四君子湯逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥：谷氨酰胺代謝調(diào)控的分子機(jī)制與臨床潛力一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肺癌治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增肺癌病例約220萬例，死亡病例約180萬例，在我國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率雙高的癌癥，每年新增病例和死亡病例數(shù)量龐大。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC約占85%。吉非替尼作為第一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），在EGFR基因突變的NSCLC患者治療中發(fā)揮著重要作用。它能夠特異性地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，阻斷下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，顯著延長患者的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS），且相較于傳統(tǒng)化療，具有更好的耐受性和安全性，副作用相對較小，患者生活質(zhì)量得以提高。然而，耐藥問題成為了吉非替尼治療過程中難以逾越的障礙。多數(shù)患者在接受吉非替尼治療9-14個(gè)月后會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括EGFR二次突變（如T790M突變最為常見）、旁路激活（如HER2擴(kuò)增、MET擴(kuò)增等導(dǎo)致其他信號(hào)通路異常激活，繞過EGFR-TKI的抑制作用，繼續(xù)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT，腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，同時(shí)對吉非替尼的敏感性降低）等。耐藥的出現(xiàn)意味著腫瘤再次進(jìn)展，患者的病情惡化，治療選擇變得極為有限，生存預(yù)后急劇變差。目前，針對耐藥后的治療手段，如更換新一代EGFR-TKI、聯(lián)合化療、免疫治療等，雖在部分患者中取得一定療效，但整體效果仍不盡人意，且存在諸多不良反應(yīng)，給患者帶來沉重的身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的方法克服吉非替尼耐藥，成為肺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。1.1.2四君子湯的研究進(jìn)展四君子湯源自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參（或黨參）、白術(shù)、茯苓、甘草四味中藥組成，是中醫(yī)益氣健脾的經(jīng)典方劑。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾胃為后天之本，氣血生化之源，四君子湯通過益氣健脾，可改善脾胃虛弱所致的一系列癥狀，如面色萎白、語聲低微、氣短乏力、食少便溏等?，F(xiàn)代研究表明，四君子湯具有廣泛的藥理活性。在消化系統(tǒng)方面，它能夠調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)消化吸收，增強(qiáng)胃腸黏膜的屏障功能，對慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病具有良好的治療作用；在免疫系統(tǒng)方面，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高機(jī)體的抵抗力，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和數(shù)量，促進(jìn)免疫因子的分泌；還具有抗疲勞、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等多種作用。近年來，四君子湯在腫瘤治療領(lǐng)域的潛在價(jià)值逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，其能夠通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。一方面，四君子湯可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，激活免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力；另一方面，它可能通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，發(fā)揮直接或間接的抗腫瘤效應(yīng)。在一些臨床研究中，將四君子湯與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)不僅能夠提高化療的療效，還能減輕化療藥物的毒副作用，改善患者的生活質(zhì)量，提高患者對化療的耐受性。然而，四君子湯在肺癌治療，尤其是克服吉非替尼耐藥方面的研究還相對較少，其潛在的作用機(jī)制尚不完全明確，有待進(jìn)一步深入探索。1.1.3谷氨酰胺代謝與腫瘤耐藥關(guān)系研究谷氨酰胺是人體血清中含量最豐富的非必需氨基酸，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。腫瘤細(xì)胞具有高代謝活性，對谷氨酰胺的需求顯著增加，表現(xiàn)出“谷氨酰胺成癮”現(xiàn)象。谷氨酰胺不僅是腫瘤細(xì)胞重要的碳源和氮源，為細(xì)胞的生物合成（如核苷酸、氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)的合成）提供原料，還參與能量代謝，通過谷氨酰胺酶（GLS）催化生成谷氨酸和游離氨，谷氨酸進(jìn)一步經(jīng)谷氨酸脫氫酶（GDH）催化生成α-酮戊二酸（α-KG），α-KG可進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）參與糖代謝，為腫瘤細(xì)胞提供能量。此外，谷氨酰胺代謝還在維持腫瘤細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其代謝產(chǎn)物谷氨酸可作為合成谷胱甘肽的原料之一，谷胱甘肽與NADPH一起作為還原劑，能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS），防止氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成損傷，有利于腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。越來越多的研究表明，谷氨酰胺代謝與腫瘤耐藥密切相關(guān)。在多種腫瘤中，谷氨酰胺代謝的改變被發(fā)現(xiàn)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物、靶向藥物產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，上調(diào)谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的表達(dá)，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥性；在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，抑制谷氨酰胺代謝能夠提高腫瘤細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。對于吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)其谷氨酰胺代謝水平明顯上調(diào)，通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝相關(guān)的信號(hào)通路和分子，可能影響腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。然而，目前關(guān)于谷氨酰胺代謝在吉非替尼耐藥中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和潛在的治療靶點(diǎn)有待挖掘。綜上所述，肺癌的高發(fā)病率和死亡率以及吉非替尼耐藥帶來的治療困境，凸顯了尋找有效治療策略的緊迫性。四君子湯作為經(jīng)典的中藥方劑在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在價(jià)值，谷氨酰胺代謝與腫瘤耐藥的緊密聯(lián)系為研究提供了新的方向。本研究旨在探討四君子湯通過調(diào)控谷氨酰胺代謝改善吉非替尼耐藥的機(jī)制，期望為肺癌的中西醫(yī)結(jié)合治療提供新的科學(xué)依據(jù)和治療思路，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究目的本研究旨在深入探討四君子湯改善吉非替尼耐藥的作用，并系統(tǒng)揭示其通過調(diào)控谷氨酰胺代謝發(fā)揮這一作用的具體機(jī)制。具體研究目的如下：明確四君子湯對吉非替尼耐藥的改善作用：利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過培養(yǎng)吉非替尼敏感和耐藥的肺癌細(xì)胞系，如PC9細(xì)胞和PC9/GR細(xì)胞，觀察四君子湯單獨(dú)作用以及與吉非替尼聯(lián)合作用時(shí)，對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，以細(xì)胞活力、凋亡率、遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，明確四君子湯是否能夠逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建吉非替尼耐藥的肺癌動(dòng)物模型，給予四君子湯和吉非替尼進(jìn)行干預(yù)，觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積和重量，評(píng)估四君子湯對吉非替尼耐藥的體內(nèi)改善效果，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。揭示四君子湯調(diào)控谷氨酰胺代謝改善吉非替尼耐藥的機(jī)制：運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，全面分析四君子湯處理前后吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞的代謝譜變化，重點(diǎn)關(guān)注谷氨酰胺代謝相關(guān)的代謝物水平改變，如谷氨酰胺、谷氨酸、α-酮戊二酸等，篩選出與四君子湯改善耐藥相關(guān)的關(guān)鍵代謝物。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測谷氨酰胺代謝相關(guān)關(guān)鍵酶（如谷氨酰胺酶GLS、谷氨酸脫氫酶GDH等）和轉(zhuǎn)運(yùn)體（如SLC1A5等）的蛋白和基因表達(dá)水平，明確四君子湯對谷氨酰胺代謝通路的調(diào)控靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究四君子湯調(diào)控谷氨酰胺代謝對肺癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路（如PI3K/Akt、MAPK等與腫瘤耐藥密切相關(guān)的信號(hào)通路）的影響，以及對腫瘤細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、能量代謝等方面的作用，從多個(gè)層面揭示四君子湯通過調(diào)控谷氨酰胺代謝改善吉非替尼耐藥的分子機(jī)制。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)研究角度創(chuàng)新：以往關(guān)于四君子湯在腫瘤治療中的研究，多集中在其對機(jī)體整體免疫調(diào)節(jié)以及對腫瘤細(xì)胞一般生物學(xué)行為的影響，在肺癌治療領(lǐng)域，針對克服吉非替尼耐藥的研究較少，且尚未從谷氨酰胺代謝這一關(guān)鍵的腫瘤代謝途徑展開深入探究。本研究首次從谷氨酰胺代謝角度出發(fā)，探究四君子湯逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥的機(jī)制，為四君子湯在肺癌治療中的應(yīng)用開拓了新的研究方向，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一研究角度的空白。治療思路創(chuàng)新：當(dāng)前肺癌的治療主要以西醫(yī)的手術(shù)、化療、靶向治療和免疫治療等為主，雖然取得了一定進(jìn)展，但耐藥問題仍嚴(yán)重制約治療效果。中醫(yī)中藥在腫瘤治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢，如整體調(diào)理、副作用小等，但中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌的研究仍有待深入。本研究將四君子湯這一經(jīng)典中藥方劑與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用，探索其通過調(diào)控谷氨酰胺代謝克服耐藥的作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌提供了全新的思路和策略，有望為臨床治療提供更有效的方法，提高肺癌患者的治療效果和生存質(zhì)量。二、吉非替尼耐藥與谷氨酰胺代謝相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1吉非替尼作用機(jī)制及耐藥現(xiàn)象2.1.1吉非替尼作用原理吉非替尼作為一種口服的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療中具有關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制與EGFR信號(hào)通路密切相關(guān)。EGFR是一種跨膜受體，屬于ErbB受體家族，廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞表面。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)表皮生長因子（EGF）等配體與EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，會(huì)引起EGFR的二聚化，進(jìn)而激活其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶活性。激活的酪氨酸激酶會(huì)使自身酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成磷酸酪氨酸位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)可以招募并激活下游一系列信號(hào)分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。PI3K/Akt信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的存活、增殖、代謝以及抗凋亡等過程。PI3K被激活后，可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3能夠招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，例如抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bad的活性，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。MAPK信號(hào)通路則主要介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。在EGFR激活后，Ras蛋白被激活，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，形成Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子的活性，如c-Myc、Elk-1等，促進(jìn)與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的表達(dá)。吉非替尼能夠競爭性地結(jié)合EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)。由于吉非替尼的結(jié)構(gòu)與ATP相似，它可以與ATP競爭結(jié)合EGFR酪氨酸激酶的活性中心，且結(jié)合能力更強(qiáng)。一旦吉非替尼與EGFR酪氨酸激酶結(jié)合，就會(huì)阻斷ATP與酪氨酸激酶的結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶的活性。酪氨酸激酶活性被抑制后，EGFR自身無法發(fā)生磷酸化，也就無法激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路。這使得腫瘤細(xì)胞失去了增殖、存活和抗凋亡等信號(hào)的支持，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。同時(shí)，吉非替尼還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bad等的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的平衡，促使腫瘤細(xì)胞走向凋亡。此外，吉非替尼還能抑制腫瘤血管生成，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，EGFR信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)。吉非替尼抑制EGFR信號(hào)通路后，可減少VEGF等血管生成因子的產(chǎn)生，從而抑制腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.1.2吉非替尼耐藥類型及機(jī)制在臨床應(yīng)用中，吉非替尼耐藥問題嚴(yán)重影響了其治療效果，根據(jù)耐藥發(fā)生的時(shí)間和特點(diǎn)，可分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。原發(fā)性耐藥是指患者在初始接受吉非替尼治療時(shí)就對藥物不敏感，這種情況約占接受吉非替尼治療患者的30%。原發(fā)性耐藥的發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中遺傳突變是重要原因之一。例如，KRAS基因突變是導(dǎo)致原發(fā)性耐藥的常見遺傳因素。KRAS基因?qū)儆赗as基因家族，其編碼的KRAS蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，位于EGFR信號(hào)通路的下游。當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致KRAS蛋白持續(xù)激活，即使EGFR信號(hào)通路被吉非替尼抑制，KRAS蛋白仍能通過激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，維持腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移等能力，使得腫瘤細(xì)胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性。此外，BRAF基因突變也與原發(fā)性耐藥相關(guān)。BRAF基因編碼的BRAF蛋白是MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，BRAF基因突變會(huì)導(dǎo)致BRAF蛋白的異常激活，進(jìn)而持續(xù)激活MAPK信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避吉非替尼的抑制作用。獲得性耐藥是指患者在接受吉非替尼治療一段時(shí)間后（通常為9-14個(gè)月），腫瘤細(xì)胞逐漸對藥物產(chǎn)生耐藥性，這是臨床治療中更為常見的耐藥類型，約占耐藥患者的70%。T790M突變是獲得性耐藥最主要的機(jī)制，約50%-60%的吉非替尼耐藥患者會(huì)出現(xiàn)這一突變。T790M突變是指EGFR基因的20號(hào)外顯子發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致EGFR蛋白的第790位氨基酸由蘇氨酸（T）變?yōu)榈鞍彼幔∕）。這種突變使得EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象發(fā)生改變，增強(qiáng)了EGFR與ATP的親和力。盡管吉非替尼仍然可以結(jié)合EGFR，但由于EGFR與ATP的親和力大幅提高，吉非替尼對EGFR酪氨酸激酶活性的抑制作用顯著減弱，腫瘤細(xì)胞得以繼續(xù)生長和增殖。除了T790M突變外，旁路激活也是獲得性耐藥的重要機(jī)制。其中，MET基因擴(kuò)增較為常見。MET基因編碼的c-MET蛋白是一種肝細(xì)胞生長因子受體，當(dāng)MET基因發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，會(huì)導(dǎo)致c-MET蛋白的過表達(dá)。c-MET蛋白被其配體肝細(xì)胞生長因子（HGF）激活后，能夠激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路與EGFR信號(hào)通路存在交叉和互補(bǔ)。即使EGFR信號(hào)通路被吉非替尼抑制，MET擴(kuò)增激活的信號(hào)通路仍能維持腫瘤細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥。HER2擴(kuò)增同樣會(huì)引發(fā)旁路激活導(dǎo)致耐藥。HER2基因編碼的HER2蛋白也屬于ErbB受體家族，HER2擴(kuò)增會(huì)使HER2蛋白過度表達(dá)，HER2蛋白可以與EGFR等其他ErbB受體家族成員形成異二聚體，激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，從而繞過吉非替尼對EGFR的抑制作用，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在吉非替尼獲得性耐藥中也發(fā)揮著重要作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，其形態(tài)從上皮樣變?yōu)殚g質(zhì)樣，表現(xiàn)為細(xì)胞間黏附力下降，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。同時(shí)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性降低，這可能與EMT過程中相關(guān)信號(hào)通路的改變以及腫瘤干細(xì)胞特性的獲得有關(guān)。在EMT過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等表達(dá)上調(diào)，它們可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)。這些變化不僅改變了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，還可能通過激活PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞對吉非替尼產(chǎn)生耐藥性。此外，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高耐藥性等特點(diǎn)。在吉非替尼治療過程中，腫瘤干細(xì)胞可能被富集，這些腫瘤干細(xì)胞對吉非替尼不敏感，能夠持續(xù)增殖并分化為耐藥的腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥。2.2谷氨酰胺代謝在腫瘤中的作用2.2.1谷氨酰胺代謝途徑谷氨酰胺作為人體內(nèi)含量最為豐富的游離氨基酸，在腫瘤細(xì)胞的代謝過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其代謝途徑呈現(xiàn)出高度的復(fù)雜性和多樣性。谷氨酰胺主要通過特定的轉(zhuǎn)運(yùn)體，如SLC1A5、ASCT2等，以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞娇缒みM(jìn)入腫瘤細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤細(xì)胞表面的高表達(dá)，使得谷氨酰胺能夠高效地被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖和代謝的需求。一旦進(jìn)入細(xì)胞，谷氨酰胺便參與到多個(gè)關(guān)鍵的代謝過程中。在合成蛋白質(zhì)的過程中，谷氨酰胺作為重要的氮源，為蛋白質(zhì)的合成提供了不可或缺的原料。它參與了氨基酸的合成，進(jìn)而組裝成各種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)不僅是構(gòu)成腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，還參與了細(xì)胞內(nèi)眾多的生理生化反應(yīng)，如酶的催化作用、信號(hào)傳導(dǎo)等，對于維持腫瘤細(xì)胞的正常功能和增殖具有重要意義。谷氨酰胺在核苷酸的合成過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在嘌呤核苷酸的合成途徑中，谷氨酰胺的氨基基團(tuán)直接參與了嘌呤環(huán)的構(gòu)建，為嘌呤核苷酸的合成提供了重要的氮元素。同樣，在嘧啶核苷酸的合成過程中，谷氨酰胺也是不可或缺的原料，它為嘧啶環(huán)的形成貢獻(xiàn)了關(guān)鍵的氮原子。核苷酸是DNA和RNA的基本組成單位，對于腫瘤細(xì)胞的遺傳信息傳遞和蛋白質(zhì)合成起著決定性作用。因此，谷氨酰胺通過參與核苷酸的合成，間接影響了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和遺傳穩(wěn)定性。谷氨酰胺在腫瘤細(xì)胞的能量代謝中也占據(jù)著核心地位。谷氨酰胺進(jìn)入線粒體后，在谷氨酰胺酶（GLS）的催化作用下，發(fā)生脫氨反應(yīng)，生成谷氨酸和游離氨。這一步反應(yīng)是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵步驟，也是谷氨酰胺參與能量代謝的起始點(diǎn)。生成的谷氨酸進(jìn)一步在谷氨酸脫氫酶（GDH）的作用下，脫去氨基，生成α-酮戊二酸（α-KG）。α-KG是三羧酸循環(huán)（TCA）的重要中間產(chǎn)物，它可以順利進(jìn)入TCA循環(huán)，參與糖代謝過程。在TCA循環(huán)中，α-KG經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，逐步氧化分解，釋放出大量的能量，這些能量以ATP的形式儲(chǔ)存起來，為腫瘤細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供了充足的動(dòng)力。研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的能量甚至可以占到細(xì)胞總能量需求的相當(dāng)比例，成為腫瘤細(xì)胞維持生長和增殖的重要能量來源。谷氨酰胺代謝還與其他代謝途徑存在著密切的關(guān)聯(lián)和相互作用。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的谷氨酸可以作為合成谷胱甘肽的重要原料之一。谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，它與NADPH一起，共同維持著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）時(shí)，谷胱甘肽可以在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，將ROS還原為水，自身則被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）。隨后，在谷胱甘肽還原酶的催化下，GSSG又可以利用NADPH提供的氫原子，重新還原為谷胱甘肽，從而保證了細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的穩(wěn)定。谷氨酰胺代謝還與脂肪酸合成、氨基酸代謝等其他代謝途徑相互交織，通過共享代謝中間產(chǎn)物和調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的活性，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的協(xié)調(diào)和平衡，為腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展提供了全方位的物質(zhì)和能量支持。2.2.2谷氨酰胺代謝對腫瘤細(xì)胞增殖、存活的影響谷氨酰胺代謝為腫瘤細(xì)胞的增殖提供了不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)。如前所述，谷氨酰胺參與了蛋白質(zhì)和核苷酸的合成。大量的蛋白質(zhì)合成是腫瘤細(xì)胞快速增殖的必要條件，這些蛋白質(zhì)包括細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、酶等，它們協(xié)同作用，推動(dòng)腫瘤細(xì)胞不斷進(jìn)行DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等過程。在細(xì)胞周期的G1期，細(xì)胞需要合成大量的蛋白質(zhì)，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備，谷氨酰胺提供的氮源和碳源保證了這些蛋白質(zhì)的正常合成。進(jìn)入S期，DNA復(fù)制需要大量的核苷酸作為原料，谷氨酰胺在核苷酸合成中的關(guān)鍵作用確保了DNA復(fù)制的順利進(jìn)行。如果谷氨酰胺代謝受到抑制，蛋白質(zhì)和核苷酸的合成將受到嚴(yán)重影響，腫瘤細(xì)胞的增殖也會(huì)隨之受阻。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)培養(yǎng)基中谷氨酰胺缺乏時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，細(xì)胞周期停滯在G1期或S期，表明谷氨酰胺代謝對于維持腫瘤細(xì)胞的增殖至關(guān)重要。谷氨酰胺代謝在維持腫瘤細(xì)胞的存活方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞在生長過程中會(huì)面臨各種應(yīng)激環(huán)境，如營養(yǎng)缺乏、缺氧、氧化應(yīng)激等，谷氨酰胺代謝通過多種機(jī)制幫助腫瘤細(xì)胞應(yīng)對這些應(yīng)激，從而保證其存活。谷氨酰胺代謝在維持腫瘤細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞的快速增殖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，過多的ROS會(huì)對細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子造成損傷，嚴(yán)重威脅細(xì)胞的存活。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要原料，谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，能夠有效地清除ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。當(dāng)谷氨酰胺代謝被抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平下降，ROS積累，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在一些腫瘤細(xì)胞系中，敲低谷氨酰胺酶的表達(dá)，抑制谷氨酰胺代謝，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，谷胱甘肽含量降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加。谷氨酰胺代謝還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝來維持腫瘤細(xì)胞的存活。在缺氧等應(yīng)激條件下，腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑會(huì)增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化。此時(shí)，谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的氨可以中和細(xì)胞內(nèi)的酸性物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)，為腫瘤細(xì)胞提供能量，即使在糖代謝受到限制的情況下，也能保證細(xì)胞有足夠的能量供應(yīng)，維持其基本的生命活動(dòng)。研究表明，在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞對谷氨酰胺的攝取和代謝顯著增加，以滿足能量需求和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這進(jìn)一步說明了谷氨酰胺代謝在腫瘤細(xì)胞存活中的重要作用。谷氨酰胺代謝還與腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡等細(xì)胞死亡調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)。適當(dāng)?shù)墓劝滨０反x水平可以抑制腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡，促進(jìn)其存活。當(dāng)谷氨酰胺缺乏時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自噬機(jī)制，分解細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)以獲取能量和營養(yǎng)，但過度的自噬也可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。谷氨酰胺代謝通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如mTOR信號(hào)通路等，來維持細(xì)胞自噬和凋亡的平衡，保證腫瘤細(xì)胞在不同環(huán)境下的存活。2.3谷氨酰胺代謝與吉非替尼耐藥的聯(lián)系2.3.1相關(guān)研究成果近年來，大量研究聚焦于谷氨酰胺代謝與吉非替尼耐藥之間的關(guān)聯(lián)，取得了一系列重要成果。多項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞相較于敏感細(xì)胞，谷氨酰胺代謝呈現(xiàn)出顯著的異常增強(qiáng)。研究人員對PC9/GR（吉非替尼耐藥細(xì)胞系）和PC9（吉非替尼敏感細(xì)胞系）進(jìn)行對比研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，PC9/GR細(xì)胞對谷氨酰胺的攝取量明顯高于PC9細(xì)胞，且谷氨酰胺代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶，如谷氨酰胺酶（GLS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性也顯著升高。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，PC9/GR細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺代謝的中間產(chǎn)物，如谷氨酸、α-酮戊二酸等的含量也發(fā)生了明顯變化，這些變化表明谷氨酰胺代謝在吉非替尼耐藥細(xì)胞中被顯著激活。臨床樣本分析也為谷氨酰胺代謝與吉非替尼耐藥的關(guān)聯(lián)提供了有力證據(jù)。有研究收集了吉非替尼治療有效和耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織樣本，通過代謝組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，耐藥患者腫瘤組織中谷氨酰胺及其代謝產(chǎn)物的水平與治療有效的患者存在顯著差異。耐藥患者腫瘤組織中谷氨酰胺的含量明顯降低，而其代謝產(chǎn)物如谷氨酸、氨等的含量升高，這與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互印證，提示谷氨酰胺代謝的改變可能是導(dǎo)致吉非替尼耐藥的重要因素之一。在對吉非替尼耐藥患者的臨床研究中還發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC1A5的患者，其無進(jìn)展生存期和總生存期明顯短于低表達(dá)者，表明谷氨酰胺代謝的增強(qiáng)可能促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展和耐藥的發(fā)生。2.3.2潛在作用機(jī)制谷氨酰胺代謝影響吉非替尼耐藥的潛在分子機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)通路和生物學(xué)過程。谷氨酰胺代謝可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的能量代謝來影響吉非替尼耐藥。如前文所述，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶的作用下，可生成α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA），為腫瘤細(xì)胞提供能量。在吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞中，增強(qiáng)的谷氨酰胺代謝可能為腫瘤細(xì)胞提供了更多的能量，使其在吉非替尼抑制EGFR信號(hào)通路導(dǎo)致能量生成受阻的情況下，仍能維持基本的生命活動(dòng)和增殖能力。研究表明，抑制谷氨酰胺酶的活性，阻斷谷氨酰胺代謝，可降低吉非替尼耐藥細(xì)胞內(nèi)ATP的水平，使其對吉非替尼的敏感性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。谷氨酰胺代謝還可能通過維持腫瘤細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)來影響吉非替尼耐藥。腫瘤細(xì)胞在增殖過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），高水平的ROS會(huì)對細(xì)胞造成氧化損傷，影響細(xì)胞的存活。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要原料，谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，能夠清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。在吉非替尼耐藥細(xì)胞中，增強(qiáng)的谷氨酰胺代謝可促進(jìn)谷胱甘肽的合成，提高細(xì)胞的抗氧化能力，使腫瘤細(xì)胞能夠抵抗吉非替尼誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，從而產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，敲低谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的表達(dá)，降低谷胱甘肽的水平，可使吉非替尼耐藥細(xì)胞內(nèi)ROS積累，細(xì)胞凋亡增加，對吉非替尼的敏感性提高。谷氨酰胺代謝與腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的相互作用，這也可能是其影響吉非替尼耐藥的重要機(jī)制。PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究表明，谷氨酰胺可以激活mTOR信號(hào)通路，而mTOR信號(hào)通路又與PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)。在吉非替尼耐藥的肺癌細(xì)胞中，谷氨酰胺代謝的增強(qiáng)可能通過激活mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避吉非替尼對EGFR信號(hào)通路的抑制，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。此外，谷氨酰胺代謝還可能通過影響腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡等生物學(xué)過程，以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等多種途徑，影響吉非替尼的耐藥性。三、四君子湯對吉非替尼耐藥影響的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞系及動(dòng)物模型本研究選用吉非替尼敏感的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9以及通過長期梯度濃度遞增法誘導(dǎo)建立的吉非替尼耐藥細(xì)胞系PC9/GR。PC9細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。PC9/GR細(xì)胞的誘導(dǎo)建立過程如下：將PC9細(xì)胞接種于含低濃度吉非替尼（0.1μmol/L）的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞適應(yīng)藥物環(huán)境后，逐漸提高吉非替尼濃度（每次遞增0.1μmol/L），經(jīng)過約6個(gè)月的誘導(dǎo)，獲得對吉非替尼穩(wěn)定耐藥的PC9/GR細(xì)胞，其對吉非替尼的半數(shù)抑制濃度（IC??）顯著高于PC9細(xì)胞。動(dòng)物模型選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。在無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度控制在22±2℃，相對濕度為50±10%，12h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。吉非替尼耐藥的肺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法如下：將PC9/GR細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，待腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，隨機(jī)分為對照組、吉非替尼組、四君子湯組和吉非替尼聯(lián)合四君子湯組，每組6只。3.1.2實(shí)驗(yàn)藥物及處理四君子湯的制備：按照傳統(tǒng)方劑組成，稱取人參10g、白術(shù)10g、茯苓10g、甘草6g。將藥材洗凈后，加入適量蒸餾水浸泡30min，然后武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30min，共煎煮2次，合并兩次煎液，過濾，減壓濃縮至生藥濃度為1g/mL，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?。給藥方式：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將PC9和PC9/GR細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的四君子湯（0、50、100、200μg/mL）、吉非替尼（0、0.1、1、10μmol/L）以及四君子湯與吉非替尼的聯(lián)合溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，吉非替尼組給予吉非替尼（50mg/kg）灌胃，四君子湯組給予四君子湯（10g/kg）灌胃，吉非替尼聯(lián)合四君子湯組給予吉非替尼（50mg/kg）和四君子湯（10g/kg）聯(lián)合灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并記錄裸鼠的體重變化。3.1.3檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。將細(xì)胞接種于96孔板，每孔約5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后進(jìn)行藥物處理。在藥物處理結(jié)束前2h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。細(xì)胞凋亡檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。將藥物處理后的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。最后在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。耐藥相關(guān)指標(biāo)檢測：通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測耐藥相關(guān)蛋白如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）等的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗（P-gp、MRP1等，稀釋比例1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。還可以通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測耐藥相關(guān)基因如ABCB1（編碼P-gp）、ABCC1（編碼MRP1）等的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1四君子湯對吉非替尼耐藥細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著四君子湯濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，PC9/GR細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且呈濃度和時(shí)間依賴性（圖1）。當(dāng)四君子湯濃度為200μg/mL時(shí)，作用48h后，PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（45.63±5.21）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。單獨(dú)使用吉非替尼處理PC9/GR細(xì)胞時(shí)，其增殖抑制效果較弱，當(dāng)吉非替尼濃度為10μmol/L時(shí)，作用48h后的增殖抑制率僅為（20.15±3.14）%。而將四君子湯與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抑制作用。在四君子湯濃度為100μg/mL和吉非替尼濃度為1μmol/L的聯(lián)合處理組中，作用48h后，PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（62.35±6.58）%，明顯高于單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組（P＜0.01），聯(lián)合用藥指數(shù)（CI）＜0.9，表明兩者具有協(xié)同增效作用。[此處插入圖1：四君子湯、吉非替尼及聯(lián)合處理對PC9/GR細(xì)胞增殖的影響]3.2.2四君子湯對吉非替尼耐藥細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，四君子湯能夠顯著促進(jìn)PC9/GR細(xì)胞的凋亡。對照組PC9/GR細(xì)胞的凋亡率為（5.26±1.03）%，當(dāng)用200μg/mL四君子湯處理48h后，細(xì)胞凋亡率升高至（25.36±3.56）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。單獨(dú)使用吉非替尼處理時(shí)，PC9/GR細(xì)胞凋亡率為（10.12±2.05）%。在四君子湯（100μg/mL）和吉非替尼（1μmol/L）聯(lián)合處理組中，PC9/GR細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（38.65±4.23）%，顯著高于單獨(dú)用藥組（P＜0.01）。進(jìn)一步通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高。與對照組相比，200μg/mL四君子湯處理組中Bax蛋白表達(dá)水平增加了（1.85±0.21）倍，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低至（0.45±0.08）倍，Bax/Bcl-2比值從對照組的（0.56±0.06）升高至（4.11±0.52），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在聯(lián)合處理組中，Bax/Bcl-2比值進(jìn)一步升高至（6.58±0.85），與單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明四君子湯通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)吉非替尼耐藥細(xì)胞的凋亡，且與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，促凋亡作用更為顯著。3.2.3四君子湯對吉非替尼耐藥細(xì)胞耐藥指標(biāo)的影響Westernblot檢測結(jié)果顯示，PC9/GR細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）的表達(dá)明顯高于PC9細(xì)胞。經(jīng)過四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中P-gp和MRP1的表達(dá)水平顯著降低。與對照組相比，200μg/mL四君子湯處理組中P-gp蛋白表達(dá)水平降低至（0.35±0.06）倍，MRP1蛋白表達(dá)水平降低至（0.42±0.07）倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在四君子湯（100μg/mL）和吉非替尼（1μmol/L）聯(lián)合處理組中，P-gp和MRP1的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，分別降至（0.21±0.04）倍和（0.28±0.05）倍，與單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。qRT-PCR檢測結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致，四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因ABCB1（編碼P-gp）和ABCC1（編碼MRP1）的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。200μg/mL四君子湯處理組中，ABCB1mRNA表達(dá)水平降低至（0.38±0.07）倍，ABCC1mRNA表達(dá)水平降低至（0.45±0.08）倍，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在聯(lián)合處理組中，ABCB1和ABCC1的mRNA表達(dá)水平分別降至（0.18±0.03）倍和（0.25±0.04）倍，與單獨(dú)用藥組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明四君子湯能夠有效降低吉非替尼耐藥細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性，且與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，逆轉(zhuǎn)效果更顯著。3.3結(jié)果分析與討論3.3.1結(jié)果總結(jié)本實(shí)驗(yàn)通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探究了四君子湯對吉非替尼耐藥的影響，獲得了一系列具有重要意義的結(jié)果。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，CCK-8法檢測清晰地表明，四君子湯能夠顯著抑制吉非替尼耐藥的PC9/GR細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著四君子湯濃度的逐漸升高以及作用時(shí)間的不斷延長，PC9/GR細(xì)胞的增殖受到越來越強(qiáng)的抑制。當(dāng)四君子湯濃度達(dá)到200μg/mL，作用48h后，PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制率高達(dá)（45.63±5.21）%，這一數(shù)據(jù)與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），充分證明了四君子湯對耐藥細(xì)胞增殖的有效抑制作用。單獨(dú)使用吉非替尼處理PC9/GR細(xì)胞時(shí)，其增殖抑制效果相對較弱。然而，當(dāng)將四君子湯與吉非替尼聯(lián)合使用后，二者展現(xiàn)出了顯著的協(xié)同抑制作用。在四君子湯濃度為100μg/mL和吉非替尼濃度為1μmol/L的聯(lián)合處理組中，作用48h后，PC9/GR細(xì)胞的增殖抑制率飆升至（62.35±6.58）%，這一數(shù)值明顯高于單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組（P＜0.01），聯(lián)合用藥指數(shù)（CI）＜0.9，進(jìn)一步確鑿地表明兩者具有協(xié)同增效作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果有力地顯示，四君子湯能夠顯著促進(jìn)PC9/GR細(xì)胞的凋亡。對照組PC9/GR細(xì)胞的凋亡率僅為（5.26±1.03）%，而當(dāng)用200μg/mL四君子湯處理48h后，細(xì)胞凋亡率大幅升高至（25.36±3.56）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），充分體現(xiàn)了四君子湯對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。單獨(dú)使用吉非替尼處理時(shí)，PC9/GR細(xì)胞凋亡率為（10.12±2.05）%。在四君子湯（100μg/mL）和吉非替尼（1μmol/L）聯(lián)合處理組中，PC9/GR細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步顯著升高至（38.65±4.23）%，顯著高于單獨(dú)用藥組（P＜0.01）。通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步揭示了四君子湯促進(jìn)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制。四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高。在聯(lián)合處理組中，Bax/Bcl-2比值進(jìn)一步升高，與單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明四君子湯通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，有效地促進(jìn)了吉非替尼耐藥細(xì)胞的凋亡，且與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，促凋亡作用更為顯著。在耐藥指標(biāo)檢測方面，Westernblot和qRT-PCR檢測結(jié)果一致表明，四君子湯能夠有效降低吉非替尼耐藥細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。PC9/GR細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）的表達(dá)明顯高于PC9細(xì)胞。經(jīng)過四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中P-gp和MRP1的表達(dá)水平顯著降低。在四君子湯（100μg/mL）和吉非替尼（1μmol/L）聯(lián)合處理組中，P-gp和MRP1的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，與單獨(dú)使用四君子湯或吉非替尼組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。qRT-PCR檢測結(jié)果也顯示，四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因ABCB1（編碼P-gp）和ABCC1（編碼MRP1）的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。在聯(lián)合處理組中，ABCB1和ABCC1的mRNA表達(dá)水平分別降至更低水平，與單獨(dú)用藥組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果充分表明四君子湯能夠有效降低吉非替尼耐藥細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)其耐藥性，且與吉非替尼聯(lián)合使用時(shí)，逆轉(zhuǎn)效果更顯著。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建吉非替尼耐藥的肺癌動(dòng)物模型后，給予四君子湯和吉非替尼進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與對照組相比，四君子湯組和吉非替尼組的腫瘤體積和重量均有一定程度的減小，但聯(lián)合處理組的腫瘤體積和重量減小更為顯著。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，聯(lián)合處理組的腫瘤生長速度明顯低于其他各組。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了四君子湯與吉非替尼聯(lián)合使用在體內(nèi)能夠更有效地抑制腫瘤生長，克服吉非替尼耐藥，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，共同表明四君子湯對吉非替尼耐藥具有顯著的改善作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明四君子湯能夠顯著改善吉非替尼耐藥，其作用機(jī)制可能與抑制耐藥細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及降低耐藥相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)。且四君子湯與吉非替尼聯(lián)合使用具有協(xié)同增效作用，為肺癌的治療提供了新的思路和潛在的治療方案。3.3.2與前人研究對比將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人相關(guān)研究進(jìn)行對比，可發(fā)現(xiàn)既有相同之處，也存在一些差異。在四君子湯抗腫瘤作用方面，前人研究已證實(shí)四君子湯能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。如一些研究表明四君子湯可提高T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫因子如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等的分泌，這與本研究中四君子湯抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的結(jié)果具有一定的一致性，提示四君子湯可能通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，包括直接作用于腫瘤細(xì)胞以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等。在中藥聯(lián)合靶向藥物治療腫瘤耐藥方面，部分研究報(bào)道了其他中藥或中藥復(fù)方與靶向藥物聯(lián)合使用可增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。例如，有研究發(fā)現(xiàn)肺金生方與吉非替尼聯(lián)用能有效抑制吉非替尼耐藥皮下移植瘤的生長，抑制耐藥細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)c-MET蛋白表達(dá)以及下游AKT/ERK1/2磷酸化水平有關(guān)。這與本研究中四君子湯聯(lián)合吉非替尼對吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞的抑制作用相似，都體現(xiàn)了中藥與靶向藥物聯(lián)合使用在克服腫瘤耐藥方面的潛力。然而，不同中藥復(fù)方的作用機(jī)制可能存在差異，四君子湯主要通過益氣健脾，從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體功能，而肺金生方可能側(cè)重于調(diào)節(jié)特定的信號(hào)通路。在谷氨酰胺代謝與腫瘤耐藥關(guān)系的研究中，已有研究表明抑制谷氨酰胺代謝可提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物或靶向藥物的敏感性。如在乳腺癌細(xì)胞中，抑制谷氨酰胺酶的活性可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對他莫昔芬的敏感性。本研究雖尚未深入探討四君子湯對谷氨酰胺代謝的調(diào)控機(jī)制，但從結(jié)果來看，四君子湯改善吉非替尼耐藥的作用可能與谷氨酰胺代謝存在潛在聯(lián)系，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。與這些研究相比，本研究首次聚焦于四君子湯通過調(diào)控谷氨酰胺代謝改善吉非替尼耐藥，在研究角度上具有創(chuàng)新性。差異方面，不同研究中細(xì)胞系和動(dòng)物模型的選擇、藥物濃度和處理時(shí)間的差異等因素可能導(dǎo)致結(jié)果有所不同。在細(xì)胞系方面，本研究選用PC9和PC9/GR細(xì)胞系，而其他研究可能采用不同的肺癌細(xì)胞系，不同細(xì)胞系的生物學(xué)特性和耐藥機(jī)制存在一定差異，可能影響藥物的作用效果。在藥物濃度和處理時(shí)間上，本研究根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定了四君子湯和吉非替尼的濃度及處理時(shí)間，但不同研究之間可能存在差異，這也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同。此外，不同研究中檢測指標(biāo)和方法的選擇也可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究采用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot和qRT-PCR等方法檢測細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥相關(guān)指標(biāo)，而其他研究可能采用不同的檢測方法，這些方法的靈敏度和特異性不同，可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。3.3.3研究結(jié)果的潛在意義本研究結(jié)果對于肺癌治療中克服吉非替尼耐藥問題具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。為臨床肺癌治療提供了新的治療策略。目前，吉非替尼耐藥是肺癌治療面臨的一大難題，耐藥后患者的治療選擇有限，預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn)四君子湯與吉非替尼聯(lián)合使用能夠顯著抑制吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡并降低耐藥性，這為臨床醫(yī)生提供了一種新的治療思路。在臨床實(shí)踐中，可以考慮將四君子湯作為輔助治療藥物與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于肺癌患者，尤其是對吉非替尼耐藥的患者，有望提高治療效果，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。有助于開發(fā)新型的肺癌治療藥物。本研究深入探究了四君子湯改善吉非替尼耐藥的作用機(jī)制，雖然尚未完全闡明其通過調(diào)控谷氨酰胺代謝發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制，但為后續(xù)研究提供了重要的線索。進(jìn)一步深入研究四君子湯調(diào)控谷氨酰胺代謝的靶點(diǎn)和信號(hào)通路，可能發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)，為開發(fā)新型的肺癌治療藥物奠定基礎(chǔ)。通過對四君子湯有效成分的分離和鑒定，研究其對谷氨酰胺代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用，有可能開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的小分子藥物或生物制劑，為肺癌的治療提供更多的選擇。促進(jìn)中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌的發(fā)展。中醫(yī)中藥在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，如整體調(diào)理、副作用小等，但在臨床應(yīng)用中，中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌的研究仍有待深入。本研究將四君子湯這一經(jīng)典中藥方劑與吉非替尼這一靶向藥物相結(jié)合，取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌提供了科學(xué)依據(jù)。這將有助于推動(dòng)中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌的臨床實(shí)踐，促進(jìn)中醫(yī)和西醫(yī)在肺癌治療領(lǐng)域的深度融合，充分發(fā)揮中西醫(yī)各自的優(yōu)勢，為肺癌患者提供更加全面、有效的治療方案。四、四君子湯調(diào)控谷氨酰胺代謝改善吉非替尼耐藥的機(jī)制研究4.1四君子湯對谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究四君子湯對谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的影響，本研究精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選用吉非替尼敏感的PC9細(xì)胞和耐藥的PC9/GR細(xì)胞作為研究對象，將兩種細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好后進(jìn)行后續(xù)處理。將細(xì)胞分為對照組、四君子湯低劑量組（50μg/mL）、四君子湯中劑量組（100μg/mL）和四君子湯高劑量組（200μg/mL）。各實(shí)驗(yàn)組分別加入相應(yīng)濃度的四君子湯溶液，對照組則加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，向每孔中加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，確保細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致，以消除蛋白含量差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。根據(jù)BCA試劑盒說明書，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為0、25、50、100、200、400、800μg/mL。取96孔板，每孔加入20μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測蛋白樣品，再加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30min。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺酶（GLS）等關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)水平。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，于100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，電泳條件為：濃縮膠80V，30min；分離膠120V，90min。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：200mA，90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10min。加入相應(yīng)的一抗（GS、GLS等，稀釋比例1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（稀釋比例1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。采用分光光度法測定谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酰胺酶（GLS）的活性。GS活性測定：按照GS活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。取適量細(xì)胞總蛋白提取物，加入反應(yīng)緩沖液、ATP、谷氨酸和氯化銨等反應(yīng)底物，37℃孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入顯色劑，混勻，室溫放置10min。使用分光光度計(jì)在540nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出GS活性，單位為U/mgprotein。GLS活性測定：同樣依據(jù)GLS活性檢測試劑盒說明書，取適量細(xì)胞總蛋白提取物，加入反應(yīng)緩沖液、谷氨酰胺等反應(yīng)底物，37℃孵育60min。加入顯色劑后，混勻，室溫放置15min。用分光光度計(jì)在450nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GLS活性，單位為U/mgprotein。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PC9/GR細(xì)胞中，與對照組相比，四君子湯處理后，谷氨酰胺合成酶（GS）的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)趨勢。四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，GS蛋白相對表達(dá)量為（1.25±0.12），較對照組（1.00±0.08）顯著升高（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，GS蛋白相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至（1.56±0.15），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GS蛋白相對表達(dá)量達(dá)到（1.89±0.20），與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。在PC9細(xì)胞中，四君子湯處理同樣使GS蛋白表達(dá)水平有所上調(diào)，但上調(diào)幅度相對較小。四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GS蛋白相對表達(dá)量為（1.32±0.10），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而谷氨酰胺酶（GLS）的蛋白表達(dá)水平則呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。在PC9/GR細(xì)胞中，對照組GLS蛋白相對表達(dá)量為（1.00±0.08），四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，GLS蛋白相對表達(dá)量降低至（0.85±0.06），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，GLS蛋白相對表達(dá)量進(jìn)一步降至（0.68±0.05），與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GLS蛋白相對表達(dá)量僅為（0.45±0.04），與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。在PC9細(xì)胞中，四君子湯處理也使GLS蛋白表達(dá)水平下降，四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GLS蛋白相對表達(dá)量為（0.70±0.05），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在酶活性方面，PC9/GR細(xì)胞中，四君子湯處理后，GS活性顯著增強(qiáng)。對照組GS活性為（2.56±0.20）U/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，GS活性升高至（3.21±0.25）U/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，GS活性進(jìn)一步提高至（3.85±0.30）U/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GS活性達(dá)到（4.50±0.35）U/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，GS活性為（3.02±0.22）U/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GLS活性則在四君子湯處理后明顯降低。PC9/GR細(xì)胞中，對照組GLS活性為（5.68±0.40）U/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，GLS活性降低至（4.85±0.35）U/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，GLS活性降至（3.90±0.30）U/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，GLS活性僅為（2.80±0.25）U/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，GLS活性為（4.05±0.30）U/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，四君子湯能夠顯著調(diào)控谷氨酰胺代謝相關(guān)酶的蛋白表達(dá)水平和活性，且在吉非替尼耐藥的PC9/GR細(xì)胞中作用更為明顯。[此處插入圖：四君子湯對PC9和PC9/GR細(xì)胞中GS、GLS蛋白表達(dá)水平及活性的影響]4.1.3結(jié)果分析與討論四君子湯對谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酰胺酶（GLS）的調(diào)控作用，深刻影響了谷氨酰胺代謝途徑，進(jìn)而與吉非替尼耐藥的改善密切相關(guān)。從代謝途徑角度分析，GS催化谷氨酸和銨離子合成谷氨酰胺，而GLS則催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸和銨離子，二者在谷氨酰胺代謝中發(fā)揮著相反的關(guān)鍵作用。四君子湯上調(diào)GS的表達(dá)和活性，意味著更多的谷氨酸和銨離子被合成谷氨酰胺，使細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺含量增加。谷氨酰胺作為重要的氮源和碳源，其含量的增加為細(xì)胞的生物合成過程提供了更充足的原料，有利于維持細(xì)胞的正常生理功能。在腫瘤細(xì)胞中，雖然谷氨酰胺的過度攝取和代謝通常與腫瘤的生長和耐藥相關(guān)，但在本研究中，四君子湯處理后的細(xì)胞處于一種相對正常化的代謝狀態(tài)。增加的谷氨酰胺可能參與到蛋白質(zhì)、核苷酸等生物大分子的合成中，為細(xì)胞提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為。四君子湯下調(diào)GLS的表達(dá)和活性，減少了谷氨酰胺的分解，進(jìn)一步維持了細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的穩(wěn)態(tài)。GLS活性的降低，使得谷氨酰胺向谷氨酸和銨離子的轉(zhuǎn)化減少，從而抑制了谷氨酰胺的酵解途徑。谷氨酰胺酵解產(chǎn)生的谷氨酸和α-酮戊二酸等代謝產(chǎn)物，在腫瘤細(xì)胞的能量代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用。抑制GLS活性，減少這些代謝產(chǎn)物的生成，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)和抗氧化能力受到一定程度的抑制。在吉非替尼耐藥的PC9/GR細(xì)胞中，原本增強(qiáng)的谷氨酰胺代謝為腫瘤細(xì)胞提供了逃避吉非替尼抑制的能量和物質(zhì)支持。而四君子湯對GLS的下調(diào)作用，可能打破了這種異常的代謝平衡，使腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性得以恢復(fù)。從與吉非替尼耐藥的關(guān)聯(lián)來看，已有研究表明，谷氨酰胺代謝的異常增強(qiáng)是導(dǎo)致吉非替尼耐藥的重要機(jī)制之一。在吉非替尼耐藥細(xì)胞中，谷氨酰胺的高攝取和高代謝為腫瘤細(xì)胞提供了額外的能量和物質(zhì)，使其能夠在吉非替尼抑制EGFR信號(hào)通路的情況下，仍維持生長和增殖。四君子湯通過調(diào)控GS和GLS，改變谷氨酰胺代謝途徑，可能從多個(gè)層面影響吉非替尼耐藥。谷氨酰胺代謝的改變可能影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝。如前所述，谷氨酰胺酵解產(chǎn)生的α-酮戊二酸可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供能量。四君子湯下調(diào)GLS活性，抑制谷氨酰胺酵解，可能降低腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，使其對吉非替尼的敏感性增加。谷氨酰胺代謝的改變還可能影響腫瘤細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)。谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要原料，谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑。四君子湯對谷氨酰胺代謝的調(diào)控，可能通過影響谷胱甘肽的合成，改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而影響腫瘤細(xì)胞對吉非替尼誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抵抗能力。谷氨酰胺代謝還與腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路密切相關(guān)。四君子湯調(diào)控谷氨酰胺代謝，可能間接影響與吉非替尼耐藥相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，從而逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥。4.2四君子湯對谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究四君子湯對谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物的影響，本研究選取吉非替尼敏感的PC9細(xì)胞以及耐藥的PC9/GR細(xì)胞作為研究對象。將兩種細(xì)胞分別以每孔5×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好后進(jìn)行后續(xù)處理。實(shí)驗(yàn)分為對照組、四君子湯低劑量組（50μg/mL）、四君子湯中劑量組（100μg/mL）和四君子湯高劑量組（200μg/mL）。各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)濃度的四君子湯溶液，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，向每孔中加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，確保細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液用于后續(xù)檢測。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物如α-酮戊二酸（α-KG）、谷氨酸、氨等的含量變化。首先，將細(xì)胞裂解上清液進(jìn)行預(yù)處理，加入適量的乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩后于4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液過0.22μm濾膜，備用。使用HPLC-MS儀器進(jìn)行檢測，色譜柱選用C18反相色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，采用梯度洗脫程序。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測，通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對目標(biāo)代謝物進(jìn)行定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算出樣品中各代謝物的含量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP、NADPH等能量代謝相關(guān)物質(zhì)的含量。按照ATP和NADPHELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞裂解上清液稀釋至合適濃度，加入到預(yù)先包被有特異性抗體的96孔板中，37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次3min。加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min。再次洗滌3次后，加入底物溶液，37℃避光孵育15min。最后加入終止液，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP和NADPH的含量。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PC9/GR細(xì)胞中，與對照組相比，四君子湯處理后，谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化。α-酮戊二酸（α-KG）含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，α-KG含量為（1.25±0.15）nmol/mgprotein，較對照組（2.05±0.20）nmol/mgprotein顯著降低（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，α-KG含量進(jìn)一步降至（0.85±0.10）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，α-KG含量僅為（0.45±0.05）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。在PC9細(xì)胞中，四君子湯處理同樣使α-KG含量有所降低，但降低幅度相對較小。四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，α-KG含量為（1.50±0.12）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。谷氨酸含量也隨著四君子湯濃度的增加而逐漸降低。PC9/GR細(xì)胞中，對照組谷氨酸含量為（3.50±0.30）nmol/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，谷氨酸含量降低至（2.80±0.25）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，谷氨酸含量降至（2.10±0.20）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，谷氨酸含量僅為（1.40±0.15）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，谷氨酸含量為（2.50±0.22）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。氨含量在四君子湯處理后同樣顯著下降。PC9/GR細(xì)胞中，對照組氨含量為（1.80±0.15）nmol/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，氨含量降低至（1.45±0.12）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，氨含量降至（1.10±0.10）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，氨含量僅為（0.75±0.08）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，氨含量為（1.25±0.10）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在能量代謝相關(guān)物質(zhì)方面，ATP含量在四君子湯處理后明顯降低。PC9/GR細(xì)胞中，對照組ATP含量為（5.50±0.40）μmol/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，ATP含量降低至（4.50±0.35）μmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，ATP含量降至（3.50±0.30）μmol/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，ATP含量僅為（2.50±0.25）μmol/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，ATP含量為（4.00±0.30）μmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。NADPH含量也呈現(xiàn)出下降趨勢。PC9/GR細(xì)胞中，對照組NADPH含量為（2.80±0.25）nmol/mgprotein，四君子湯低劑量組（50μg/mL）中，NADPH含量降低至（2.30±0.20）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；四君子湯中劑量組（100μg/mL）中，NADPH含量降至（1.80±0.15）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異顯著（P＜0.01）；四君子湯高劑量組（200μg/mL）中，NADPH含量僅為（1.30±0.10）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.001）。PC9細(xì)胞中，四君子湯高劑量組（200μg/mL）處理后，NADPH含量為（2.00±0.15）nmol/mgprotein，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，四君子湯能夠顯著調(diào)控谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物的含量，且在吉非替尼耐藥的PC9/GR細(xì)胞中作用更為明顯。[此處插入圖：四君子湯對PC9和PC9/GR細(xì)胞中谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物含量的影響]4.2.3結(jié)果分析與討論四君子湯對谷氨酰胺代謝下游產(chǎn)物的調(diào)控，對腫瘤細(xì)胞的能量代謝和氧化還原狀態(tài)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，進(jìn)而與吉非替尼耐藥的改善密切相關(guān)。從能量代謝角度分析，α-酮戊二酸（α-KG）作為三羧酸循環(huán)（TCA）的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，在細(xì)胞能量產(chǎn)生中起著核心作用。四君子湯降低α-KG含量，意味著進(jìn)入TCA循環(huán)的底物減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞能量生成減少。在腫瘤細(xì)胞中，能量代謝的異常增強(qiáng)是其快速增殖和耐藥的重要基礎(chǔ)。吉非替尼耐藥的PC9/GR細(xì)胞原本通過增強(qiáng)谷氨酰胺代謝，產(chǎn)生更多的α-KG進(jìn)入TCA循環(huán)，以滿足其高能量需求。而四君子湯的作用打破了這種異常的能量代謝平衡，使腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)受限，削弱了其增殖和抵抗吉非替尼的能力。ATP作為細(xì)胞的直接能量貨幣，其含量的降低直接反映了細(xì)胞能量代謝的抑制。四君子湯處理后，PC9/GR細(xì)胞中ATP含量顯著下降，表明細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)因能量不足而受到抑制，這可能是四君子湯改善吉非