基于BALB/c小鼠模型的蟹類過敏原特性與致敏機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義食物過敏作為一種由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的不良反應(yīng)，近年來在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有2-25%的人口受到食物過敏的影響，且這一數(shù)字仍在持續(xù)增長(zhǎng)。食物過敏不僅會(huì)對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，如限制飲食選擇、影響社交活動(dòng)等，還可能導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題，在極端情況下甚至?xí)＜吧３Ｒ姷氖澄镞^敏原包括牛奶、雞蛋、花生、堅(jiān)果、魚類、貝類以及小麥等。其中，甲殼類水產(chǎn)品過敏是較為常見的食物過敏類型之一，而蟹類作為深受人們喜愛的甲殼類美食，因其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)，在全球范圍內(nèi)擁有廣泛的消費(fèi)群體。然而，隨著蟹類消費(fèi)量的不斷增加，蟹類過敏的問題也日益凸顯。蟹類過敏屬于IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，是機(jī)體對(duì)蟹類中的某些蛋白質(zhì)產(chǎn)生的異常免疫應(yīng)答。當(dāng)過敏體質(zhì)的個(gè)體首次接觸蟹類過敏原時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性IgE抗體，并與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同過敏原時(shí)，過敏原會(huì)與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等生物活性介質(zhì)，從而引發(fā)一系列過敏癥狀。這些癥狀可累及多個(gè)系統(tǒng)，如皮膚出現(xiàn)紅斑、風(fēng)團(tuán)、瘙癢；口咽部出現(xiàn)唇、舌、眼部瘙癢、刺激和輕度腫脹；呼吸道出現(xiàn)鼻癢、鼻塞、流涕、打噴嚏、呼吸困難；胃腸道出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、便血等。嚴(yán)重的蟹類過敏反應(yīng)可導(dǎo)致過敏性休克，如不及時(shí)治療，可能會(huì)導(dǎo)致患者死亡。例如，有研究報(bào)道了多起因食用螃蟹而導(dǎo)致過敏性休克的病例，這些患者在食用螃蟹后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了血壓下降、呼吸困難、意識(shí)喪失等癥狀，經(jīng)過緊急搶救才得以脫險(xiǎn)。目前，對(duì)于蟹類過敏的診斷主要依靠病史詢問、皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、血清特異性IgE檢測(cè)以及食物激發(fā)試驗(yàn)等方法。然而，這些方法存在一定的局限性，如皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和血清特異性IgE檢測(cè)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，食物激發(fā)試驗(yàn)雖然是診斷食物過敏的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。此外，由于不同個(gè)體對(duì)蟹類過敏原的敏感性和反應(yīng)程度存在差異，使得準(zhǔn)確診斷和治療蟹類過敏變得更加困難。為了深入了解蟹類過敏的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的防治方法，建立合適的動(dòng)物模型是非常必要的。動(dòng)物模型可以模擬人類過敏的過程，為研究蟹類過敏原的致敏機(jī)制、篩選和評(píng)價(jià)抗過敏藥物以及開發(fā)低致敏性食品提供重要的工具。在眾多動(dòng)物模型中，BALB/c小鼠因其遺傳背景清楚、免疫反應(yīng)敏感且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食物過敏的研究。通過構(gòu)建BALB/c小鼠蟹類過敏模型，可以在可控的實(shí)驗(yàn)條件下，研究蟹類過敏原對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響，觀察過敏癥狀的發(fā)生發(fā)展過程，分析相關(guān)免疫指標(biāo)的變化，從而為揭示蟹類過敏的分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制提供理論依據(jù)。同時(shí)，利用該模型還可以評(píng)估不同處理方法對(duì)蟹類過敏原致敏性的影響，為開發(fā)低致敏性的蟹類產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)于保障消費(fèi)者的健康和安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在蟹類過敏原的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。國(guó)外研究起步較早，對(duì)甲殼類動(dòng)物主要過敏原原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）的研究較為深入。大量研究證實(shí)，TM在甲殼類動(dòng)物中高度保守，是引發(fā)過敏反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。例如，通過對(duì)多種蝦蟹類的研究發(fā)現(xiàn)，TM的氨基酸序列具有較高的相似性，其結(jié)構(gòu)和功能在不同物種間相對(duì)穩(wěn)定，這使得它成為過敏原研究的重點(diǎn)對(duì)象。同時(shí)，國(guó)外研究還關(guān)注到不同蟹類過敏原的特性差異，以及這些差異對(duì)過敏反應(yīng)的影響。國(guó)內(nèi)研究近年來也在不斷深入，一方面對(duì)中華絨螯蟹、鋸緣青蟹和三疣梭子蟹等本土重要經(jīng)濟(jì)蟹類的過敏原進(jìn)行了研究。首次證實(shí)了中華絨螯蟹的主要過敏原為原肌球蛋白，并對(duì)其進(jìn)行了重組表達(dá)，為今后蟹類過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。另一方面，國(guó)內(nèi)研究還從免疫檢測(cè)、分離純化、抗體制備、分子克隆、原核表達(dá)等多個(gè)方面對(duì)蟹類過敏原展開全面探索。采用免疫印跡法，利用過敏患者血清，確定了中華絨螯蟹的主要過敏原為分子量約為某特定值的蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其它多個(gè)次要過敏蛋白組分也參與了過敏反應(yīng)。在BALB/c小鼠蟹類過敏模型的構(gòu)建與應(yīng)用上，國(guó)內(nèi)外研究均有涉及。國(guó)外研究主要集中在優(yōu)化模型構(gòu)建方法，提高模型與人類過敏反應(yīng)的相似性，以及利用模型深入探究過敏反應(yīng)的分子機(jī)制和信號(hào)通路。通過對(duì)小鼠模型的研究，揭示了一些與過敏相關(guān)的關(guān)鍵基因和蛋白的作用機(jī)制，為開發(fā)新的治療方法提供了理論基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)研究則更注重結(jié)合本土蟹類資源，研究不同蟹類過敏原在小鼠模型中的致敏性差異，以及利用模型評(píng)估低致敏性食品和抗過敏藥物的效果。通過建立鋸緣青蟹原肌球蛋白和精氨酸激酶的BALB/c小鼠模型，對(duì)這兩種過敏原的致敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)腹腔注射和灌胃方式均可使小鼠出現(xiàn)過敏癥狀，但腹腔注射方式的效果更好，且兩種過敏原致敏后小鼠的免疫指標(biāo)變化存在一定差異。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處和待解決的問題。在過敏原研究方面，雖然已確定了一些主要過敏原，但對(duì)于次要過敏原的研究還不夠深入，它們?cè)谶^敏反應(yīng)中的具體作用機(jī)制尚不清楚。不同蟹類過敏原之間的交叉反應(yīng)性研究也有待加強(qiáng)，這對(duì)于準(zhǔn)確診斷和治療蟹類過敏具有重要意義。在小鼠模型研究中，目前的模型雖然能夠模擬部分過敏癥狀，但與人類實(shí)際過敏情況仍存在一定差距，如何進(jìn)一步優(yōu)化模型，使其更真實(shí)地反映人類過敏的復(fù)雜過程，是亟待解決的問題。此外，利用小鼠模型篩選和評(píng)價(jià)抗過敏藥物及低致敏性食品時(shí)，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，導(dǎo)致研究結(jié)果的可比性和可靠性受到一定影響。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過構(gòu)建BALB/c小鼠蟹類過敏模型，深入探究蟹類過敏原的致敏機(jī)制，為蟹類過敏的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。具體研究目標(biāo)如下：成功構(gòu)建穩(wěn)定可靠的BALB/c小鼠蟹類過敏模型，通過多種檢測(cè)方法評(píng)估模型的有效性和重復(fù)性，確保模型能夠準(zhǔn)確模擬人類蟹類過敏的過程和癥狀。利用構(gòu)建的小鼠模型，研究蟹類過敏原對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響，分析過敏反應(yīng)過程中相關(guān)免疫細(xì)胞、免疫因子以及信號(hào)通路的變化，揭示蟹類過敏的致敏機(jī)制。通過對(duì)小鼠模型的研究，評(píng)估不同處理方法對(duì)蟹類過敏原致敏性的影響，為開發(fā)低致敏性的蟹類產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。基于以上研究目標(biāo)，本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：蟹類過敏原的提取與純化：選取常見的經(jīng)濟(jì)蟹類品種，如中華絨螯蟹、鋸緣青蟹等，采用物理、化學(xué)和生物技術(shù)相結(jié)合的方法，從蟹肉、蟹黃等組織中提取蟹類過敏原。運(yùn)用等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析、柱層析等技術(shù)對(duì)提取的過敏原進(jìn)行純化，得到高純度的過敏原蛋白，并通過蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析，確定過敏原的種類、分子量、等電點(diǎn)等特性。BALB/c小鼠蟹類過敏模型的構(gòu)建：選取健康的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠采用腹腔注射、灌胃等不同方式給予蟹類過敏原進(jìn)行致敏，對(duì)照組小鼠給予等量的生理鹽水。在致敏過程中，觀察小鼠的過敏癥狀，如皮膚瘙癢、搔抓、呼吸急促、腹瀉等，并根據(jù)過敏癥狀的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。通過多次致敏和激發(fā)，建立穩(wěn)定的BALB/c小鼠蟹類過敏模型。模型的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證：采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中特異性IgE、IgG1、IgG2a等抗體的水平，分析抗體水平與過敏癥狀之間的相關(guān)性。檢測(cè)小鼠糞便中組胺的含量，評(píng)估組胺在過敏反應(yīng)中的作用。利用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例變化，如Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，了解免疫細(xì)胞在過敏反應(yīng)中的動(dòng)態(tài)變化。通過以上多種方法對(duì)構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行全面評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，確保模型的可靠性和有效性。蟹類過敏致敏機(jī)制的研究：在建立的小鼠模型基礎(chǔ)上，深入研究蟹類過敏的致敏機(jī)制。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，檢測(cè)過敏反應(yīng)過程中相關(guān)免疫因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等）、轉(zhuǎn)錄因子（如GATA3、T-bet等）以及信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如STAT6、NF-κB等）的表達(dá)變化，探討它們?cè)谛奉愡^敏中的作用機(jī)制。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離和培養(yǎng)小鼠的脾臟細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，在體外給予蟹類過敏原刺激，進(jìn)一步研究免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化情況，以及免疫因子的分泌規(guī)律，從細(xì)胞和分子水平揭示蟹類過敏的致敏機(jī)制。低致敏性蟹類產(chǎn)品的開發(fā)研究：針對(duì)蟹類過敏原的特性，采用物理、化學(xué)和生物等多種處理方法，如熱加工、酶解、發(fā)酵等，對(duì)蟹類原料進(jìn)行處理，降低其過敏原性。利用構(gòu)建的小鼠模型，評(píng)估不同處理方法對(duì)蟹類過敏原致敏性的影響，通過檢測(cè)小鼠的過敏癥狀、血清抗體水平、免疫細(xì)胞變化等指標(biāo)，篩選出效果最佳的處理方法和工藝條件。對(duì)處理后的蟹類產(chǎn)品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分、風(fēng)味品質(zhì)等方面的分析，確保在降低過敏原性的同時(shí)，不影響產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用品質(zhì)，為開發(fā)低致敏性的蟹類產(chǎn)品提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，以確保研究目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：蟹類過敏原的提取與純化：選取新鮮的中華絨螯蟹、鋸緣青蟹等蟹類樣本，去除外殼和內(nèi)臟，取蟹肉和蟹黃組織。將組織剪碎后，加入適量的磷酸鹽緩沖液（PBS），在冰浴條件下進(jìn)行勻漿處理。勻漿液經(jīng)離心后，取上清液作為粗提液。采用等電點(diǎn)沉淀法，根據(jù)蟹類過敏原的等電點(diǎn)特性，調(diào)節(jié)粗提液的pH值，使過敏原蛋白沉淀析出。將沉淀溶解于適量的PBS中，再用硫酸銨鹽析法進(jìn)一步分離過敏原蛋白。通過調(diào)整硫酸銨的飽和度，使不同的蛋白質(zhì)分步沉淀，收集含有過敏原的沉淀部分。采用凝膠過濾層析、離子交換層析等柱層析技術(shù)對(duì)鹽析后的蛋白進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)，得到高純度的蟹類過敏原蛋白。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析純化后過敏原蛋白的分子量，通過免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用特異性抗體鑒定過敏原的種類。BALB/c小鼠蟹類過敏模型的構(gòu)建：選取6-8周齡的健康雌性BALB/c小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組若干只。實(shí)驗(yàn)組小鼠采用腹腔注射和灌胃兩種方式進(jìn)行致敏。腹腔注射組小鼠每次給予一定劑量的蟹類過敏原與弗氏完全佐劑（初次致敏）或弗氏不完全佐劑（后續(xù)致敏）的混合液，注射體積為每只小鼠0.2mL，每周注射一次，共注射4-6次。灌胃組小鼠每次給予一定劑量的蟹類過敏原溶液，灌胃體積為每只小鼠0.2mL，每周灌胃2-3次，共灌胃8-10次。對(duì)照組小鼠給予等量的生理鹽水，注射或灌胃方式與實(shí)驗(yàn)組相同。在每次致敏后，密切觀察小鼠的過敏癥狀，包括皮膚瘙癢、搔抓次數(shù)、呼吸頻率、腹瀉情況等，并按照標(biāo)準(zhǔn)的過敏癥狀評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分。模型的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證：在末次致敏后的特定時(shí)間點(diǎn)，采集小鼠的血液樣本，分離血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中特異性IgE、IgG1、IgG2a抗體的水平。具體操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算抗體含量。收集小鼠的糞便樣本，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)檢測(cè)糞便中組胺的含量，分析組胺水平與過敏癥狀之間的關(guān)系。取小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)組織，制備單細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中Th2細(xì)胞（CD4+IL-4+）、Th17細(xì)胞（CD4+IL-17+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+Foxp3+）等免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例變化，了解免疫細(xì)胞在過敏反應(yīng)中的動(dòng)態(tài)變化。蟹類過敏致敏機(jī)制的研究：提取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)過敏反應(yīng)過程中相關(guān)免疫因子（如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等）、轉(zhuǎn)錄因子（如GATA3、T-bet等）以及信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如STAT6、NF-κB等）的mRNA表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參基因，通過比較Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。提取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)上述免疫因子、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育等步驟，最后利用化學(xué)發(fā)光法顯影，分析蛋白條帶的灰度值，確定蛋白表達(dá)量的變化。分離和培養(yǎng)小鼠的脾臟細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，在體外給予蟹類過敏原刺激，培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA或細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)免疫因子的分泌情況。同時(shí)，利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）檢測(cè)免疫細(xì)胞的增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)分析免疫細(xì)胞的活化和分化情況。低致敏性蟹類產(chǎn)品的開發(fā)研究：采用熱加工（如蒸煮、烘焙）、酶解（如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶）、發(fā)酵（如乳酸菌發(fā)酵）等處理方法對(duì)蟹類原料進(jìn)行處理，改變過敏原的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，降低其過敏原性。將處理后的蟹類樣品制成勻漿，按照上述小鼠過敏模型的構(gòu)建方法，對(duì)小鼠進(jìn)行致敏和激發(fā)，觀察小鼠的過敏癥狀，并檢測(cè)血清抗體水平、免疫細(xì)胞變化等指標(biāo)，評(píng)估不同處理方法對(duì)蟹類過敏原致敏性的影響。采用正交試驗(yàn)等方法優(yōu)化處理工藝條件，篩選出效果最佳的處理方法和工藝參數(shù)組合。對(duì)處理后的低致敏性蟹類產(chǎn)品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析，包括蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等含量的測(cè)定，同時(shí)采用感官評(píng)價(jià)、質(zhì)構(gòu)分析、風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)等方法對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保產(chǎn)品在降低過敏原性的同時(shí)，保持良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用品質(zhì)。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：蟹類過敏原提取與純化：選取蟹類樣本，處理組織后勻漿離心獲取粗提液，經(jīng)等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析和柱層析純化，再用SDS和Westernblot鑒定。BALB/c小鼠過敏模型構(gòu)建：選小鼠分組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射或灌胃蟹類過敏原與佐劑混合液，對(duì)照組用生理鹽水，觀察并記錄過敏癥狀評(píng)分。模型評(píng)價(jià)與驗(yàn)證：采血測(cè)血清抗體，收集糞便測(cè)組胺，取組織制單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)免疫細(xì)胞。致敏機(jī)制研究：提取細(xì)胞RNA和蛋白，用RT-PCR和Westernblot測(cè)相關(guān)分子表達(dá)，體外培養(yǎng)細(xì)胞并刺激，檢測(cè)免疫因子和細(xì)胞增殖、活化、分化情況。低致敏產(chǎn)品開發(fā)：用多種方法處理蟹類原料，構(gòu)建小鼠模型評(píng)估致敏性，優(yōu)化工藝，分析產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味品質(zhì)。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]圖1-1技術(shù)路線圖二、BALB/c小鼠與蟹類過敏原相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1BALB/c小鼠特性與應(yīng)用BALB/c小鼠是一種在生命科學(xué)研究中應(yīng)用極為廣泛的近交系小鼠，其起源可追溯到1913年，H.Bagg博士獲得白化原種，隨后在1923年由MacDowcll通過近交培育而成。經(jīng)過多年的繁衍和培育，BALB/c小鼠形成了許多穩(wěn)定的亞系，如BALB/cAnN、BALB/cJ、BALB/cCd等。這些亞系在遺傳特性、生物學(xué)特性等方面具有高度的一致性和穩(wěn)定性，為科學(xué)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。從生物學(xué)特性來看，BALB/c小鼠毛色為白色，這一特征使其在實(shí)驗(yàn)觀察中易于識(shí)別和區(qū)分。其體型相對(duì)較小，成年小鼠體重一般在20-30g之間，這種小巧的體型便于實(shí)驗(yàn)操作和飼養(yǎng)管理。BALB/c小鼠生長(zhǎng)發(fā)育迅速，出生后3-4周即可斷奶，6-8周達(dá)到性成熟，性周期為4-5天，妊娠期約為19-21天，每胎產(chǎn)仔數(shù)通常為6-10只，繁殖力較強(qiáng)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物數(shù)量的需求。此外，BALB/c小鼠的壽命一般在1.5-2.5年，在這期間，其生理和病理變化相對(duì)穩(wěn)定，有利于進(jìn)行長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀察和研究。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，BALB/c小鼠具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。其免疫反應(yīng)敏感且穩(wěn)定，能夠?qū)Χ喾N抗原產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。這使得BALB/c小鼠成為研究免疫機(jī)制、開發(fā)和評(píng)估疫苗以及篩選免疫調(diào)節(jié)藥物的理想動(dòng)物模型。在研究腫瘤免疫時(shí)，BALB/c小鼠對(duì)某些致癌因子高度敏感，容易誘發(fā)腫瘤，可用于構(gòu)建腫瘤模型，研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及免疫治療效果。在感染性疾病的研究中，BALB/c小鼠對(duì)多種病原體易感，如細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，可用于研究感染過程中的免疫反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)抗感染藥物和疫苗提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在自身免疫性疾病的研究方面，BALB/c小鼠可通過特定的誘導(dǎo)方法，建立如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病模型，有助于深入了解這些疾病的發(fā)病機(jī)制和探索治療方法。在單克隆抗體制備中，BALB/c小鼠更是發(fā)揮了不可或缺的作用。由于其免疫系統(tǒng)的特殊性，BALB/c小鼠在受到抗原刺激后，能夠產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體。將免疫后的BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，可獲得既能無限增殖又能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，從而制備出大量高純度、高特異性的單克隆抗體。這些單克隆抗體在疾病診斷、治療以及生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。BALB/c小鼠憑借其獨(dú)特的生物學(xué)特性和在免疫學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)，為生命科學(xué)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具，在眾多研究領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用，推動(dòng)了科學(xué)研究的不斷發(fā)展和進(jìn)步。2.2蟹類過敏原概述蟹類過敏原是引發(fā)蟹類過敏反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其種類繁多，成分復(fù)雜。目前研究表明，蟹類中含有多種過敏原，這些過敏原在結(jié)構(gòu)、特性和致敏原理上各有特點(diǎn)，共同影響著蟹類過敏的發(fā)生和發(fā)展。原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是蟹類中最為重要的過敏原之一。它是一種廣泛存在于肌肉組織中的酸性糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為36-40kDa。原肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由兩個(gè)相互纏繞的α-螺旋多肽鏈形成超螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使其具有較高的穩(wěn)定性，且在不同物種間具有高度的保守性。研究發(fā)現(xiàn)，不同蟹類的原肌球蛋白氨基酸序列相似性較高，這也是其能夠引發(fā)廣泛過敏反應(yīng)的原因之一。例如，中華絨螯蟹、鋸緣青蟹和三疣梭子蟹等常見經(jīng)濟(jì)蟹類的原肌球蛋白在結(jié)構(gòu)和序列上具有明顯的相似性。原肌球蛋白的致敏原理主要是通過與機(jī)體免疫系統(tǒng)中的IgE抗體特異性結(jié)合，激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，導(dǎo)致它們釋放組胺、白三烯等生物活性介質(zhì)，從而引發(fā)過敏癥狀。在一項(xiàng)針對(duì)蟹類過敏患者的研究中，發(fā)現(xiàn)大部分患者血清中的IgE抗體能夠與原肌球蛋白發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了原肌球蛋白在蟹類過敏中的關(guān)鍵作用。精氨酸激酶（Argininekinase，AK）也是蟹類的主要過敏原之一。它是一種參與能量代謝的酶，相對(duì)分子質(zhì)量約為40-45kDa。精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，具有獨(dú)特的空間構(gòu)象。與原肌球蛋白不同，精氨酸激酶的結(jié)構(gòu)在不同蟹類中存在一定的差異，但其致敏活性位點(diǎn)相對(duì)保守。研究表明，精氨酸激酶能夠通過其特定的結(jié)構(gòu)域與IgE抗體結(jié)合，啟動(dòng)過敏反應(yīng)的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。在對(duì)鋸緣青蟹精氨酸激酶的研究中，發(fā)現(xiàn)其致敏活性位點(diǎn)主要集中在分子表面的特定區(qū)域，這些區(qū)域能夠與IgE抗體高親和力結(jié)合，從而引發(fā)過敏反應(yīng)。除了原肌球蛋白和精氨酸激酶外，蟹類中還存在其他一些過敏原，如肌鈣蛋白、血藍(lán)蛋白等。肌鈣蛋白是一種與肌肉收縮調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)，它在蟹類過敏中也起到一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，部分蟹類過敏患者的血清能夠與肌鈣蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，提示肌鈣蛋白可能是蟹類的次要過敏原之一。血藍(lán)蛋白是一種含有銅離子的呼吸蛋白，雖然其在蟹類過敏中的作用機(jī)制尚未完全明確，但已有研究表明，血藍(lán)蛋白可能通過激活免疫系統(tǒng)中的某些細(xì)胞因子，參與蟹類過敏的發(fā)生過程。不同蟹類過敏原之間還存在交叉反應(yīng)性。由于一些過敏原在結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上具有相似性，它們可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相同或相似的IgE抗體，從而導(dǎo)致對(duì)不同蟹類甚至其他甲殼類動(dòng)物的交叉過敏反應(yīng)。對(duì)蝦和蟹的原肌球蛋白在結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性，因此對(duì)蝦過敏的患者也有較大可能對(duì)蟹類過敏。這種交叉反應(yīng)性增加了蟹類過敏診斷和治療的復(fù)雜性，也對(duì)過敏患者的飲食管理提出了更高的要求。2.3過敏反應(yīng)機(jī)制蟹類過敏屬于IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，其發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)免疫細(xì)胞和分子的復(fù)雜相互作用。當(dāng)過敏體質(zhì)的個(gè)體首次接觸蟹類過敏原時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)將其識(shí)別為外來的有害物質(zhì)，并啟動(dòng)免疫應(yīng)答?？乖蔬f細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）攝取、加工和處理蟹類過敏原，然后將抗原肽-MHC復(fù)合物呈遞給初始T細(xì)胞，激活初始T細(xì)胞。在細(xì)胞因子的作用下，初始T細(xì)胞分化為輔助性T細(xì)胞2（Th2）。Th2細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素5（IL-5）、白細(xì)胞介素13（IL-13）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用。IL-4能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換，使其產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。IL-5則主要作用于嗜酸性粒細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化和活化，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的功能。IL-13可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)黏液分泌，增加氣道高反應(yīng)性。當(dāng)致敏個(gè)體再次接觸相同的蟹類過敏原時(shí)，過敏原會(huì)與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE抗體特異性結(jié)合，使IgE受體發(fā)生交聯(lián)，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。這導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，促使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放出組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等生物活性介質(zhì)。組胺能夠引起血管擴(kuò)張、通透性增加，導(dǎo)致皮膚紅斑、風(fēng)團(tuán)等癥狀；刺激神經(jīng)末梢，引起皮膚瘙癢、呼吸道和胃腸道的不適；還能使支氣管平滑肌收縮，導(dǎo)致呼吸困難。白三烯具有強(qiáng)烈的收縮支氣管平滑肌作用，可導(dǎo)致氣道狹窄，加重呼吸困難；同時(shí)還能增加血管通透性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些生物活性介質(zhì)共同作用，引發(fā)了一系列過敏癥狀，如皮膚瘙癢、紅斑、風(fēng)團(tuán)，呼吸道的鼻癢、鼻塞、流涕、打噴嚏、咳嗽、喘息、呼吸困難，胃腸道的惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致過敏性休克。Th1/Th2細(xì)胞失衡在蟹類過敏的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，機(jī)體的Th1和Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，Th1細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，參與抗病毒、抗細(xì)菌感染等免疫反應(yīng)，分泌干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（IL-2）等細(xì)胞因子。Th2細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，參與抗寄生蟲感染和過敏反應(yīng)，分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子。在蟹類過敏過程中，機(jī)體的免疫反應(yīng)向Th2細(xì)胞偏移，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡。Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子增多，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，引發(fā)過敏反應(yīng)。而Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子可以抑制Th2細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫平衡。當(dāng)Th1/Th2細(xì)胞失衡時(shí)，IFN-γ的分泌減少，無法有效抑制Th2細(xì)胞的功能，使得過敏反應(yīng)得以持續(xù)發(fā)展。研究表明，通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，增加Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，有望成為治療蟹類過敏的新策略。三、蟹類過敏原的分離與純化3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器本實(shí)驗(yàn)所選用的蟹類為中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis），均購(gòu)自當(dāng)?shù)卣?guī)水產(chǎn)市場(chǎng)。選取體型健壯、活力良好、體重在100-150g左右的中華絨螯蟹，確保其新鮮度和品質(zhì)。這些蟹類在實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱中，水溫控制在20-22℃，水質(zhì)保持清潔，每日投喂適量的新鮮魚蝦，以維持其生命活動(dòng)和生理狀態(tài)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自知名實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。小鼠體重在18-22g之間，遺傳背景清晰，健康狀況良好。小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度保持在50-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)。給予小鼠標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和無菌飲用水，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括：弗氏完全佐劑（Freund'sCompleteAdjuvant，F(xiàn)CA）和弗氏不完全佐劑（Freund'sIncompleteAdjuvant，F(xiàn)IA），購(gòu)自Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline，PBS），pH值為7.4，由實(shí)驗(yàn)室自行配制；硫酸銨（分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylSulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺等電泳相關(guān)試劑，均購(gòu)自Sigma公司；兔抗中華絨螯蟹原肌球蛋白抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備；辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司；ELISA試劑盒，用于檢測(cè)小鼠血清中特異性IgE、IgG1、IgG2a抗體，購(gòu)自R&DSystems公司；其他常規(guī)試劑如鹽酸、氫氧化鈉、乙醇等，均為分析純，購(gòu)自當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)試劑供應(yīng)商。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器有：高速冷凍離心機(jī)（ThermoFisherScientific公司），用于離心分離蛋白質(zhì)溶液；電泳儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)電泳分析；垂直電泳槽（Bio-Rad公司），配合電泳儀進(jìn)行蛋白質(zhì)分離；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和記錄電泳結(jié)果；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于ELISA實(shí)驗(yàn)中吸光度值的測(cè)定；超低溫冰箱（ThermoFisherScientific公司），用于保存試劑和樣品；電子天平（Sartorius公司），用于稱量試劑和樣品；恒溫振蕩器（ThermoFisherScientific公司），用于樣品的振蕩混勻；細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于分析免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例。3.2鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）的純化將新鮮鋸緣青蟹洗凈，去除外殼、內(nèi)臟及雜質(zhì)，取蟹肉部分。將蟹肉剪碎后，按照1:5（g/mL）的比例加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），在冰浴條件下用組織勻漿器進(jìn)行勻漿處理，使蟹肉組織充分破碎，釋放出其中的蛋白質(zhì)。勻漿液在4℃、12000r/min的條件下離心30min，以去除組織殘?jiān)筒蝗苄噪s質(zhì)，得到的上清液即為粗提液。利用原肌球蛋白等電點(diǎn)的特性進(jìn)行初步分離。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，原肌球蛋白的等電點(diǎn)約為4.5。將粗提液置于磁力攪拌器上，在冰浴條件下緩慢攪拌，同時(shí)用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。在等電點(diǎn)附近，原肌球蛋白的溶解度降低，會(huì)逐漸沉淀析出。調(diào)節(jié)pH值后，繼續(xù)攪拌30min，使沉淀反應(yīng)充分進(jìn)行。然后將溶液在4℃、12000r/min的條件下離心20min，收集沉淀，該沉淀即為初步富集原肌球蛋白的組分。向等電點(diǎn)沉淀得到的沉淀中加入適量的PBS（pH7.4），使沉淀充分溶解。采用硫酸銨鹽析法進(jìn)一步分離原肌球蛋白。在冰浴條件下，向溶解后的蛋白溶液中緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨充分溶解。根據(jù)硫酸銨飽和度與蛋白質(zhì)沉淀的關(guān)系，逐漸將硫酸銨飽和度提高到60%。加入硫酸銨后，繼續(xù)攪拌2h，使蛋白質(zhì)充分沉淀。隨后在4℃、12000r/min的條件下離心30min，收集沉淀，該沉淀中含有較高純度的原肌球蛋白。將硫酸銨鹽析得到的沉淀用適量的PBS（pH7.4）溶解，裝入透析袋中，在4℃條件下對(duì)PBS進(jìn)行透析，以去除殘留的硫酸銨。透析過程中，每隔4h更換一次透析液，共透析24h，確保硫酸銨被徹底去除。為進(jìn)一步去除雜蛋白，對(duì)透析后的蛋白溶液進(jìn)行加熱處理。將蛋白溶液置于恒溫水浴鍋中，在80℃條件下加熱15min。由于原肌球蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性，在該溫度下不會(huì)發(fā)生變性，而大部分雜蛋白會(huì)因受熱變性而沉淀。加熱結(jié)束后，迅速將溶液置于冰浴中冷卻，然后在4℃、12000r/min的條件下離心20min，去除沉淀，得到的上清液即為純化后的鋸緣青蟹原肌球蛋白溶液。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對(duì)純化后的鋸緣青蟹原肌球蛋白進(jìn)行鑒定。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將純化后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5min，使蛋白質(zhì)充分變性。取適量變性后的樣品加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在恒壓120V的條件下進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間約為2-3h，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1-2h，然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰。觀察凝膠上蛋白條帶的位置和數(shù)量，與Marker對(duì)比，確定純化后蛋白的分子量。結(jié)果顯示，在分子量約38kDa處出現(xiàn)一條清晰且單一的蛋白條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道的鋸緣青蟹原肌球蛋白分子量相符，表明純化后的蛋白為原肌球蛋白，且純度較高。利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證純化后蛋白的特異性。將SDS分離后的蛋白通過半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜條件為恒流250mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。然后將膜與兔抗中華絨螯蟹原肌球蛋白抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。再將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋）在室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。最后采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在分子量約38kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的原肌球蛋白分子量一致，表明純化得到的蛋白確實(shí)為鋸緣青蟹原肌球蛋白，且該蛋白能夠與特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，具有良好的免疫活性。3.3鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）的純化取新鮮鋸緣青蟹，按前文相同的方式處理，獲取蟹肉粗提液。將粗提液在4℃、12000r/min的條件下離心30min，去除沉淀，保留上清液。向上清液中緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨充分溶解，逐步將硫酸銨飽和度提高到70%。在4℃條件下攪拌2h，然后在4℃、12000r/min的條件下離心30min，收集沉淀。向沉淀中加入適量的PBS（pH7.4），使沉淀溶解，再加入固體硫酸銨，將硫酸銨飽和度提高到90%，繼續(xù)在4℃條件下攪拌2h，隨后在4℃、12000r/min的條件下離心30min，收集沉淀，此沉淀即為經(jīng)70%-90%硫酸銨鹽析初步純化的精氨酸激酶。將70%-90%硫酸銨鹽析得到的沉淀用適量的PBS（pH7.4）溶解后，進(jìn)行HiTrap-Q柱層析進(jìn)一步純化。HiTrap-Q柱為強(qiáng)陰離子交換柱，預(yù)先用PBS（pH7.4）平衡。將溶解后的蛋白樣品上樣到平衡好的HiTrap-Q柱上，用PBS（pH7.4）洗脫未結(jié)合的雜質(zhì)，然后用含有0-1mol/LNaCl的PBS（pH7.4）進(jìn)行線性梯度洗脫，收集洗脫峰。根據(jù)蛋白的洗脫特性，精氨酸激酶會(huì)在特定的NaCl濃度下被洗脫下來。收集HiTrap-Q柱層析的洗脫峰，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析各洗脫峰的蛋白組成。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。取適量變性后的樣品加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在恒壓120V的條件下進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間約為2-3h，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1-2h，然后用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰。觀察凝膠上蛋白條帶的位置和數(shù)量，與Marker對(duì)比，確定精氨酸激酶所在的洗脫峰。結(jié)果顯示，在分子量約40kDa處出現(xiàn)一條清晰且較純的蛋白條帶，初步判斷該條帶為精氨酸激酶。為進(jìn)一步確認(rèn)純化后的蛋白為精氨酸激酶，利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。將SDS分離后的蛋白通過半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜條件為恒流250mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約1-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。然后將膜與兔抗白蝦精氨酸激酶抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。再將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋）在室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。最后采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在分子量約40kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的精氨酸激酶分子量一致，表明純化得到的蛋白確實(shí)為鋸緣青蟹精氨酸激酶，且該蛋白能夠與特異性抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，具有良好的免疫活性。四、BALB/c小鼠過敏模型的建立4.1建模方法選擇在構(gòu)建BALB/c小鼠蟹類過敏模型時(shí)，建模方法的選擇至關(guān)重要，它直接影響到模型的穩(wěn)定性、可靠性以及與人類過敏反應(yīng)的相似程度。目前，常用的建模方法包括灌胃、腹腔注射和皮下注射等，每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)缺點(diǎn)。灌胃是一種較為常見的建模方式，它模擬了人類通過飲食攝入過敏原的自然途徑。通過將蟹類過敏原溶液直接灌入小鼠胃內(nèi)，使過敏原與胃腸道黏膜接觸，引發(fā)免疫反應(yīng)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)小鼠的創(chuàng)傷較小，且能夠較好地模擬食物過敏的實(shí)際發(fā)生過程。灌胃時(shí)只需使用灌胃針將過敏原溶液緩慢注入小鼠胃中，不需要復(fù)雜的手術(shù)操作。灌胃方式也存在一些不足之處。由于胃腸道的消化和吸收功能，部分過敏原可能在胃腸道內(nèi)被降解或吸收不完全，導(dǎo)致進(jìn)入血液循環(huán)的過敏原量不穩(wěn)定，從而影響過敏反應(yīng)的強(qiáng)度和一致性。胃腸道內(nèi)的微生物群落和消化酶等因素也可能對(duì)過敏原的免疫原性產(chǎn)生影響，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定性。腹腔注射是將蟹類過敏原與佐劑混合后，直接注入小鼠腹腔。腹腔內(nèi)具有豐富的血管和淋巴管，能夠使過敏原迅速吸收進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠快速有效地使小鼠致敏，過敏癥狀出現(xiàn)較快且較為明顯，實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較短。腹腔注射還可以精確控制過敏原的劑量，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。然而，腹腔注射也有其局限性。它屬于侵入性操作，對(duì)小鼠的創(chuàng)傷較大，可能會(huì)引起小鼠的應(yīng)激反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。腹腔注射還可能導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和感染等并發(fā)癥，增加了實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡率和實(shí)驗(yàn)成本。皮下注射是將過敏原注射到小鼠的皮下組織中。皮下組織含有豐富的免疫細(xì)胞，如朗格漢斯細(xì)胞等，能夠有效攝取和呈遞過敏原，引發(fā)免疫反應(yīng)。皮下注射的優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)小鼠的損傷較小，且可以在一定程度上模擬過敏原通過皮膚接觸進(jìn)入人體的情況。皮下注射還可以避免胃腸道對(duì)過敏原的降解作用，使過敏原更完整地進(jìn)入免疫系統(tǒng)。但皮下注射也存在一些問題。由于皮下組織的血液循環(huán)相對(duì)較慢，過敏原的吸收速度較慢，可能需要多次注射才能達(dá)到理想的致敏效果，這增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)周期。皮下注射的過敏反應(yīng)強(qiáng)度相對(duì)較弱，可能無法完全模擬人類嚴(yán)重過敏反應(yīng)的情況。綜合考慮以上各種建模方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本研究決定采用腹腔注射和灌胃相結(jié)合的方式來構(gòu)建BALB/c小鼠蟹類過敏模型。腹腔注射能夠快速使小鼠致敏，產(chǎn)生明顯的過敏癥狀，為研究過敏反應(yīng)的早期機(jī)制提供了便利。而灌胃則可以模擬人類自然攝入過敏原的過程，更全面地研究蟹類過敏的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。通過兩種方法的結(jié)合，可以充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)單一方法的不足，從而建立更加穩(wěn)定、可靠且與人類過敏反應(yīng)相似的小鼠模型。在實(shí)驗(yàn)過程中，將分別對(duì)腹腔注射組和灌胃組小鼠進(jìn)行詳細(xì)的觀察和檢測(cè)，比較兩組小鼠在過敏癥狀、免疫指標(biāo)等方面的差異，進(jìn)一步優(yōu)化建模方案，確保模型的有效性和科學(xué)性。4.2TM的BALB/c小鼠模型建立選取6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c小鼠40只，購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。小鼠在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度保持在50-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料和無菌飲用水，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組小鼠采用腹腔注射和灌胃兩種方式進(jìn)行致敏，以建立鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）的BALB/c小鼠過敏模型。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠：初次致敏時(shí)，將純化后的鋸緣青蟹TM與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分混合，制成混合液。其中，TM的濃度為1mg/mL，每只小鼠腹腔注射0.2mL混合液，使小鼠初次接觸過敏原并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。后續(xù)致敏時(shí)，將TM與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比混合，同樣制成濃度為1mg/mL的混合液，每只小鼠腹腔注射0.2mL，每周注射一次，共注射5次。注射時(shí)，右手持1mL注射器，配合4號(hào)針頭，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個(gè)手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官會(huì)自然倒向胸部，可防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。進(jìn)針動(dòng)作要輕柔，從腹部一側(cè)進(jìn)針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠：將純化后的鋸緣青蟹TM溶解于無菌生理鹽水中，配制成濃度為2mg/mL的TM溶液。每次灌胃時(shí)，用1mL注射器配灌胃針頭，吸取0.2mL的TM溶液。灌胃針頭從小鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后會(huì)有一個(gè)刺空感，此時(shí)即可推注藥液。為了確保藥液能夠順利進(jìn)入小鼠體內(nèi)，且避免對(duì)小鼠造成傷害，操作過程中要保持小鼠的頭部和頸部成一直線，動(dòng)作輕柔。每周灌胃3次，共灌胃10次。對(duì)照組小鼠：給予等量的生理鹽水，注射或灌胃方式與實(shí)驗(yàn)組相同。在每次致敏后，密切觀察小鼠的過敏癥狀，包括皮膚瘙癢、搔抓次數(shù)、呼吸頻率、腹瀉情況等，并按照標(biāo)準(zhǔn)的過敏癥狀評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分。若小鼠出現(xiàn)連續(xù)搔抓動(dòng)作、呼吸急促、腹瀉等癥狀，則表明過敏反應(yīng)發(fā)生，根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度給予相應(yīng)的評(píng)分。例如，輕微搔抓記1分，頻繁搔抓且伴有呼吸稍急促記2分，出現(xiàn)明顯腹瀉、呼吸嚴(yán)重急促甚至抽搐等癥狀記3分。通過對(duì)小鼠過敏癥狀的觀察和評(píng)分，初步判斷模型的建立情況，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。4.3AK的BALB/c小鼠模型建立選取與前文相同條件的6-8周齡、體重18-22g的雌性BALB/c小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組20只。本實(shí)驗(yàn)僅采用腹腔注射方式建立鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）的BALB/c小鼠過敏模型，原因在于前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)表明，腹腔注射能使過敏原迅速進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)更強(qiáng)烈且穩(wěn)定的免疫反應(yīng)，對(duì)于研究AK的致敏機(jī)制具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能更有效地模擬過敏反應(yīng)過程。實(shí)驗(yàn)組小鼠初次致敏時(shí)，將純化后的鋸緣青蟹AK與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分混合，配制成AK濃度為1mg/mL的混合液。使用1mL注射器配合4號(hào)針頭，每只小鼠腹腔注射0.2mL該混合液。注射時(shí)，嚴(yán)格遵循腹腔注射的規(guī)范操作流程，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個(gè)手指抓住小鼠的頸部，使小鼠頭部向下，這樣腹腔中的器官會(huì)自然倒向胸部，可有效防止注射器刺入時(shí)損傷大腸、小腸等器官。進(jìn)針動(dòng)作輕柔，從腹部一側(cè)進(jìn)針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。后續(xù)致敏時(shí)，將AK與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比混合，制成同樣濃度為1mg/mL的混合液，每只小鼠腹腔注射0.2mL，每周注射一次，共注射5次。對(duì)照組小鼠則給予等量的生理鹽水，注射方式與實(shí)驗(yàn)組完全相同。在每次致敏后，密切觀察小鼠的過敏癥狀，包括皮膚是否出現(xiàn)紅斑、風(fēng)團(tuán)，是否有頻繁搔抓動(dòng)作，呼吸是否急促，有無腹瀉等情況，并按照標(biāo)準(zhǔn)的過敏癥狀評(píng)分表進(jìn)行評(píng)分。如小鼠出現(xiàn)連續(xù)搔抓動(dòng)作、呼吸急促、腹瀉等癥狀，則表明過敏反應(yīng)發(fā)生，根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度給予相應(yīng)的評(píng)分。例如，輕微搔抓記1分，頻繁搔抓且伴有呼吸稍急促記2分，出現(xiàn)明顯腹瀉、呼吸嚴(yán)重急促甚至抽搐等癥狀記3分。通過對(duì)小鼠過敏癥狀的細(xì)致觀察和準(zhǔn)確評(píng)分，為判斷AK的致敏性以及模型的建立效果提供重要依據(jù)。4.4模型對(duì)照組設(shè)置在本研究中，為了準(zhǔn)確評(píng)估蟹類過敏原對(duì)BALB/c小鼠的致敏作用，科學(xué)地驗(yàn)證模型的有效性，設(shè)置了陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組選取與實(shí)驗(yàn)組相同條件的BALB/c小鼠，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，給予這些小鼠等量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射或灌胃，注射或灌胃的頻率和體積與實(shí)驗(yàn)組完全一致。陰性對(duì)照組的設(shè)置至關(guān)重要，它可以排除實(shí)驗(yàn)過程中其他非過敏原因素對(duì)小鼠生理狀態(tài)和免疫反應(yīng)的影響。通過與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，能夠清晰地判斷出小鼠出現(xiàn)的過敏癥狀以及各項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化是否是由蟹類過敏原引起的。若實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)了明顯的過敏癥狀，而陰性對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)任何異常，這就有力地證明了實(shí)驗(yàn)組小鼠的過敏反應(yīng)是由蟹類過敏原所引發(fā)，而非其他因素干擾。陽(yáng)性對(duì)照組同樣選用BALB/c小鼠，給予其已知的、能夠引發(fā)強(qiáng)烈過敏反應(yīng)的過敏原進(jìn)行致敏，本研究中選擇卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）作為陽(yáng)性對(duì)照過敏原。OVA是一種廣泛應(yīng)用于食物過敏研究的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，其致敏機(jī)制和免疫反應(yīng)特征已被深入研究。以O(shè)VA作為陽(yáng)性對(duì)照，能夠驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)的敏感性和可靠性。如果陽(yáng)性對(duì)照組小鼠在給予OVA致敏后，出現(xiàn)了典型的過敏癥狀，如皮膚瘙癢、紅斑、呼吸急促等，同時(shí)血清中特異性IgE、IgG1等抗體水平顯著升高，免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例也發(fā)生了相應(yīng)的變化，這就表明本實(shí)驗(yàn)所采用的建模方法、檢測(cè)手段以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等均符合要求，能夠有效地檢測(cè)出過敏反應(yīng)的發(fā)生。通過與陽(yáng)性對(duì)照組的比較，還可以評(píng)估蟹類過敏原的致敏強(qiáng)度和特點(diǎn)。若蟹類過敏原致敏的實(shí)驗(yàn)組小鼠在過敏癥狀的嚴(yán)重程度、免疫指標(biāo)的變化幅度等方面與陽(yáng)性對(duì)照組存在差異，就可以進(jìn)一步分析這些差異產(chǎn)生的原因，深入了解蟹類過敏的獨(dú)特機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相同的觀察和檢測(cè)，包括過敏癥狀評(píng)分、血清抗體水平檢測(cè)、糞便組胺含量檢測(cè)以及免疫細(xì)胞分析等。每周對(duì)小鼠的過敏癥狀進(jìn)行詳細(xì)記錄和評(píng)分，在末次致敏后的特定時(shí)間點(diǎn)采集小鼠的血液、糞便和組織樣本，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。通過對(duì)這些數(shù)據(jù)的綜合分析，能夠更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)蟹類過敏原的致敏性，為后續(xù)的研究提供可靠的依據(jù)。五、模型的評(píng)價(jià)與分析5.1過敏癥狀觀察與評(píng)分為了準(zhǔn)確評(píng)估BALB/c小鼠在致敏過程中出現(xiàn)的過敏癥狀，本研究制定了詳細(xì)的過敏癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：過敏癥狀評(píng)分皮膚瘙癢（搔抓次數(shù)）無搔抓：0分偶爾搔抓（1-5次/5min）：1分頻繁搔抓（6-10次/5min）：2分持續(xù)搔抓（>10次/5min）：3分呼吸頻率正常：0分稍加快（較正常增加10-20%）：1分明顯加快（較正常增加20-50%）：2分急促且困難（較正常增加>50%）：3分腹瀉情況無腹瀉：0分輕度腹瀉（糞便稍軟，不成形）：1分中度腹瀉（糞便稀軟，呈糊狀）：2分重度腹瀉（水樣便）：3分皮膚紅斑、風(fēng)團(tuán)無：0分局部少量紅斑（面積<10%體表面積）：1分較多紅斑及少量風(fēng)團(tuán)（面積10-30%體表面積）：2分大面積紅斑及風(fēng)團(tuán)（面積>30%體表面積）：3分在每次致敏后的特定時(shí)間點(diǎn)（如30min、1h、2h等），對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的過敏癥狀進(jìn)行細(xì)致觀察和記錄，并按照上述評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。觀察過程中，將小鼠放置在透明的觀察箱中，保持環(huán)境安靜，避免外界因素干擾，以確保觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用視頻記錄的方式，對(duì)小鼠的行為進(jìn)行全程記錄，以便后續(xù)分析和核對(duì)評(píng)分。在鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠在初次致敏后，部分小鼠在30min內(nèi)就出現(xiàn)了輕微的皮膚瘙癢癥狀，表現(xiàn)為偶爾搔抓，評(píng)分1分。隨著致敏次數(shù)的增加，過敏癥狀逐漸加重，在第3次致敏后，多數(shù)小鼠出現(xiàn)頻繁搔抓，呼吸頻率稍加快，部分小鼠還出現(xiàn)了輕度腹瀉，評(píng)分達(dá)到2-3分。在末次致敏后，小鼠的過敏癥狀最為明顯，出現(xiàn)大面積皮膚紅斑、風(fēng)團(tuán)，呼吸急促困難，重度腹瀉等癥狀，評(píng)分普遍為3分。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠的過敏癥狀出現(xiàn)相對(duì)較晚，在第2次灌胃后才出現(xiàn)輕微的過敏癥狀，表現(xiàn)為偶爾搔抓，糞便稍軟，評(píng)分1分。隨著灌胃次數(shù)的增加，過敏癥狀逐漸加重，但整體癥狀程度較腹腔注射組輕。在末次致敏后，小鼠主要表現(xiàn)為較多紅斑及少量風(fēng)團(tuán)，頻繁搔抓，中度腹瀉，呼吸頻率明顯加快，評(píng)分多為2分。而對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，未出現(xiàn)明顯的過敏癥狀，各項(xiàng)評(píng)分均為0分。在鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠在初次致敏后，約1h左右開始出現(xiàn)過敏癥狀，主要表現(xiàn)為皮膚瘙癢，偶爾搔抓，評(píng)分1分。后續(xù)致敏過程中，過敏癥狀逐漸加劇，在第3次致敏后，多數(shù)小鼠出現(xiàn)頻繁搔抓，皮膚出現(xiàn)局部少量紅斑，呼吸稍加快，評(píng)分2分。末次致敏后，小鼠出現(xiàn)較多紅斑及風(fēng)團(tuán)，呼吸急促，部分小鼠出現(xiàn)中度腹瀉，評(píng)分多為2-3分。對(duì)照組小鼠同樣未出現(xiàn)任何過敏癥狀，評(píng)分始終為0分。通過對(duì)小鼠過敏癥狀的觀察和評(píng)分，直觀地反映了蟹類過敏原對(duì)小鼠的致敏效果。不同致敏方式和不同過敏原導(dǎo)致的過敏癥狀在出現(xiàn)時(shí)間、嚴(yán)重程度等方面存在差異，這些差異為進(jìn)一步分析蟹類過敏的機(jī)制以及評(píng)價(jià)不同建模方法的優(yōu)劣提供了重要依據(jù)。5.2糞便組胺檢測(cè)糞便組胺檢測(cè)是評(píng)估蟹類過敏模型的重要指標(biāo)之一，其原理基于組胺在過敏反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。在蟹類過敏反應(yīng)中，當(dāng)機(jī)體再次接觸蟹類過敏原時(shí)，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞會(huì)發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，釋放出組胺等生物活性介質(zhì)。這些組胺一部分會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身性的過敏癥狀；另一部分則會(huì)通過腸道黏膜進(jìn)入腸道，隨糞便排出體外。因此，檢測(cè)糞便中組胺的含量，可以間接反映機(jī)體過敏反應(yīng)的強(qiáng)度。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)對(duì)小鼠糞便中的組胺含量進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟如下：在末次致敏后的第3天，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的新鮮糞便樣本，每只小鼠收集約0.1-0.2g糞便，將其置于無菌離心管中，迅速放入-80℃冰箱冷凍保存，以防止組胺降解。在檢測(cè)前，將糞便樣本從冰箱中取出，室溫解凍后，加入適量的預(yù)冷的5%高氯酸溶液，按照1:5（g/mL）的比例進(jìn)行勻漿處理，使糞便充分破碎，釋放出其中的組胺。勻漿液在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入適量的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.5，使組胺處于游離狀態(tài)。將調(diào)節(jié)pH值后的上清液通過0.22μm的微孔濾膜過濾，去除雜質(zhì)，得到的濾液即為待檢測(cè)的樣品。將待檢測(cè)樣品注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行分析。HPLC條件如下：色譜柱為C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，0-5min，流動(dòng)相B的比例為5%；5-15min，流動(dòng)相B的比例從5%線性增加至30%；15-20min，流動(dòng)相B的比例保持30%；20-25min，流動(dòng)相B的比例從30%線性增加至95%；25-30min，流動(dòng)相B的比例保持95%；30-35min，流動(dòng)相B的比例從95%線性降至5%，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃。質(zhì)譜條件如下：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測(cè)；掃描范圍為m/z50-500；離子源溫度為350℃；噴霧電壓為3.5kV；毛細(xì)管電壓為30V。通過與組胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比，確定樣品中組胺的含量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出具體的濃度。在鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠糞便中組胺含量顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠糞便組胺含量平均值為（6342.68±520.35）nM，而對(duì)照組小鼠糞便組胺含量平均值僅為（120.56±25.48）nM。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠糞便組胺含量也高于對(duì)照組，平均值為（6244.65±480.28）nM，但與腹腔注射組相比，差異不顯著（p>0.05）。在鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便組胺含量同樣顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便組胺含量平均值為（6188.36±450.12）nM，對(duì)照組小鼠糞便組胺含量平均值為（115.48±20.36）nM。糞便組胺檢測(cè)結(jié)果表明，無論是TM還是AK致敏的小鼠，在過敏模型建立后，糞便中組胺含量均顯著升高，這與小鼠的過敏癥狀表現(xiàn)一致，進(jìn)一步證明了過敏模型的成功建立。同時(shí)，通過比較不同致敏方式和不同過敏原致敏小鼠的糞便組胺含量，發(fā)現(xiàn)雖然腹腔注射和灌胃兩種致敏方式導(dǎo)致的糞便組胺含量無顯著差異，但腹腔注射方式在引發(fā)過敏癥狀的強(qiáng)度和一致性上表現(xiàn)更優(yōu)，這為后續(xù)研究蟹類過敏機(jī)制以及評(píng)價(jià)抗過敏藥物和低致敏性食品提供了重要的數(shù)據(jù)支持。5.3血清IgE檢測(cè)血清IgE檢測(cè)是評(píng)估蟹類過敏模型的關(guān)鍵指標(biāo)之一，在蟹類過敏反應(yīng)中，IgE起著核心作用。當(dāng)機(jī)體初次接觸蟹類過敏原后，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生特異性IgE抗體，這些抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE受體結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸相同過敏原時(shí)，過敏原與IgE抗體結(jié)合，引發(fā)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺等生物活性介質(zhì)，導(dǎo)致過敏癥狀的發(fā)生。因此，檢測(cè)血清中特異性IgE抗體的水平，能夠直觀地反映機(jī)體對(duì)蟹類過敏原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，為判斷過敏模型的建立是否成功提供重要依據(jù)。本研究采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中特異性IgE抗體的水平。具體步驟如下：在末次致敏后的第7天，采用摘眼球取血的方法采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的血液樣本，將血液樣本置于無菌離心管中，室溫靜置1-2h，使血液充分凝固。然后在4℃、3000r/min的條件下離心15min，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。?80℃冰箱中取出保存的血清樣本，室溫解凍后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。首先進(jìn)行包被，用包被緩沖液將純化后的鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）或精氨酸激酶（AK）稀釋至最適濃度（5μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20的PBS）洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min，以去除未結(jié)合的抗原。然后進(jìn)行封閉，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉的PBS溶液），37℃孵育2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。接著加樣，將小鼠血清用稀釋緩沖液（含0.05%吐溫-20的PBS）進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800等，每孔加入100μL稀釋后的血清，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔（只加稀釋緩沖液）和陽(yáng)性對(duì)照孔（加入已知的高濃度特異性IgE標(biāo)準(zhǔn)品），37℃孵育1.5h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入酶結(jié)合物，每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgE抗體（1:5000稀釋），37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，再次用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入底物顯色，每孔加入100μL底物溶液（TMB），室溫避光孵育15-20min，此時(shí)酶標(biāo)板會(huì)逐漸顯色。最后加入終止液，每孔加入50μL2M硫酸溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。在鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠血清特異性IgE抗體水平顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠血清IgE抗體水平平均值為（1.25±0.12）OD值，而對(duì)照組小鼠血清IgE抗體水平平均值僅為（0.10±0.02）OD值。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠血清IgE抗體水平也高于對(duì)照組，平均值為（0.85±0.08）OD值，但與腹腔注射組相比，差異顯著（p<0.05）。在鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清特異性IgE抗體水平同樣顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgE抗體水平平均值為（1.18±0.10）OD值，對(duì)照組小鼠血清IgE抗體水平平均值為（0.12±0.03）OD值。血清IgE檢測(cè)結(jié)果表明，無論是TM還是AK致敏的小鼠，在過敏模型建立后，血清中特異性IgE抗體水平均顯著升高，這與小鼠的過敏癥狀表現(xiàn)以及糞便組胺檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了過敏模型的成功建立。同時(shí)，通過比較不同致敏方式和不同過敏原致敏小鼠的血清IgE抗體水平，發(fā)現(xiàn)腹腔注射方式致敏的小鼠血清IgE抗體水平更高，說明腹腔注射方式在引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答、產(chǎn)生特異性IgE抗體方面更為有效，這為深入研究蟹類過敏機(jī)制以及開發(fā)針對(duì)性的治療方法提供了重要的數(shù)據(jù)支持。5.4淋巴細(xì)胞因子檢測(cè)采用雙抗夾心ELISA檢測(cè)過敏原體外刺激淋巴細(xì)胞因子，進(jìn)一步探究蟹類過敏模型中免疫系統(tǒng)的變化。在末次致敏后的第7天，無菌取出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脾臟，置于盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片，收集濾液。然后將濾液在4℃、3000r/min的條件下離心10min，棄上清，用含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10^6個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，然后加入10μL純化后的鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）或精氨酸激酶（AK），使其終濃度為10μg/mL，同時(shí)設(shè)置不加過敏原的空白對(duì)照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)板在4℃、3000r/min的條件下離心10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。?80℃冰箱中取出保存的上清液樣本，室溫解凍后，進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測(cè)。首先進(jìn)行包被，用包被緩沖液將捕獲抗體稀釋至最適濃度（1μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20的PBS）洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min，以去除未結(jié)合的抗體。然后進(jìn)行封閉，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉的PBS溶液），37℃孵育2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次5min。接著加樣，將小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液每孔加入100μL，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔（加入不同濃度的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，如IL-4、IL-13、IFN-γ等）和空白對(duì)照孔（只加稀釋緩沖液），37℃孵育1.5h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入檢測(cè)抗體，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體（1:2000稀釋），37℃孵育1h。孵育結(jié)束后，再次用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入親和素-辣根過氧化物酶（HRP）復(fù)合物，每孔加入100μL（1:5000稀釋），37℃孵育30min。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次5min。加入底物顯色，每孔加入100μL底物溶液（TMB），室溫避光孵育15-20min，此時(shí)酶標(biāo)板會(huì)逐漸顯色。最后加入終止液，每孔加入50μL2M硫酸溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的濃度。在鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組。IL-4水平平均值為（24.278±1.985）pg/mL，IL-13水平平均值為（27.776±0.0345）pg/mL，IFN-γ水平平均值為（84.243±0.0365）pg/mL。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平也高于對(duì)照組，IL-4水平平均值為（17.508±2.189）pg/mL，IL-13水平平均值為（3.150±0.434）pg/mL，IFN-γ水平平均值為（15.056±1.974）pg/mL，但與腹腔注射組相比，差異顯著（p<0.05）。在鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-13、IFN-γ水平同樣顯著高于對(duì)照組。IL-4水平平均值為（25.859±0.072）pg/mL，IL-13水平平均值為（22.716±0.745）pg/mL，IFN-γ水平平均值為（114.265±8.220）pg/mL。淋巴細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明，無論是TM還是AK致敏的小鼠，在過敏模型建立后，脾臟淋巴細(xì)胞在過敏原體外刺激下，分泌的IL-4、IL-13等Th2型細(xì)胞因子以及IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子水平均發(fā)生顯著變化，這與小鼠的過敏癥狀表現(xiàn)、糞便組胺檢測(cè)以及血清IgE檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了過敏模型的成功建立，同時(shí)也為深入研究蟹類過敏的免疫機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)支持。5.5IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是檢測(cè)IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量的常用方法，其原理基于逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析來確定目的基因的表達(dá)水平。在本研究中，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）和精氨酸激酶（AK）致敏的BALB/c小鼠模型中IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以深入探究蟹類過敏的免疫機(jī)制。在末次致敏后的第7天，迅速取出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脾臟組織，置于預(yù)冷的RNase-free的PBS中清洗，去除表面的血跡和雜質(zhì)。用眼科剪將脾臟組織剪碎，放入含有1mLTRIzol試劑的無RNA酶的1.5mL離心管中，使用電動(dòng)勻漿器在冰浴條件下充分勻漿，使組織細(xì)胞完全裂解，釋放出RNA。將勻漿液在室溫下靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。然后加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。在4℃、12000r/min的條件下離心15min，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶的1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀析出。在4℃、12000r/min的條件下離心10min，棄上清，可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒離心管，使沉淀懸浮，然后在4℃、7500r/min的條件下離心5min，棄上清。將離心管倒置在濾紙上，室溫晾干RNA沉淀5-10min，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。向離心管中加入適量的DEPC水，輕輕吹打使RNA沉淀完全溶解，得到總RNA溶液。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。將提取的總RNA保存于-80℃冰箱備用。以提取的總RNA為模板，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。在0.2mLPCR管中，依次加入5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、OligodTPrimer（50μM）0.5μL、Random6mers（100μM）0.5μL、總RNA1μg，最后用RNase-freedH2O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中在管底。將PCR管置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶），4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，或保存于-20℃冰箱備用。根據(jù)GenBank中IL-4基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物序列為：5'-AGCCTCACCCAGAAGAAGAC-3'；下游引物序列為：5'-CCACAGTCTTGGCTTTGGAG-3'。以β-actin作為內(nèi)參基因，其上游引物序列為：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；下游引物序列為：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在0.2mLPCR管中，依次加入2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上游引物（10μM）0.8μL、下游引物（10μM）0.8μL、cDNA模板2μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，使反應(yīng)液集中在管底。將PCR管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從60℃緩慢升溫至95℃，每秒升溫0.5℃，同時(shí)收集熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增過程中，儀器會(huì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)繪制擴(kuò)增曲線。通過比較Ct值（Cyclethreshold，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量。其中，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。在鋸緣青蟹原肌球蛋白（TM）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠脾臟組織中IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射組小鼠IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量平均值為2.788，而對(duì)照組小鼠IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量平均值僅為1.000。實(shí)驗(yàn)組灌胃組小鼠脾臟組織中IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量也高于對(duì)照組，平均值為1.565，但與腹腔注射組相比，差異顯著（p<0.05）。在鋸緣青蟹精氨酸激酶（AK）致敏的小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟組織中IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣顯著高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量平均值為1.739，對(duì)照組小鼠IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量平均值為1.000。IL-4作為一種關(guān)鍵的Th2型細(xì)胞因子，在蟹類過敏反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。它能夠促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化和功能，從而加劇過敏反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。本研究中，無論是TM還是AK致敏的小鼠，在過敏模型建立后，脾臟組織中IL-4mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，這與小鼠的過敏癥狀表現(xiàn)、糞便組胺檢測(cè)、血清IgE檢測(cè)以及淋巴細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了過敏模型的成功建立。同時(shí)，通過比較不同致敏方式和不同過敏原致敏小鼠的IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)腹腔注射方式致敏的小鼠IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量更高，表明腹腔注射方式在引發(fā)Th2型免疫反應(yīng)方面更為有效，這為深入研究蟹類過敏的免疫機(jī)制以及開發(fā)