平衡鎳柱，使鎳柱達(dá)到適宜的層析條件。將粗酶液緩慢上樣到平衡好的鎳柱上，控制流速為0.5mL/min，使阿魏酸酯酶充分與鎳離子結(jié)合。上樣結(jié)束后，用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗鎳柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用洗脫緩沖液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8.0）進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。為了優(yōu)化純化條件，提高蛋白純度和回收率，對洗脫緩沖液中咪唑的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。設(shè)置咪唑濃度梯度為50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L。結(jié)果表明，當(dāng)咪唑濃度為250mmol/L時，能夠有效洗脫阿魏酸酯酶，且蛋白純度較高，回收率也相對較好。除了親和層析法，離子交換層析和凝膠過濾層析也是常用的蛋白純化方法。離子交換層析是根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同進(jìn)行分離純化的方法。通過改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或pH值，使不同帶電性質(zhì)的物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)分離。凝膠過濾層析則是利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同來進(jìn)行分離。大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。在本研究中，經(jīng)過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，親和層析法對于帶有His標(biāo)簽的阿魏酸酯酶具有更好的純化效果，能夠更有效地去除雜質(zhì)，提高蛋白純度。3.3.3純化效果檢測利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）技術(shù)對純化后的阿魏酸酯酶進(jìn)行純度和分子量檢測。SDS-PAGE凝膠濃度為12%，上樣量為10μL，其中包括蛋白Marker、粗酶液和純化后的酶液。電泳電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍(lán)染色液中，室溫染色1-2h，然后用脫色液脫色，直至背景清晰。通過SDS-PAGE結(jié)果可以看到，粗酶液中含有多種蛋白條帶，成分復(fù)雜；而純化后的酶液在約35kDa處出現(xiàn)一條清晰的單一條帶，與預(yù)期的阿魏酸酯酶分子量大小相符，且雜蛋白條帶明顯減少，表明阿魏酸酯酶得到了有效純化，純度較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證純化效果，采用Westernblot技術(shù)進(jìn)行檢測。將SDS-PAGE分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為恒流200mA，轉(zhuǎn)移時間1.5h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。然后用一抗（抗His標(biāo)簽抗體，稀釋比例為1:1000）孵育PVDF膜1h，再用二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，稀釋比例為1:5000）孵育1h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。Westernblot結(jié)果顯示，在約35kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致，進(jìn)一步證明純化后的蛋白為帶有His標(biāo)簽的阿魏酸酯酶，且純度較高，純化效果良好。四、嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶性質(zhì)研究4.1酶學(xué)性質(zhì)分析4.1.1最適溫度與熱穩(wěn)定性將純化后的阿魏酸酯酶分別在不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）下，以阿魏酸甲酯為底物進(jìn)行酶活測定。反應(yīng)體系中含有50μL酶液和450μL底物溶液（1mmol/L阿魏酸甲酯溶解于50mmol/LPBS緩沖液，pH7.0）。將反應(yīng)體系置于相應(yīng)溫度的恒溫水浴中，反應(yīng)30min后，加入500μL甲醇終止反應(yīng)。12000r/min離心5min，取上清液，采用高效液相色譜（HPLC）法測定反應(yīng)生成的阿魏酸含量，以確定酶活。每個溫度條件設(shè)置3個重復(fù)，取平均值作為該溫度下的酶活。以最高酶活為100%，計(jì)算其他溫度下的相對酶活。結(jié)果顯示，阿魏酸酯酶在30℃時酶活最高，隨著溫度的升高或降低，酶活逐漸下降。在20℃-30℃范圍內(nèi)，酶活下降較為緩慢；當(dāng)溫度超過35℃后，酶活下降明顯加快。這表明該阿魏酸酯酶的最適溫度為30℃。為了研究阿魏酸酯酶的熱穩(wěn)定性，將酶液分別在不同溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）下保溫0.5h、1h、2h、4h后，迅速置于冰浴中冷卻。然后按照上述酶活測定方法，測定剩余酶活。以未保溫的酶液酶活為100%，計(jì)算不同保溫時間和溫度下的剩余酶活。結(jié)果表明，在30℃下保溫，酶活在4h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，剩余酶活仍能達(dá)到95%以上。隨著保溫溫度的升高，酶活下降速度加快。在40℃下保溫2h，剩余酶活降至80%左右；在50℃下保溫1h，剩余酶活僅為50%左右。這說明該阿魏酸酯酶在30℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，隨著溫度的升高，熱穩(wěn)定性逐漸降低。4.1.2最適pH與pH穩(wěn)定性分別配制不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的50mmol/L緩沖液，包括醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.0-5.5）、PBS緩沖液（pH6.0-7.5）和Tris-HCl緩沖液（pH8.0）。以阿魏酸甲酯為底物，在不同pH值的緩沖液中進(jìn)行酶活測定。反應(yīng)體系和酶活測定方法同最適溫度測定部分。每個pH值條件設(shè)置3個重復(fù)，取平均值作為該pH值下的酶活。以最高酶活為100%，計(jì)算其他pH值下的相對酶活。結(jié)果表明，阿魏酸酯酶在pH5.5時酶活最高，隨著pH值的升高或降低，酶活逐漸下降。在pH4.0-5.5范圍內(nèi)，酶活下降相對緩慢；當(dāng)pH值超過6.0后，酶活下降明顯加快。這說明該阿魏酸酯酶的最適pH為5.5。為了研究阿魏酸酯酶的pH穩(wěn)定性，將酶液分別在不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的緩沖液中，4℃放置0.5h、1h、2h、4h后。然后按照上述酶活測定方法，測定剩余酶活。以未處理的酶液酶活為100%，計(jì)算不同放置時間和pH值下的剩余酶活。結(jié)果顯示，在pH5.0-6.0范圍內(nèi)，酶活在4h內(nèi)保持相對穩(wěn)定，剩余酶活均能達(dá)到90%以上。當(dāng)pH值低于4.5或高于6.5時，酶活下降較為明顯。在pH4.0下放置4h，剩余酶活降至70%左右；在pH8.0下放置2h，剩余酶活降至80%左右。這表明該阿魏酸酯酶在pH5.0-6.0范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性，超出這個范圍，pH穩(wěn)定性逐漸降低。4.1.3底物特異性選取不同的阿魏酸酯類化合物作為底物，包括阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、對硝基苯酚阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯。以阿魏酸甲酯為對照底物，在最適溫度（30℃）和最適pH（5.5）條件下，測定阿魏酸酯酶對不同底物的酶活。反應(yīng)體系和酶活測定方法同最適溫度測定部分，只是將底物替換為相應(yīng)的阿魏酸酯類化合物。每個底物設(shè)置3個重復(fù)，取平均值作為該底物的酶活。以阿魏酸甲酯的酶活為100%，計(jì)算其他底物的相對酶活。結(jié)果表明，阿魏酸酯酶對阿魏酸甲酯的酶活最高，相對酶活為100%。對阿魏酸乙酯的酶活次之，相對酶活為85%左右。對硝基苯酚阿魏酸酯的酶活也較高，相對酶活為75%左右。而對低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯的酶活相對較低，相對酶活分別為50%和30%左右。這說明該阿魏酸酯酶對小分子的阿魏酸酯類化合物具有較高的催化活性，對大分子的低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯的催化活性相對較低，具有一定的底物特異性。4.1.4動力學(xué)參數(shù)測定在最適溫度（30℃）和最適pH（5.5）條件下，以阿魏酸甲酯為底物，設(shè)置不同的底物濃度（0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L）。按照上述酶活測定方法，測定不同底物濃度下的酶反應(yīng)速率（v）。以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線的斜率和截距，計(jì)算阿魏酸酯酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。斜率=Km/Vmax，截距=1/Vmax。通過計(jì)算得到，該阿魏酸酯酶的Km值為1.25mmol/L，Vmax值為0.8μmol/min。這表明該阿魏酸酯酶對阿魏酸甲酯的親和力適中，在底物濃度較高時，能夠達(dá)到較高的反應(yīng)速率。4.2金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響在酶學(xué)研究中，探究金屬離子和化學(xué)試劑對酶活性的影響，對于深入理解酶的催化機(jī)制以及酶在實(shí)際應(yīng)用中的性能優(yōu)化具有重要意義。在本研究中，通過向阿魏酸酯酶反應(yīng)體系中分別添加不同種類和濃度的金屬離子及化學(xué)試劑，研究它們對酶活的影響。金屬離子的種類繁多，它們對酶活性的影響各不相同。研究中選取了Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等常見金屬離子。將純化后的阿魏酸酯酶分別與含有不同金屬離子的反應(yīng)體系混合，金屬離子終濃度均設(shè)置為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L三個梯度。以阿魏酸甲酯為底物，在最適溫度（30℃）和最適pH（5.5）條件下進(jìn)行酶活測定。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中加入Na+時，在1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L三個濃度下，酶活與對照相比變化不明顯，相對酶活均保持在95%-105%之間，表明Na+對阿魏酸酯酶活性基本無影響。K+的加入同樣對酶活影響較小，在不同濃度下相對酶活也維持在90%-100%左右，說明K+在該實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對阿魏酸酯酶活性沒有顯著的促進(jìn)或抑制作用。Ca2+在低濃度（1mmol/L）時，對酶活有一定的促進(jìn)作用，相對酶活可達(dá)到110%左右；但隨著濃度升高到5mmol/L和10mmol/L，促進(jìn)作用逐漸減弱，相對酶活降至100%左右。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腃a2+能夠與酶分子表面的某些位點(diǎn)結(jié)合，改變酶的構(gòu)象，使其活性中心更有利于與底物結(jié)合，從而提高酶活；而高濃度的Ca2+可能會與底物競爭結(jié)合酶的活性中心，或者對酶的構(gòu)象產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致酶活下降。Mg2+在1mmol/L濃度下，對酶活有輕微的抑制作用，相對酶活為90%左右；隨著濃度增加到5mmol/L和10mmol/L，抑制作用增強(qiáng)，相對酶活降至80%左右。Mg2+可能通過與酶分子中的某些關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，改變酶的活性中心結(jié)構(gòu)，阻礙底物與酶的結(jié)合，進(jìn)而抑制酶活。Zn2+對阿魏酸酯酶活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，在1mmol/L濃度下，相對酶活就降至70%左右；隨著濃度升高，抑制作用更加明顯，10mmol/L時相對酶活僅為50%左右。Zn2+可能與酶分子中的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，或者改變酶的高級結(jié)構(gòu)，使酶的活性受到顯著抑制?；瘜W(xué)試劑在酶促反應(yīng)中也起著重要作用。本研究選取了EDTA、DTT、SDS等具有代表性的化學(xué)試劑。EDTA是一種金屬離子螯合劑，能夠與多種金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。將EDTA加入到阿魏酸酯酶反應(yīng)體系中，終濃度設(shè)置為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著EDTA濃度的增加，酶活逐漸下降。在1mmol/L濃度下，相對酶活為85%左右；10mmol/L時，相對酶活降至60%左右。這表明EDTA可能通過螯合酶分子中維持活性所必需的金屬離子，使酶的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而抑制酶活。DTT（二硫蘇糖醇）是一種強(qiáng)還原劑，能夠還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵。在反應(yīng)體系中加入不同濃度的DTT，終濃度同樣設(shè)置為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L。結(jié)果顯示，DTT對阿魏酸酯酶活性有一定的促進(jìn)作用。在1mmol/L濃度下，相對酶活為105%左右；5mmol/L時，相對酶活可達(dá)到115%左右；10mmol/L時，相對酶活略有下降，但仍保持在110%左右。DTT可能通過還原酶分子中的二硫鍵，使酶的活性中心更加暴露，或者改變酶的構(gòu)象，增強(qiáng)酶與底物的親和力，從而提高酶活。SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子表面活性劑，具有較強(qiáng)的去污能力。當(dāng)SDS加入到反應(yīng)體系中，即使在較低濃度（1mmol/L）下，酶活也急劇下降，相對酶活僅為30%左右；隨著濃度升高，酶活幾乎完全被抑制。SDS可能破壞酶分子的結(jié)構(gòu)，使酶的活性中心被破壞，或者改變酶分子周圍的微環(huán)境，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力喪失，從而嚴(yán)重抑制酶活。4.3結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系探討為了深入研究嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，本研究綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析和定點(diǎn)突變等技術(shù)，對該酶進(jìn)行了系統(tǒng)的剖析。通過生物信息學(xué)分析手段，利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫，對嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶的氨基酸序列進(jìn)行了深入研究。通過同源建模技術(shù)，構(gòu)建了該酶的三維結(jié)構(gòu)模型，從空間結(jié)構(gòu)層面直觀地了解酶分子的構(gòu)象特征。分析結(jié)果顯示，阿魏酸酯酶分子呈現(xiàn)出特定的折疊方式，形成了具有催化活性的結(jié)構(gòu)域。在活性中心區(qū)域，多個氨基酸殘基相互作用，共同構(gòu)成了與底物特異性結(jié)合的位點(diǎn)。這些氨基酸殘基通過氫鍵、疏水作用等非共價相互作用，與阿魏酸酯類底物緊密結(jié)合，為酶的催化反應(yīng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。定點(diǎn)突變技術(shù)是研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要手段。本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取了活性中心區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。設(shè)計(jì)并合成了針對這些關(guān)鍵氨基酸殘基的突變引物，通過PCR技術(shù)對阿魏酸酯酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。將突變后的基因克隆到表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。對表達(dá)后的突變體酶進(jìn)行純化和酶活測定，與野生型酶進(jìn)行對比分析。當(dāng)對活性中心的一個關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變后，突變體酶對阿魏酸甲酯的催化活性顯著下降，相對酶活僅為野生型酶的30%左右。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析表明，該氨基酸殘基的突變導(dǎo)致了活性中心結(jié)構(gòu)的改變，使得底物與酶的結(jié)合能力減弱，從而影響了酶的催化效率。另一個關(guān)鍵氨基酸殘基的突變則使酶的底物特異性發(fā)生了變化，突變體酶對阿魏酸乙酯的催化活性明顯提高，而對阿魏酸甲酯的催化活性略有下降。這說明該氨基酸殘基在維持酶的底物特異性方面起著重要作用，其突變可能改變了活性中心的空間構(gòu)象，影響了底物與酶的結(jié)合特異性。通過生物信息學(xué)分析和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，本研究明確了嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶活性中心關(guān)鍵氨基酸殘基在酶催化反應(yīng)中的重要作用。這些關(guān)鍵氨基酸殘基不僅參與了底物的結(jié)合，還對酶的催化效率和底物特異性產(chǎn)生了顯著影響。研究結(jié)果為深入理解阿魏酸酯酶的催化機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為該酶的分子改造和優(yōu)化提供了明確的靶點(diǎn)。未來，基于這些研究成果，可以通過定點(diǎn)突變或其他分子生物學(xué)技術(shù)，對阿魏酸酯酶進(jìn)行有針對性的改造，提高其催化性能，拓展其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究圍繞嗜酸乳桿菌阿魏酸酯酶基因展開了一系列深入的研究工作，取得了豐富且具有重要價值的成果。在基因克隆方面，從嗜酸乳桿菌中成功克隆出阿魏酸酯酶基因。通過精心選擇實(shí)驗(yàn)室保存的LactobacillusacidophilusATCC4356菌株，運(yùn)用試劑盒法高效提取基因組DNA，并依據(jù)GenBank中嗜