2025年pCR培訓(xùn)試卷及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30分）1.以下關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基本原理的描述，錯(cuò)誤的是：A.通過溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的解鏈與引物結(jié)合B.延伸階段溫度通常為72℃，依賴TaqDNA聚合酶的5'→3'聚合活性C.每個(gè)循環(huán)后目標(biāo)DNA片段數(shù)量呈指數(shù)增長（2?）D.變性階段溫度需低于引物退火溫度以保證雙鏈分離2.熒光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenⅠ染料的作用機(jī)制是：A.與雙鏈DNA小溝結(jié)合，發(fā)射熒光B.特異性標(biāo)記目標(biāo)基因的探針C.僅與單鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光D.通過水解探針釋放報(bào)告基團(tuán)3.設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，以下不符合原則的是：A.引物長度18-25個(gè)堿基，GC含量40%-60%B.3'端避免連續(xù)3個(gè)G/C堿基C.兩條引物的Tm值差異超過5℃D.引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)4.PCR反應(yīng)體系中，dNTP的主要作用是：A.提供DNA合成的原料B.維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定C.激活Taq酶活性D.防止引物二聚體形成5.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性條帶？A.模板DNA純度過高B.引物濃度過低C.退火溫度過低D.循環(huán)次數(shù)過少6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，Ct值的定義是：A.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.擴(kuò)增曲線平臺(tái)期的熒光強(qiáng)度值C.引物與模板完全結(jié)合的時(shí)間點(diǎn)D.延伸階段結(jié)束時(shí)的溫度值7.進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，防止氣溶膠污染的關(guān)鍵操作是：A.使用高壓滅菌的槍頭B.在超凈工作臺(tái)外配制反應(yīng)體系C.定期用紫外線照射PCR實(shí)驗(yàn)室D.所有試劑分裝后反復(fù)凍融8.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的關(guān)鍵步驟是：A.將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNAB.直接以RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增C.無需使用引物D.僅需DNA聚合酶參與9.以下關(guān)于TaqDNA聚合酶的描述，正確的是：A.具有3'→5'外切酶活性，可校正錯(cuò)配B.最適反應(yīng)溫度為55℃C.高溫（95℃）下仍能保持活性D.只能用于定性PCR，不能用于定量10.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)“引物二聚體”條帶，可能的原因是：A.模板DNA濃度過高B.引物設(shè)計(jì)時(shí)3'端互補(bǔ)C.dNTP濃度過低D.延伸時(shí)間過長11.定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.32時(shí)，擴(kuò)增效率約為：A.50%B.80%C.100%D.120%12.以下哪種PCR技術(shù)可用于單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測？A.多重PCRB.巢式PCRC.等位基因特異性PCR（AS-PCR）D.降落PCR（TouchdownPCR）13.PCR反應(yīng)中，Mg2?濃度過高可能導(dǎo)致：A.引物與模板結(jié)合效率降低B.Taq酶活性被抑制C.非特異性擴(kuò)增增加D.擴(kuò)增產(chǎn)物量減少14.進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，內(nèi)參基因的作用是：A.驗(yàn)證引物特異性B.校正不同樣本間的加樣誤差C.提高目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率D.替代目標(biāo)基因作為檢測對(duì)象15.以下關(guān)于PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置的描述，錯(cuò)誤的是：A.變性時(shí)間過長可能導(dǎo)致Taq酶失活B.退火時(shí)間過短可能影響引物與模板結(jié)合C.延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)目標(biāo)片段長度調(diào)整（通常1kb/1min）D.循環(huán)次數(shù)越多，擴(kuò)增產(chǎn)物量越高二、填空題（每空1分，共20分）1.PCR反應(yīng)的三個(gè)基本步驟是________、________和________。2.熒光定量PCR的兩種常用方法是________（基于染料）和________（基于探針）。3.引物的Tm值計(jì)算公式為：Tm=________（適用于長度≤20bp的引物）。4.PCR反應(yīng)體系的核心成分包括模板DNA、________、________、________、緩沖液（含Mg2?）。5.為避免交叉污染，PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分區(qū)設(shè)置，通常分為________、________、________和________四個(gè)區(qū)域。6.定量PCR中，若擴(kuò)增效率低于90%，可能的原因是________或________。7.巢式PCR通過________輪擴(kuò)增提高檢測靈敏度，其設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是________。8.逆轉(zhuǎn)錄PCR中，常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有________（如M-MLV）和________（如AMV）。三、簡答題（每題6分，共30分）1.簡述PCR引物設(shè)計(jì)的主要原則（至少5條）。2.列舉3種PCR實(shí)驗(yàn)中常見的污染類型，并說明對(duì)應(yīng)的防控措施。3.比較普通PCR與熒光定量PCR的異同點(diǎn)（從原理、檢測方法、應(yīng)用場景三方面分析）。4.分析qPCR擴(kuò)增曲線出現(xiàn)“平臺(tái)期提前”的可能原因及解決方法。5.某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行HPV基因檢測時(shí)，陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，可能的原因有哪些？應(yīng)如何排查？四、案例分析題（每題10分，共20分）案例1：某實(shí)驗(yàn)員使用qPCR檢測細(xì)胞中某基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示目標(biāo)基因Ct值為32（正常范圍25-28），內(nèi)參基因Ct值為18（正常范圍16-20）。問題：（1）分析目標(biāo)基因Ct值偏高的可能原因；（2）提出至少3種優(yōu)化措施。案例2：某實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)核桿菌PCR檢測時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后未出現(xiàn)目標(biāo)條帶（陽性對(duì)照正常），但陰性對(duì)照無條帶。問題：（1）列舉可能導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因（至少4個(gè)）；（2）設(shè)計(jì)排查流程。答案一、單項(xiàng)選擇題1.D2.A3.C4.A5.C6.A7.C8.A9.C10.B11.C12.C13.C14.B15.D二、填空題1.變性（解鏈）、退火（復(fù)性）、延伸（合成）2.SYBRGreen法、TaqMan探針法3.4×（G+C）+2×（A+T）4.引物、dNTP、TaqDNA聚合酶5.試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)6.引物設(shè)計(jì)不合理（或二聚體）、模板質(zhì)量差（或濃度過低）7.兩、兩對(duì)引物（外引物和內(nèi)引物）嵌套8.莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶三、簡答題1.引物設(shè)計(jì)原則：（1）長度18-25bp，避免過短導(dǎo)致特異性下降；（2）GC含量40%-60%，避免過高或過低影響退火溫度；（3）兩條引物Tm值差異≤2℃，確保同步結(jié)合模板；（4）3'端避免連續(xù)3個(gè)G/C（防止錯(cuò)配），且不能互補(bǔ)（防止引物二聚體）；（5）引物內(nèi)部避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ΔG≤-5kcal/mol）；（6）引物序列應(yīng)特異性匹配目標(biāo)基因，避免與非目標(biāo)序列同源（可通過BLAST驗(yàn)證）。2.常見污染類型及防控：（1）氣溶膠污染：PCR產(chǎn)物形成的微小顆粒擴(kuò)散，防控措施為使用帶濾芯槍頭、實(shí)驗(yàn)后紫外線照射、分區(qū)操作（擴(kuò)增區(qū)與其他區(qū)物理隔離）；（2）交叉污染：樣本間DNA互相污染，措施為樣本處理時(shí)使用一次性耗材、嚴(yán)格分區(qū)（樣本處理區(qū)獨(dú)立）、設(shè)置陰性對(duì)照；（3）試劑污染：引物或dNTP等試劑被DNA污染，措施為分裝試劑、使用專用移液器、定期檢測試劑空白對(duì)照。3.普通PCR與qPCR異同：-原理：普通PCR通過溫度循環(huán)擴(kuò)增DNA，終點(diǎn)法檢測；qPCR在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)（基于染料或探針），通過Ct值定量。-檢測方法：普通PCR依賴電泳觀察條帶（定性/半定量）；qPCR通過熒光強(qiáng)度變化直接定量（絕對(duì)/相對(duì)定量）。-應(yīng)用場景：普通PCR用于基因克隆、定性檢測（如病原體篩查）；qPCR用于基因表達(dá)分析（如mRNA定量）、病原體載量檢測（如病毒拷貝數(shù)）、SNP分型等需要精確定量的場景。4.qPCR平臺(tái)期提前的可能原因及解決：原因：（1）模板濃度過高，導(dǎo)致早期耗盡dNTP或引物；（2）循環(huán)次數(shù)過多，擴(kuò)增進(jìn)入平臺(tái)期；（3）反應(yīng)體系中Mg2?或dNTP濃度過高，加速反應(yīng)進(jìn)程。解決方法：（1）稀釋模板至合適濃度（通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳模板量）；（2）減少循環(huán)次數(shù)（通常25-40次，根據(jù)目標(biāo)基因豐度調(diào)整）；（3）優(yōu)化反應(yīng)體系（降低Mg2?或dNTP濃度，重新配置體系）。5.陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的可能原因及排查：可能原因：（1）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境被PCR產(chǎn)物污染（氣溶膠污染）；（2）陰性對(duì)照管被樣本或陽性對(duì)照污染（操作不當(dāng)）；（3）試劑（如引物、dNTP）被目標(biāo)DNA污染；（4）引物特異性差，擴(kuò)增出非目標(biāo)序列（如引物二聚體與目標(biāo)條帶大小相近）。排查流程：（1）更換陰性對(duì)照管及所有耗材，重新配制反應(yīng)體系（使用新批次試劑）；（2）檢測試劑空白對(duì)照（僅加體系成分，無模板），若陽性則試劑污染；（3）檢查引物特異性（通過BLAST比對(duì)或熔解曲線分析）；（4）對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行清潔（紫外線照射+75%乙醇擦拭），并檢測環(huán)境拭子（如桌面、移液器）是否含目標(biāo)DNA。四、案例分析題案例1：（1）目標(biāo)基因Ct值偏高的可能原因：①細(xì)胞中目標(biāo)基因表達(dá)量低（如實(shí)驗(yàn)處理導(dǎo)致基因沉默）；②RNA提取過程中降解（cDNA合成量少）；③逆轉(zhuǎn)錄效率低（反轉(zhuǎn)錄酶活性下降或反應(yīng)條件不當(dāng)）；④qPCR引物效率低（引物二聚體或與模板結(jié)合不充分）；⑤模板加樣量不足（移液誤差導(dǎo)致cDNA加入量少）。（2）優(yōu)化措施：①增加RNA上樣量（確保逆轉(zhuǎn)錄模板充足）；②使用更高效的逆轉(zhuǎn)錄酶（如熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶）；③重新設(shè)計(jì)qPCR引物（通過軟件驗(yàn)證Tm值和特異性）；④進(jìn)行梯度稀釋實(shí)驗(yàn)（確定最佳模板濃度）；⑤檢查移液槍準(zhǔn)確性（校準(zhǔn)移液器，使用帶濾芯槍頭減少誤差）。案例2：（1）可能原因：①臨床樣本中結(jié)核桿菌DNA含量過低（如樣本采集量不足或處理過程中丟失）；②DNA提取失敗（裂解不充分或抑制物殘留，如痰液中的黏液蛋白抑制Taq酶）；③引物或探針失效（保存不當(dāng)導(dǎo)致降解）；④PCR反應(yīng)條件不適（退火溫度過高，引物無法結(jié)合；延伸時(shí)間過短，長片段擴(kuò)增不完全）；⑤Ta