單克隆抗體篩選方案的制定演講人：日期:CATALOGUE目錄01目標抗原與篩選策略確立02免疫與抗體庫構建03高通量篩選技術應用04候選抗體驗證方法05陽性克隆優(yōu)化流程06方案落地與成果轉化01目標抗原與篩選策略確立抗原特性分析與表位定義010203理化性質評估通過質譜、圓二色譜等技術分析抗原分子量、等電點、穩(wěn)定性及二級結構，明確其可溶性、聚合狀態(tài)及潛在修飾位點，為后續(xù)純化與偶聯(lián)提供依據(jù)。表位精細定位采用肽庫掃描、氫氘交換質譜（HDX-MS）或冷凍電鏡技術，確定抗原的線性/構象表位分布，優(yōu)先篩選功能性表位以確?？贵w結合后具有中和或阻斷活性。免疫原性預測結合生物信息學工具（如IEDB）預測抗原的T/B細胞表位，排除自身免疫反應風險，優(yōu)化抗原設計以提高免疫應答效率。針對小分子或弱免疫原性抗原，采用載體蛋白（如KLH、BSA）偶聯(lián)或病毒樣顆粒（VLP）展示技術增強免疫原性；對膜蛋白抗原需保留天然構象，使用納米盤或脂質體模擬細胞膜環(huán)境。免疫原設計與動物模型選擇抗原修飾策略根據(jù)抗原保守性選擇小鼠、大鼠或兔等常規(guī)模型；若需人源化抗體，優(yōu)先采用轉基因動物（如OmniRat）或羊駝（納米抗體開發(fā)），兼顧免疫系統(tǒng)兼容性與抗體多樣性。動物模型匹配采用弗氏佐劑（初免用完全弗氏，加強用不完全弗氏）或新型佐劑（如CpG-ODN），制定多輪免疫計劃（間隔2-4周），通過ELISA監(jiān)測血清效價動態(tài)變化。佐劑與免疫方案初步篩選技術路線規(guī)劃03交叉反應與物種交叉性測試納入同源蛋白或不同物種抗原進行交叉篩選，評估抗體特異性，避免后續(xù)開發(fā)中因脫靶效應導致的失敗風險。02功能驗證并行設計對治療性抗體需同步開發(fā)中和實驗（如假病毒中和試驗）或阻斷實驗（受體-配體互作抑制），確保篩選的抗體兼具結合力與生物活性。01高通量初篩平臺建立基于ELISA/Octet的非標記結合檢測，結合流式細胞術（針對細胞表面抗原）或SPR（動力學分析），快速排除非特異性結合克隆，篩選高親和力候選分子。02免疫與抗體庫構建免疫程序優(yōu)化與效價監(jiān)測抗原劑量與免疫周期調整通過系統(tǒng)評估抗原濃度、佐劑類型及免疫間隔時間，優(yōu)化免疫方案以誘導高效價抗體反應，確保B細胞充分活化與記憶細胞形成。免疫途徑與淋巴結靶向對比皮下、腹腔、淋巴結內注射等免疫途徑對生發(fā)中心反應的影響，優(yōu)先選擇能最大化抗原提呈細胞活化的方法。血清效價動態(tài)監(jiān)測采用ELISA、流式細胞術等技術定期檢測血清抗體滴度，結合親和力成熟分析，篩選最佳采血時間點用于后續(xù)B細胞分選。熒光標記與磁珠分選技術利用抗原特異性熒光探針或生物素-鏈霉親和素體系，通過流式細胞儀（FACS）或磁激活分選（MACS）分離高親和力B細胞。單細胞分離與克隆擴增采用有限稀釋法或微流控芯片分選單個抗原陽性B細胞，結合條件培養(yǎng)基培養(yǎng)促進其體外擴增并保留抗體分泌能力。記憶B細胞與漿細胞分選策略根據(jù)表面標志物（如CD19、CD27、CD38）差異，分選不同發(fā)育階段的B細胞亞群以擴大抗體庫多樣性。陽性B細胞分選與富集通過RT-PCR擴增B細胞可變區(qū)基因，采用重疊延伸PCR或Gibson組裝構建scFv/Fab表達文庫，確保讀碼框正確性。輕重鏈基因擴增與載體組裝文庫構建與多樣性評估利用NGS技術分析文庫的CDR3序列分布、突變頻率及克隆豐度，評估覆蓋度是否滿足全人源或鼠源抗體篩選需求。高通量測序驗證多樣性將文庫轉染至噬菌體、酵母或哺乳細胞展示系統(tǒng)，驗證蛋白表達效率及功能性抗體片段的比例，優(yōu)化文庫構建參數(shù)。體外展示系統(tǒng)兼容性測試03高通量篩選技術應用通過基因工程手段構建高多樣性的抗體文庫，確保覆蓋廣泛的抗原結合表位，采用錯配PCR或鏈替換等技術增強文庫的突變率和功能性。文庫構建與多樣性優(yōu)化噬菌體/酵母展示技術實施利用固相或液相抗原進行多輪親和篩選，結合嚴格洗滌條件（如梯度pH或變性劑處理）去除低親和力克隆，提高高特異性抗體的富集效率。多輪生物淘選與富集對篩選后的克隆進行NGS測序，通過生物信息學工具（如IgBLAST）分析CDR區(qū)序列特征，結合結構預測軟件（如Rosetta）評估抗體-抗原相互作用。高通量測序與數(shù)據(jù)分析單細胞分選與測序策略流式細胞分選與微孔板捕獲基于表面標記（如IgG表達）或功能活性（如抗原結合熒光信號）分選單個B細胞，配合微孔板自動化系統(tǒng)實現(xiàn)單克隆分離，確保后續(xù)擴增的均一性。全長抗體基因擴增技術采用多重PCR或SMART-seq方法從單細胞中擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，避免引物偏好性導致的序列丟失，保證抗體完整性。配對測序與克隆驗證通過高通量測序確定VH/VL配對關系，結合瞬時轉染表達驗證抗體結合活性，篩選高親和力且低交叉反應性的候選分子。微流控芯片高通量篩選液滴微流控單細胞封裝利用油水兩相系統(tǒng)將單個B細胞與抗原標記微珠共包裹，在皮升級反應室中完成分泌抗體的實時檢測，顯著提升篩選通量（可達10^6細胞/天）。多重表位并行篩選集成多通道熒光檢測模塊，同步分析抗體對不同抗原（如突變體或異構體）的結合特異性，快速識別廣譜中和抗體。動態(tài)親和力參數(shù)分析通過微閥控制流體流速，測量抗體-抗原解離速率（koff），結合芯片表面等離子共振（SPR）模擬技術，實現(xiàn)無需純化的親和力初步評估。04候選抗體驗證方法123特異性結合能力測試ELISA/SPR檢測通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）或表面等離子共振（SPR）技術，定量分析抗體與目標抗原的結合能力，排除非特異性結合干擾。需設置陰性對照（如無關蛋白或空白載體）以驗證信號特異性。免疫組化/流式細胞術利用組織切片或細胞系驗證抗體在復雜生物樣本中的靶向性，觀察其是否僅與目標抗原表位結合，避免交叉反應導致假陽性。競爭結合實驗加入已知特異性抗體或游離抗原進行競爭抑制，若信號顯著降低則證明結合位點專一，適用于表位相似性高的抗原驗證。親和力與動力學參數(shù)測定生物膜干涉技術（BLI）實時監(jiān)測抗體-抗原結合的解離常數(shù)（KD）、結合速率（kon）和解離速率（koff），評估動態(tài)相互作用強度，優(yōu)先篩選高親和力（KD≤nM級）候選分子。等溫滴定量熱法（ITC）微尺度熱泳動（MST）通過測量結合過程中的熱量變化，直接獲取熱力學參數(shù)（ΔH、ΔS），揭示結合驅動的分子機制，適用于優(yōu)化抗體改造策略?；跓晒鈽擞浄肿釉跍囟忍荻戎械倪w移變化，計算親和力，尤其適合低溶解度或難固定化抗原的測試場景。123功能性體外活性評估ADCC/CDC效應分析利用效應細胞（如NK細胞）或補體依賴的細胞毒性試驗，評估抗體通過Fc段介導的殺傷功能，關鍵用于治療性抗體開發(fā)。細胞增殖/凋亡抑制實驗針對腫瘤治療抗體，檢測其阻斷靶點信號通路后對癌細胞生長的抑制率（如CCK-8法），或誘導凋亡能力（AnnexinV/PI雙染）。中和活性檢測針對病毒中和抗體，通過假病毒系統(tǒng)或活病毒中和試驗（如空斑減少試驗）測定半數(shù)抑制濃度（IC50），驗證其中和病原體的效力。05陽性克隆優(yōu)化流程人源化改造策略采用定向進化（如噬菌體展示、酵母展示）或理性設計（基于結構的熱點殘基突變），提高抗體與靶標的結合強度（KD值），優(yōu)化后的抗體需通過SPR或BLI驗證親和力提升效果。親和力成熟技術免疫原性評估通過T細胞表位預測工具（如EpiMatrix）分析人源化抗體的潛在免疫風險，必要時進行去免疫化改造以降低臨床不良反應概率。通過CDR移植或框架區(qū)優(yōu)化，降低抗體的免疫原性，同時保留其抗原結合能力；需結合結構模擬和體外實驗驗證人源化后的活性與穩(wěn)定性。人源化/親和力成熟設計表達系統(tǒng)優(yōu)化與產量提升宿主細胞選擇對比CHO、HEK293等哺乳動物細胞的表達效率與糖基化修飾差異，根據(jù)抗體特性選擇最適宿主；原核系統(tǒng)（如大腸桿菌）適用于無糖基化要求的抗體片段生產。培養(yǎng)基與工藝參數(shù)開發(fā)無血清培養(yǎng)基配方，調控pH、溶氧及補料策略（如動態(tài)補料），結合灌流培養(yǎng)工藝提升抗體滴度至>5g/L。載體與啟動子優(yōu)化采用高表達載體（如pTT5）搭配強啟動子（CMV），并引入增強子元件（如WPRE）以提高轉錄效率；同時優(yōu)化信號肽序列（如Igκ）促進分泌表達。穩(wěn)定性與聚集傾向分析熱穩(wěn)定性評估通過差示掃描量熱法（DSC）測定抗體熔解溫度（Tm），篩選Tm>65℃的高穩(wěn)定性候選分子；不穩(wěn)定結構域需通過分子動力學模擬指導突變設計。030201聚集傾向檢測利用動態(tài)光散射（DLS）和SEC-HPLC分析抗體在加速應力條件（高溫、低pH）下的聚集率，聚集率<5%為合格；必要時引入表面電荷修飾（如K→R突變）減少疏水相互作用。長期儲存穩(wěn)定性測試在4℃、25℃及凍融循環(huán)條件下監(jiān)測抗體活性與物理狀態(tài)，優(yōu)化制劑緩沖液（如組氨酸-蔗糖體系）以延長shelflife。06方案落地與成果轉化通過高通量篩選技術（如ELISA、FACS）從雜交瘤細胞或噬菌體展示庫中初步篩選出具有目標結合活性的抗體克隆，建立初級候選庫。候選抗體庫初篩對初篩陽性克隆進行結合特異性、交叉反應性及親和力（如SPR或BLI分析）測試，篩選出高特異性、高親和力的抗體候選株。功能驗證與親和力評估評估抗體在長期儲存、不同pH/溫度條件下的穩(wěn)定性，并通過密碼子優(yōu)化或表達系統(tǒng)調整提高產量，確保工業(yè)化生產的可行性。穩(wěn)定性與表達優(yōu)化篩選里程碑節(jié)點設定質量控制標準制定理化性質檢測包括抗體純度（SDS、SEC-HPLC）、分子量（質譜分析）、等電點（IEF）及聚集體含量（DLS）的標準化檢測流程。生物學活性驗證通過建立參考品庫和關鍵質量屬性（CQAs）監(jiān)控體系，確保不同生產批次抗體的理化特性與生物活性高度一致。建立基于細胞模型（如中和試驗）或動物模型的活性測試方法，確?？贵w功能與預期一致，并設定活性閾值（如IC50或EC50）。批次間一致性控制下游應用場景對接規(guī)劃