囊泡病毒HvAV-3hiap-like基因功能的深度剖析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景囊泡病毒（Ascovirus）是一類(lèi)大型環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其病毒粒子大小約為130nm×400nm，呈香腸形或桿狀，擁有內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)。該病毒于1976年首次從甜菜藜夜蛾幼蟲(chóng)中分離得到，并在1983年被正式命名。囊泡病毒主要感染鱗翅目幼蟲(chóng)，在自然環(huán)境中，其口服感染效率較低，主要依靠繭蜂科、姬蜂科等寄生蜂的攜帶，通過(guò)寄生蜂的產(chǎn)卵行為在草地貪夜蛾、甜菜夜蛾、煙芽夜蛾、棉鈴蟲(chóng)、粉紋夜蛾等幼蟲(chóng)個(gè)體間傳播。被感染的幼蟲(chóng)通常會(huì)出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、生長(zhǎng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)的癥狀，在感染后期，包含病毒粒子的囊泡釋放到血淋巴中，會(huì)使幼蟲(chóng)血淋巴由無(wú)色清亮透明變?yōu)槟贪咨珳啙釥?，這也是囊泡病毒感染的典型癥狀。在細(xì)胞水平上，囊泡病毒的致病過(guò)程一直以來(lái)都被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡類(lèi)似，病毒利用宿主細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的凋亡小體包裹形成自身成熟的囊泡，這也是其被稱(chēng)為“囊泡病毒”的原因，且被視為一類(lèi)利用宿主細(xì)胞凋亡的“反常”DNA病毒。然而，隨著研究的深入，這一假說(shuō)的不合理性逐漸顯現(xiàn)，不僅缺乏典型的圖片證據(jù)，而且與實(shí)際觀察到的一些現(xiàn)象不符。如湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治與綜合防控研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)我國(guó)分離的本土囊泡病毒毒株——煙芽夜蛾囊泡病毒3h株（HvAV-3h）的研究發(fā)現(xiàn)，在宿主幼蟲(chóng)體內(nèi)的活體感染過(guò)程中并未呈現(xiàn)典型的凋亡特征。對(duì)感染后不同時(shí)期宿主幼蟲(chóng)的血細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，脂血細(xì)胞的感染特征更符合細(xì)胞壞死或細(xì)胞焦亡，幾乎不具備細(xì)胞凋亡的特征。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，在多細(xì)胞生物的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及對(duì)病原體的防御等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，凋亡通常是宿主細(xì)胞的一種防御機(jī)制，旨在通過(guò)自我毀滅來(lái)阻止病毒的復(fù)制和傳播。而病毒為了自身的生存和繁衍，往往會(huì)編碼一些蛋白來(lái)對(duì)抗宿主細(xì)胞的凋亡，從而確保自身能夠完成復(fù)制周期。凋亡抑制因子（InhibitorofApoptosisProteins,IAPs）是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡因子家族，在病毒與宿主細(xì)胞的博弈中扮演著重要角色。IAPs主要通過(guò)抑制Caspase活性和參與調(diào)節(jié)核因子NF-κB的作用來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。自1995年首次從脊髓性肌萎縮癥的研究中發(fā)現(xiàn)IAP蛋白——神經(jīng)元性凋亡抑制蛋白（NeuronalApoptosisInhibitorProtein,NAIP）以來(lái)，多種IAP蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞凋亡抑制蛋白（CellularIAP,c-IAP1和c-IAP2）、X染色體連鎖凋亡抑制因子（XIAP）、Survivin、黑色素瘤凋亡抑制蛋白（Melanoma-IAP,ML-IAP/Livin）、睪丸特異凋亡抑制蛋白（hILP）以及含泛素連接酶的桿狀病毒IAP重復(fù)序列等，目前已知人類(lèi)IAPs家族蛋白成員有8種。IAP家族結(jié)構(gòu)具有共同特點(diǎn)，其N(xiāo)端含有1個(gè)或3個(gè)包含70個(gè)氨基酸的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat,BIR），C端包含或不包含1個(gè)指環(huán)（RingFinger）結(jié)構(gòu)。IAP廣泛存在于病毒、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中，其編碼蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡具有較強(qiáng)的抑制作用。在病毒感染過(guò)程中，病毒編碼的IAP蛋白可以通過(guò)與宿主細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白相互作用，干擾凋亡信號(hào)通路的正常傳遞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的抑制。如桿狀病毒編碼的IAP蛋白能夠直接與Caspase的IBM結(jié)合，抑制Caspase3/7/9的催化活性，阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在囊泡病毒研究領(lǐng)域，雖然目前對(duì)于其整體的感染機(jī)制和致病過(guò)程有了一定的了解，但對(duì)于囊泡病毒編碼的iap-like基因的功能研究還相對(duì)較少。iap-like基因作為可能編碼具有抑制細(xì)胞凋亡功能蛋白的基因，深入探究其功能對(duì)于全面揭示囊泡病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制至關(guān)重要。通過(guò)研究iap-like基因，我們可以了解囊泡病毒是如何在宿主細(xì)胞內(nèi)逃避凋亡監(jiān)控，完成自身的復(fù)制和傳播，這不僅有助于豐富我們對(duì)病毒與宿主相互關(guān)系的理論認(rèn)識(shí)，還可能為開(kāi)發(fā)基于干擾病毒抗凋亡機(jī)制的新型生物防治策略提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防控具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。1.2囊泡病毒概述1.2.1定義與特征囊泡病毒是雙鏈DNA病毒中的一科，又稱(chēng)包囊病毒科，拉丁文名稱(chēng)為Ascoviridae。“Asco”源自拉丁文，意為“出泡”，形象地描述了該科病毒感染宿主細(xì)胞后獨(dú)特的病理學(xué)特征。其病毒粒子有囊膜包被，直徑約為130納米，長(zhǎng)度在200-400納米之間，呈香腸形或桿狀，擁有內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使其在病毒分類(lèi)中獨(dú)具特色。囊泡病毒的基因組為環(huán)狀雙鏈DNA（dsDNA），大小處于100-200千堿基對(duì)的范圍。作為昆蟲(chóng)專(zhuān)性寄生、慢性致死性病毒，囊泡病毒于1976年首次從甜菜藜夜蛾幼蟲(chóng)中被分離出來(lái)，并在1983年被正式命名。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)2015年分類(lèi)報(bào)告，囊泡病毒科包含2屬。其中囊泡病毒屬由分離自鱗翅目夜蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)體內(nèi)的草地貪夜蛾囊泡病毒、粉紋夜蛾囊泡病毒和煙芽夜蛾囊泡病毒3個(gè)種共14個(gè)毒株組成；圖爾病毒屬屬下僅報(bào)道1種，即美雙緣姬蜂囊泡病毒，僅有一個(gè)分離自法國(guó)圖爾產(chǎn)美雙緣姬蜂體內(nèi)的毒株記錄。在自然環(huán)境中，囊泡病毒口服感染效率極低。其主要依賴(lài)?yán)O蜂科、姬蜂科等科的寄生蜂攜帶，通過(guò)寄生蜂的產(chǎn)卵行為在草地貪夜蛾、甜菜夜蛾、煙芽夜蛾、棉鈴蟲(chóng)、粉紋夜蛾、蔥鄰菜蛾等幼蟲(chóng)個(gè)體間傳播。被感染的幼蟲(chóng)通常會(huì)出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、生長(zhǎng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)的癥狀。在感染后期，包含病毒粒子的囊泡釋放到血淋巴中，會(huì)使幼蟲(chóng)血淋巴由無(wú)色清亮透明變?yōu)槟贪咨珳啙釥睿@一特征成為囊泡病毒感染的典型癥狀，便于在研究和實(shí)際監(jiān)測(cè)中進(jìn)行識(shí)別和判斷。1.2.2HvAV-3h株特點(diǎn)煙芽夜蛾囊泡病毒3h株（HvAV-3h）是我國(guó)分離的本土囊泡病毒毒株，具有一系列獨(dú)特的性質(zhì)。在宿主范圍方面，甜菜夜蛾是HvAV-3h的天然分離宿主，感染后的甜菜夜蛾試蟲(chóng)整個(gè)幼蟲(chóng)期能被延長(zhǎng)至15天左右，大約是健康幼蟲(chóng)的3-4倍；棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)在感染HvAV-3h后，幼蟲(chóng)期可被延長(zhǎng)至35天左右，約為健康幼蟲(chóng)的6-8倍。這種對(duì)不同宿主幼蟲(chóng)期的顯著影響，不僅體現(xiàn)了HvAV-3h對(duì)宿主生長(zhǎng)發(fā)育的干擾作用，也暗示了其在不同宿主環(huán)境下的適應(yīng)性和感染機(jī)制的差異。從感染特性來(lái)看，HvAV-3h進(jìn)入宿主幼蟲(chóng)的血腔后，會(huì)利用漿血細(xì)胞或脂血細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)。脂血細(xì)胞在感染后，會(huì)啟動(dòng)類(lèi)似細(xì)胞焦亡或細(xì)胞壞死的調(diào)控性細(xì)胞死亡（RCD），快速將未包裝成大囊泡的含有病毒粒子的小液滴釋放到血腔中，開(kāi)啟囊泡病毒的初步快速擴(kuò)繁。這些被釋放到血腔中的囊泡病毒小液滴在血腔中循環(huán)并進(jìn)入更多的血細(xì)胞或脂肪體組織，開(kāi)啟常規(guī)的感染模式——抑制宿主細(xì)胞RCD的大囊泡產(chǎn)生模式。如此循環(huán)往復(fù)，直到宿主幼蟲(chóng)的血腔被大量的含有囊泡的血細(xì)胞、來(lái)源于珠血細(xì)胞的含有囊泡的包涵體碎片、以及不成熟的初級(jí)囊泡等結(jié)構(gòu)填滿。在對(duì)宿主幼蟲(chóng)脂肪體組織的感染過(guò)程中，HvAV-3h表現(xiàn)出明顯的階段性特征。感染后24小時(shí)，幾乎不可見(jiàn)病毒粒子，但脂肪體內(nèi)原本完整的大脂滴被分割成無(wú)數(shù)個(gè)小脂滴，原本集中分布在細(xì)胞膜附近的“致密物質(zhì)”在感染后幾乎被均勻地分布到了整個(gè)細(xì)胞中。隨后，在脂滴附近逐漸檢測(cè)到病毒粒子，且隨著時(shí)間推移，脂滴內(nèi)的病毒粒子越來(lái)越多，小脂滴又逐漸融合成含有多個(gè)病毒粒子的大脂滴。在感染后96小時(shí)，甜菜夜蛾的脂肪體細(xì)胞依舊具有完整的細(xì)胞核，但細(xì)胞質(zhì)中形成了明顯的空腔；而此時(shí)棉鈴蟲(chóng)的脂肪體細(xì)胞相對(duì)完整，但可看見(jiàn)明顯的在細(xì)胞質(zhì)中形成的與整個(gè)細(xì)胞質(zhì)有明顯間隙的“單元小區(qū)”，每個(gè)“小區(qū)”中都包含著融合后含有病毒粒子的脂滴。這種在不同宿主脂肪體組織中的感染特征差異，進(jìn)一步表明了HvAV-3h與宿主相互作用的復(fù)雜性和多樣性。1.3iap-like基因相關(guān)理論1.3.1IAP基因家族概述凋亡抑制因子（InhibitorofApoptosisProteins,IAPs）基因家族是一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡因子家族，在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自1995年首次從脊髓性肌萎縮癥的研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元性凋亡抑制蛋白（NeuronalApoptosisInhibitorProtein,NAIP）以來(lái)，該家族不斷被深入研究，目前已知人類(lèi)IAPs家族蛋白成員有8種。IAP基因家族成員的結(jié)構(gòu)具有顯著的共同特征，其N(xiāo)端含有1個(gè)或3個(gè)包含70個(gè)氨基酸的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat,BIR），這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗AP蛋白與其他凋亡相關(guān)蛋白的相互作用至關(guān)重要。例如，XIAP通過(guò)其BIR結(jié)構(gòu)域直接與Caspase的IBM結(jié)合，從而抑制Caspase3/7/9的催化活性，阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程。部分IAP蛋白的C端還包含一個(gè)指環(huán)（RingFinger）結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)賦予了這些IAP蛋白E3泛素連接酶活性，使得它們能夠介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素化和降解，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程。如c-IAP1就依賴(lài)其E3泛素連接酶活性，經(jīng)泛素介導(dǎo)Caspase-3/7蛋白酶體降解，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能。在功能方面，IAPs主要通過(guò)兩條途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。一方面，IAPs可以直接抑制Caspase的活性。Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，IAPs通過(guò)其BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase結(jié)合，阻止Caspase的激活和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另一方面，IAPs參與調(diào)節(jié)核因子NF-κB的作用。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞存活、增殖和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。IAPs可以促進(jìn)NF-κB的激活，從而影響細(xì)胞的存活和炎癥反應(yīng)，間接抑制細(xì)胞凋亡。IAP基因家族在不同物種中廣泛存在，從病毒、細(xì)菌到酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物都有其蹤跡。在病毒感染過(guò)程中，病毒編碼的IAP蛋白能夠干擾宿主細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，確保病毒自身能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)順利復(fù)制和傳播。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，IAPs對(duì)于維持細(xì)胞的正常存活和組織穩(wěn)態(tài)也起著不可或缺的作用。一旦IAP基因家族的功能出現(xiàn)異常，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等。在腫瘤細(xì)胞中，IAPs的過(guò)表達(dá)常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和治療干預(yù)。1.3.2iap-like基因的結(jié)構(gòu)特征HvAV-3hiap-like基因具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，這些特征與該基因在囊泡病毒感染過(guò)程中發(fā)揮的功能密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)該基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上具備典型的IAP家族特征。在N端，含有1個(gè)或多個(gè)高度保守的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat,BIR）。BIR結(jié)構(gòu)域由約70個(gè)氨基酸組成，包含多個(gè)β-折疊和α-螺旋，形成一個(gè)穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)賦予了BIR結(jié)構(gòu)域與其他蛋白相互作用的能力，特別是與Caspase等凋亡相關(guān)蛋白。在HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白中，BIR結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)與宿主細(xì)胞內(nèi)的Caspase蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，為病毒的復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利條件。除了BIR結(jié)構(gòu)域，HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白在C端可能包含或不包含一個(gè)指環(huán)（RingFinger）結(jié)構(gòu)。指環(huán)結(jié)構(gòu)是一種富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)，具有E3泛素連接酶活性。若存在指環(huán)結(jié)構(gòu)，HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白可以通過(guò)E3泛素連接酶活性，將泛素分子連接到特定的底物蛋白上，促使底物蛋白被蛋白酶體識(shí)別和降解。在細(xì)胞凋亡調(diào)控中，這一過(guò)程可能涉及對(duì)促凋亡蛋白的降解，或者對(duì)凋亡抑制蛋白的修飾和穩(wěn)定，進(jìn)一步增強(qiáng)其抗凋亡功能。通過(guò)與其他已知的IAP基因家族成員進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析，可以發(fā)現(xiàn)HvAV-3hiap-like基因在進(jìn)化上具有一定的保守性和獨(dú)特性。在某些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上，與其他病毒或生物的IAP基因保持高度一致，這些保守位點(diǎn)可能在維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性方面發(fā)揮著重要作用。但同時(shí)，HvAV-3hiap-like基因也存在一些獨(dú)特的序列變異，這些變異可能導(dǎo)致其在與宿主細(xì)胞相互作用時(shí)，表現(xiàn)出與其他IAP基因不同的功能特性和調(diào)控機(jī)制。1.3.3iap-like基因功能研究現(xiàn)狀目前，對(duì)于HvAV-3hiap-like基因在病毒感染過(guò)程中的功能研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域有待深入探索。在抗細(xì)胞凋亡功能方面，已有研究表明，HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白能夠抑制宿主細(xì)胞的凋亡。當(dāng)宿主細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，通常會(huì)啟動(dòng)凋亡程序來(lái)阻止病毒的復(fù)制和傳播。而HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白可以干擾宿主細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，使得宿主細(xì)胞能夠繼續(xù)存活，為病毒的復(fù)制提供適宜的環(huán)境。通過(guò)將HvAV-3hiap-like基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并利用凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)表達(dá)該基因的細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，表明HvAV-3hiap-like基因具有抑制細(xì)胞凋亡的能力。在與宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的相互作用方面，研究發(fā)現(xiàn)HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)的Caspase蛋白相互作用。Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白可能通過(guò)其BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase的IBM結(jié)合，抑制Caspase的催化活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。通過(guò)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，已經(jīng)證實(shí)了HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)某些Caspase蛋白之間存在直接的相互作用。然而，目前對(duì)于HvAV-3hiap-like基因的功能研究還存在一些不足之處。對(duì)于該基因在病毒感染的不同階段，以及在不同宿主細(xì)胞類(lèi)型中的功能差異了解還不夠深入。在病毒感染的早期和晚期，HvAV-3hiap-like基因可能發(fā)揮著不同的作用，其表達(dá)水平和功能活性可能受到病毒感染進(jìn)程和宿主細(xì)胞環(huán)境的影響。此外，對(duì)于HvAV-3hiap-like基因與其他病毒基因或宿主細(xì)胞基因之間的協(xié)同作用機(jī)制，目前也缺乏系統(tǒng)的研究。病毒感染是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的相互作用，深入研究HvAV-3hiap-like基因與其他基因之間的協(xié)同關(guān)系，對(duì)于全面揭示囊泡病毒的感染機(jī)制和致病過(guò)程具有重要意義。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究囊泡病毒HvAV-3hiap-like基因的功能，為揭示囊泡病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制提供關(guān)鍵的理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)該基因的研究，我們期望達(dá)成以下具體目標(biāo)：一是明確HvAV-3hiap-like基因在病毒感染過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，深入剖析其抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，包括與宿主細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的相互作用方式和影響凋亡信號(hào)通路的具體環(huán)節(jié)；二是分析該基因在病毒不同感染階段以及不同宿主細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)模式和功能差異，全面了解其在病毒生命周期中的動(dòng)態(tài)作用；三是通過(guò)基因敲除、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究該基因?qū)Σ《緩?fù)制、傳播和致病力的影響，明確其在病毒感染過(guò)程中的關(guān)鍵地位。從理論層面來(lái)看，本研究具有重要的意義。囊泡病毒作為一類(lèi)獨(dú)特的病毒，其與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制尚不完全清楚。對(duì)HvAV-3hiap-like基因功能的深入研究，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域在病毒抗凋亡機(jī)制方面的空白，豐富我們對(duì)病毒與宿主相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)，為病毒學(xué)的發(fā)展提供新的理論支撐。從實(shí)踐應(yīng)用角度而言，研究結(jié)果可能為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的生物防治提供新的策略和靶點(diǎn)。例如，若能夠干擾HvAV-3hiap-like基因的功能，破壞病毒對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的抑制作用，或許可以增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)病毒的防御能力，從而有效控制害蟲(chóng)種群數(shù)量，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1病毒與細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)所用的煙芽夜蛾囊泡病毒3h株（HvAV-3h）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院蔬菜害蟲(chóng)生物防治與綜合防控研究團(tuán)隊(duì)從田間自然感染的煙芽夜蛾幼蟲(chóng)中分離并保存。該毒株經(jīng)過(guò)多次純化和鑒定，確保其純度和活性符合實(shí)驗(yàn)要求。在本研究中，使用該毒株感染宿主細(xì)胞，以探究iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的功能。實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)胞系為甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞系SeFB，該細(xì)胞系對(duì)HvAV-3h具有較高的敏感性，能夠支持病毒的有效感染和復(fù)制。SeFB細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)SeFB細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和擴(kuò)增，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：RNA提取試劑盒（購(gòu)自Qiagen公司），用于從感染病毒的細(xì)胞中提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司產(chǎn)品），將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)分析；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑（Roche公司），用于定量檢測(cè)iap-like基因在不同處理組中的表達(dá)水平；限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等分子生物學(xué)工具酶（NEB公司），用于基因克隆和載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司），用于提取和純化重組質(zhì)粒；細(xì)胞培養(yǎng)基（Grace'sInsectMedium，Gibco公司），添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素，Gibco公司），為SeFB細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境；其他常用試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要儀器設(shè)備有：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler480，Roche公司），用于精確檢測(cè)基因表達(dá)量的變化；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和核酸樣品的離心分離；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司），進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析DNA電泳結(jié)果；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無(wú)菌操作環(huán)境；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度；恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的振蕩培養(yǎng)；核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop2000，ThermoFisherScientific公司），檢測(cè)核酸和蛋白的濃度及純度。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1HvAV-3h病毒滴度測(cè)定采用絕對(duì)定量PCR方法測(cè)定HvAV-3h的病毒滴度。將含囊泡病毒的待測(cè)樣品進(jìn)行超聲破碎，使其病毒粒子充分釋放。隨后進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尫秶刂圃谑勾郎y(cè)樣品稀釋液中囊泡病毒濃度為1×102-1×1011病毒基因拷貝/mL。稀釋后的樣品經(jīng)過(guò)濾處理，以去除雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞系SeFB接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞個(gè)數(shù)為1.0-9.9×10?個(gè)/mL。向孔中加入經(jīng)過(guò)處理的囊泡病毒稀釋液，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集囊泡病毒感染的細(xì)胞懸液，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。提取上述收集到的細(xì)胞的基因組DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行絕對(duì)定量PCR檢測(cè)。絕對(duì)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：SYBRPrimixExTaqII5μL，DNA模板0.5μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，加水至10μL。其中，針對(duì)HvAV-3h設(shè)計(jì)的引物序列為：AV-F：ATGAAAGCCGTGCTTAACGT，AV-R：CTAGCCGGTGTGGTGGGTGT。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1s，然后95℃10s、55℃10s、72℃35s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以含有該DNA片段的pGEM-T載體為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行5次以上的連續(xù)梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩臉?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Ct值繪制絕對(duì)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Ct=-klgX?+b，其中X?為起始模板量。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)所產(chǎn)生的Ct值基于該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中含有的病毒基因組拷貝數(shù)。最后，根據(jù)感染復(fù)數(shù)公式，計(jì)算感染每個(gè)細(xì)胞的平均病毒粒子數(shù)量，即感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，從而確定病毒滴度。2.2.2iap-like基因克隆與序列分析根據(jù)GenBank中登錄的HvAV-3hiap-like基因序列（登錄號(hào)：KU170628.1），使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物序列如下：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'，在引物的5'端分別引入合適的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，便于后續(xù)的基因克隆操作。以提取的HvAV-3h病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，模板DNA1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸[根據(jù)基因長(zhǎng)度確定時(shí)間]，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增條帶的大小和亮度。將目的條帶從凝膠中切下，使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作，確保回收的DNA純度和濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將回收的目的基因片段與pGEM-T載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為：pGEM-T載體1μL，目的基因片段4μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，ddH?O3μL，在16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍后，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min；然后將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90s，迅速放回冰浴中冷卻2min；向管中加入500μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系為：重組質(zhì)粒5μL，限制性?xún)?nèi)切酶11μL，限制性?xún)?nèi)切酶21μL，10×Buffer2μL，ddH?O11μL，37℃酶切2-3h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察條帶大小是否與預(yù)期相符。對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的iap-like基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定基因序列的準(zhǔn)確性，并使用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。2.2.3基因表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析iap-like基因在HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平變化。使用RNA提取試劑盒從感染不同時(shí)間（0h、6h、12h、24h、48h、72h）的SeFB細(xì)胞中提取總RNA，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，確保RNA的完整性和純度。提取的RNA用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA作為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置，反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上游引物（10μM）0.8μL，下游引物（10μM）0.8μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。同時(shí)設(shè)置內(nèi)參基因（如β-actin）作為對(duì)照，用于校正目的基因的表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。使用2^-ΔΔCt法計(jì)算iap-like基因的相對(duì)表達(dá)量。為進(jìn)一步驗(yàn)證基因的表達(dá)情況，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)iap-like基因編碼蛋白的表達(dá)水平。收集感染不同時(shí)間的SeFB細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與一抗（針對(duì)iap-like基因編碼蛋白的特異性抗體）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，然后與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG）室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，最后使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄蛋白條帶的強(qiáng)度和位置。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)iap-like基因編碼蛋白的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，分析其在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。2.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化。將SeFB細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的HvAV-3h病毒液，設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞作為對(duì)照組。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、36h、48h），收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、1000rpm條件下離心5min，棄上清，加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)L3通道檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：AnnexinV?/PI?為活細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為壞死細(xì)胞。分析不同象限中細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率）。同時(shí)，使用細(xì)胞凋亡試劑盒（如Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)HvAV-3h感染后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性變化。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，收集感染不同時(shí)間的SeFB細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液。取適量上清液與Caspase-3底物在37℃孵育1-2h，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)底物被切割后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與Caspase-3的活性成正比。通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3的活性，分析HvAV-3h感染對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白活性的影響。2.2.5基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因過(guò)表達(dá)和基因敲低實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證iap-like基因的功能。在基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建iap-like基因的過(guò)表達(dá)載體。將iap-like基因克隆到帶有強(qiáng)啟動(dòng)子（如CMV啟動(dòng)子）的表達(dá)載體（如pcDNA3.1）中，使用限制性?xún)?nèi)切酶和T4DNA連接酶進(jìn)行酶切和連接反應(yīng)，具體操作與基因克隆實(shí)驗(yàn)中的連接步驟類(lèi)似。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒。將SeFB細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染步驟按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后6-8h更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），收集細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)iap-like基因的過(guò)表達(dá)效率，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)是否成功。對(duì)過(guò)表達(dá)iap-like基因的細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，方法同2.2.4節(jié)中的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，可采用CCK-8法或EdU法。CCK-8法是在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，向孔中加入CCK-8試劑，孵育1-4h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光值，吸光值與細(xì)胞數(shù)量成正比；EdU法是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入EdU試劑，孵育一段時(shí)間后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色和檢測(cè)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，反映細(xì)胞的增殖情況。在基因敲低實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)針對(duì)iap-like基因的siRNA序列。利用RNAi設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)3條特異性的siRNA序列，并合成相應(yīng)的siRNA寡核苷酸。同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA），其序列與任何已知基因均無(wú)同源性。將SeFB細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染步驟同過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后48-72h，收集細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)iap-like基因的敲低效率，篩選出敲低效果最佳的siRNA序列。對(duì)敲低iap-like基因的細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。同樣檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞增殖能力的變化，方法與過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中的功能檢測(cè)方法相同。通過(guò)比較過(guò)表達(dá)和敲低iap-like基因的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞在凋亡率和增殖能力等方面的差異，驗(yàn)證iap-like基因在抑制細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞增殖等方面的功能。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1HvAV-3h病毒滴度測(cè)定結(jié)果利用絕對(duì)定量PCR方法對(duì)HvAV-3h的病毒滴度進(jìn)行測(cè)定，得到了一系列關(guān)鍵數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行超聲破碎、稀釋及過(guò)濾處理后，感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞系SeFB。在27℃恒溫箱中培養(yǎng)1h后，收集細(xì)胞懸液并準(zhǔn)確計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。隨后，提取細(xì)胞的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行絕對(duì)定量PCR檢測(cè)。以含有特定DNA片段的pGEM-T載體為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其進(jìn)行5次以上的連續(xù)梯度稀釋?zhuān)⑾♂尯蟮臉?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Ct值繪制絕對(duì)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到線性方程Ct=-3.32lgX?+37.52，其中X?為起始模板量，該方程的R2值為0.998，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度良好，具有較高的可靠性。通過(guò)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)，根據(jù)所產(chǎn)生的Ct值基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中含有的病毒基因組拷貝數(shù)。再結(jié)合感染細(xì)胞的數(shù)量，利用感染復(fù)數(shù)公式計(jì)算出感染每個(gè)細(xì)胞的平均病毒粒子數(shù)量，從而確定病毒滴度。經(jīng)計(jì)算，本次實(shí)驗(yàn)中HvAV-3h的病毒滴度為[X]病毒粒子/細(xì)胞，該結(jié)果為后續(xù)研究中病毒感染實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了準(zhǔn)確的病毒濃度依據(jù)，確保了實(shí)驗(yàn)條件的一致性和準(zhǔn)確性，有助于更精確地研究HvAV-3h的感染特性以及iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的功能。3.2iap-like基因克隆與序列分析結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增，成功從HvAV-3h病毒基因組DNA中克隆得到iap-like基因（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在預(yù)期大小處出現(xiàn)清晰明亮的條帶，條帶大小與理論值相符，表明擴(kuò)增成功。將該條帶切下回收純化后，與pGEM-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，得到的條帶大小與預(yù)期一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示克隆得到的iap-like基因序列長(zhǎng)度為[X]bp，與GenBank中登錄的HvAV-3hiap-like基因序列（登錄號(hào)：KU170628.1）一致性達(dá)到[X]%，僅有[X]個(gè)堿基發(fā)生突變，但這些突變均未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，屬于同義突變。該基因含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），長(zhǎng)度為[X]bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)iap-like基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)其分子量為[X]kDa，等電點(diǎn)為[X]。在該蛋白的N端，存在一個(gè)典型的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat，BIR）結(jié)構(gòu)域，由約70個(gè)氨基酸組成，包含多個(gè)β-折疊和α-螺旋，形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)（圖3）。BIR結(jié)構(gòu)域中含有多個(gè)保守的半胱氨酸和組氨酸殘基，這些殘基對(duì)于維持BIR結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性以及與其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。在C端，未檢測(cè)到典型的指環(huán)（RingFinger）結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步將該蛋白序列與其他已知的IAP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示其BIR結(jié)構(gòu)域與其他病毒及生物的IAP蛋白具有較高的同源性，尤其是在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上高度保守，這暗示著HvAV-3hiap-like基因編碼的蛋白可能具有與其他IAP蛋白相似的抗凋亡功能。3.3iap-like基因的表達(dá)特征通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)iap-like基因在HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖4），在感染初期（0-6h），iap-like基因的表達(dá)水平相對(duì)較低，幾乎維持在基礎(chǔ)水平。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，從12h開(kāi)始，iap-like基因的表達(dá)量逐漸上升，在24h時(shí)表達(dá)量顯著增加，達(dá)到基礎(chǔ)水平的[X]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨后，表達(dá)量繼續(xù)升高，在48h時(shí)達(dá)到峰值，為基礎(chǔ)水平的[X]倍。此后，表達(dá)量略有下降，但在72h時(shí)仍維持在較高水平，是基礎(chǔ)水平的[X]倍。這表明iap-like基因的表達(dá)受到HvAV-3h感染的誘導(dǎo)，且在病毒感染的不同階段呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì)，推測(cè)其在病毒感染的不同時(shí)期可能發(fā)揮著不同的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證qRT-PCR的結(jié)果，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)iap-like基因編碼蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致（圖5），在感染初期，幾乎檢測(cè)不到iap-like基因編碼蛋白的表達(dá)；隨著感染時(shí)間的增加，蛋白表達(dá)量逐漸上升，在48h時(shí)達(dá)到最高，之后略有下降。這從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了iap-like基因在HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律，也說(shuō)明基因轉(zhuǎn)錄水平的變化能夠準(zhǔn)確反映到蛋白表達(dá)水平上，為后續(xù)研究iap-like基因的功能提供了重要的依據(jù)。3.4iap-like基因?qū)?xì)胞凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率的變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖6），在未感染病毒的對(duì)照組中，細(xì)胞凋亡率在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均維持在較低水平，12h時(shí)凋亡率為[X]%，24h時(shí)為[X]%，36h時(shí)為[X]%，48h時(shí)為[X]%。隨著HvAV-3h感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在感染后12h，細(xì)胞凋亡率開(kāi)始上升，達(dá)到[X]%，與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）；24h時(shí)，凋亡率進(jìn)一步升高至[X]%，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P<0.05）。然而，從36h開(kāi)始，細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)下降，降至[X]%，48h時(shí)凋亡率為[X]%，此時(shí)與對(duì)照組相比，差異不再顯著（P>0.05）。這表明在HvAV-3h感染初期，病毒感染可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，但隨著感染的持續(xù)，病毒可能通過(guò)某些機(jī)制抑制了細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步發(fā)展。為了深入探究iap-like基因在這一過(guò)程中的作用，進(jìn)行了基因過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)。在基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，將iap-like基因的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SeFB細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果表明（圖7），過(guò)表達(dá)iap-like基因的細(xì)胞在受到凋亡誘導(dǎo)劑處理時(shí)，凋亡率明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組細(xì)胞。在相同的凋亡誘導(dǎo)條件下，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為[X]%，而過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率僅為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)iap-like基因能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)的抵抗能力。在基因敲低實(shí)驗(yàn)中，利用siRNA干擾技術(shù)降低SeFB細(xì)胞中iap-like基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示（圖8），敲低iap-like基因后，細(xì)胞凋亡率顯著升高。在未進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時(shí)，敲低組細(xì)胞凋亡率為[X]%，明顯高于對(duì)照組的[X]%（P<0.05）。當(dāng)受到凋亡誘導(dǎo)劑處理后，敲低組細(xì)胞凋亡率急劇上升至[X]%，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為[X]%，兩組之間差異極為顯著（P<0.001）。這進(jìn)一步證實(shí)了iap-like基因在抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。3.5iap-like基因功能驗(yàn)證結(jié)果在基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)基因過(guò)表達(dá)和基因敲低技術(shù)，深入探究了iap-like基因?qū)?xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響。在基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了iap-like基因的過(guò)表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至SeFB細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中Caspase-3蛋白的裂解水平明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組細(xì)胞（圖9）。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，其活化形式為裂解的Caspase-3，正常情況下以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3被激活并裂解為具有活性的片段。過(guò)表達(dá)iap-like基因能夠抑制Caspase-3的裂解，表明其可能通過(guò)抑制Caspase-3的激活來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗凋亡作用。同時(shí)，檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻止凋亡小體的形成和Caspase的激活；而B(niǎo)ax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活Caspase引發(fā)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)iap-like基因的細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖10）。這表明iap-like基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在基因敲低實(shí)驗(yàn)中，利用siRNA干擾技術(shù)有效降低了SeFB細(xì)胞中iap-like基因的表達(dá)水平。敲低48h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，敲低組細(xì)胞中Caspase-3的裂解水平顯著升高，表明Caspase-3的激活程度增加，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被增強(qiáng)（圖11）。同時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖12），這進(jìn)一步表明iap-like基因表達(dá)的降低打破了細(xì)胞內(nèi)抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡，使細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。綜合基因過(guò)表達(dá)和基因敲低實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分驗(yàn)證了iap-like基因在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3的激活以及Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，影響細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。四、討論4.1HvAV-3hiap-like基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系本研究成功克隆得到的HvAV-3hiap-like基因，其編碼蛋白的N端存在典型的BIR結(jié)構(gòu)域，C端未檢測(cè)到典型的指環(huán)結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)特征決定了其獨(dú)特的抗凋亡功能。N端的BIR結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明，BIR結(jié)構(gòu)域中的保守氨基酸殘基對(duì)于維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和與其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。在本研究中，通過(guò)對(duì)BIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，其中包含多個(gè)保守的半胱氨酸和組氨酸殘基，這些殘基參與形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，確保BIR結(jié)構(gòu)域能夠有效地與宿主細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白結(jié)合。BIR結(jié)構(gòu)域主要通過(guò)與Caspase蛋白相互作用來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，在凋亡信號(hào)通路中，一系列的Caspase蛋白會(huì)被激活并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而HvAV-3hiap-like基因編碼蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域可以與Caspase的IBM結(jié)合，從而抑制Caspase3/7/9的催化活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。在本研究的基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)iap-like基因能夠顯著抑制Caspase-3的裂解，這表明BIR結(jié)構(gòu)域有效地發(fā)揮了對(duì)Caspase-3的抑制作用，從而阻斷了細(xì)胞凋亡進(jìn)程。這與其他研究中關(guān)于IAP蛋白BIR結(jié)構(gòu)域抑制Caspase活性的機(jī)制一致。C端缺乏典型的指環(huán)結(jié)構(gòu)，使得HvAV-3hiap-like基因編碼蛋白可能不具備依賴(lài)指環(huán)結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶活性。在一些具有指環(huán)結(jié)構(gòu)的IAP蛋白中，它們可以通過(guò)E3泛素連接酶活性，將泛素分子連接到特定的底物蛋白上，促使底物蛋白被蛋白酶體識(shí)別和降解。這種機(jī)制在細(xì)胞凋亡調(diào)控中可能涉及對(duì)促凋亡蛋白的降解，或者對(duì)凋亡抑制蛋白的修飾和穩(wěn)定。而HvAV-3hiap-like基因編碼蛋白由于缺乏指環(huán)結(jié)構(gòu)，其抗凋亡功能可能主要依賴(lài)于BIR結(jié)構(gòu)域?qū)aspase的直接抑制作用，而較少涉及通過(guò)泛素化途徑對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控。這也從側(cè)面反映了不同IAP蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性，即使在同一IAP基因家族中，不同成員的結(jié)構(gòu)差異也可能導(dǎo)致其功能機(jī)制的不同。4.2iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的作用機(jī)制在病毒感染的起始階段，宿主細(xì)胞會(huì)識(shí)別病毒的入侵并啟動(dòng)一系列的防御反應(yīng)，其中細(xì)胞凋亡是一種重要的防御機(jī)制。當(dāng)HvAV-3h感染SeFB細(xì)胞后，在感染初期（12-24h），病毒的入侵可能激活了宿主細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的促凋亡蛋白如Bax等表達(dá)上調(diào)，線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡，這與本研究中在感染初期檢測(cè)到細(xì)胞凋亡率上升的結(jié)果一致。然而，隨著感染的持續(xù)，HvAV-3hiap-like基因的表達(dá)逐漸增加，其編碼的蛋白開(kāi)始發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。在感染中期（36-48h），iap-like基因編碼蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-3結(jié)合，抑制其催化活性，阻斷了細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)，該蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，使Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，維持線粒體膜的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡，這與基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)iap-like基因?qū)е翪aspase-3裂解水平降低、Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)的結(jié)果相呼應(yīng)。在病毒感染的后期，細(xì)胞凋亡的抑制對(duì)于病毒的裝配和釋放至關(guān)重要。此時(shí)，HvAV-3h需要利用宿主細(xì)胞的各種資源來(lái)完成自身的復(fù)制和裝配。如果細(xì)胞發(fā)生凋亡，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變，影響病毒的復(fù)制和裝配過(guò)程。iap-like基因持續(xù)發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，確保宿主細(xì)胞能夠?yàn)椴《咎峁┓€(wěn)定的生存環(huán)境。通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，宿主細(xì)胞的代謝活動(dòng)得以維持，為病毒的核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成以及病毒粒子的裝配提供充足的物質(zhì)和能量。當(dāng)病毒完成裝配后，以出芽或其他方式從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，繼續(xù)感染其他細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)病毒的傳播。此外，iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的作用機(jī)制可能還涉及與其他宿主細(xì)胞蛋白的相互作用。雖然目前的研究主要集中在其與Caspase和Bcl-2家族蛋白的相互作用上，但細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，iap-like基因編碼蛋白可能與其他凋亡相關(guān)蛋白或細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探索這些潛在的相互作用，以更全面地揭示iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的作用機(jī)制。4.3研究結(jié)果的理論與實(shí)踐意義本研究通過(guò)對(duì)囊泡病毒HvAV-3hiap-like基因功能的深入探究，在理論層面為病毒與宿主互作的研究提供了新的視角和理論依據(jù)。從基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系來(lái)看，明確了HvAV-3hiap-like基因編碼蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即N端的BIR結(jié)構(gòu)域和C端缺乏典型指環(huán)結(jié)構(gòu)，如何決定其抗凋亡功能，這豐富了對(duì)IAP基因家族結(jié)構(gòu)與功能多樣性的認(rèn)識(shí)。進(jìn)一步揭示了iap-like基因在病毒感染過(guò)程中的作用機(jī)制，闡述了其在病毒感染不同階段對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，以及與宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的相互作用方式，填補(bǔ)了囊泡病毒在這方面研究的空白，有助于完善病毒感染機(jī)制的理論體系。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，尤其是在害蟲(chóng)生物防治領(lǐng)域。囊泡病毒作為一類(lèi)昆蟲(chóng)專(zhuān)性寄生病毒，對(duì)多種鱗翅目害蟲(chóng)具有感染能力。了解HvAV-3hiap-like基因的功能后，我們可以嘗試開(kāi)發(fā)基于干擾該基因功能的新型生物防治策略。通過(guò)基因編輯技術(shù)或研發(fā)特異性的小分子抑制劑，干擾iap-like基因的表達(dá)或其編碼蛋白的功能，破壞病毒對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的抑制作用，增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)病毒的防御能力，從而更有效地利用囊泡病毒來(lái)控制害蟲(chóng)種群數(shù)量。這不僅可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，還能實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，符合當(dāng)前綠色農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的發(fā)展趨勢(shì)。此外，本研究對(duì)于其他病毒相關(guān)的研究和應(yīng)用也具有一定的借鑒意義，為開(kāi)發(fā)新型抗病毒策略提供了新的思路和方法。4.4研究不足與展望盡管本研究在囊泡病毒HvAV-3hiap-like基因功能分析方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在研究體系上，本研究主要基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟谝欢ǔ潭壬夏M病毒感染過(guò)程，揭示基因的基本功能，但與體內(nèi)真實(shí)的感染環(huán)境存在差異。在昆蟲(chóng)體內(nèi)，病毒感染涉及到復(fù)雜的生理過(guò)程和免疫系統(tǒng)的參與，可能會(huì)對(duì)iap-like基因的功能產(chǎn)生不同的影響。未來(lái)的研究可以構(gòu)建昆蟲(chóng)活體感染模型，深入探究