綿羊幼羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程2019-08-01實(shí)施2019-08-01實(shí)施新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB65/T4204—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》的要求編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局歸口并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由新疆維吾爾自治區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)技術(shù)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所(新疆畜牧科學(xué)院中國(guó)-澳大利亞綿羊育種研究中心)、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站。李曉林、唐森、黎霞、蔣曉梅、程黎明、張建光、黃俊成。本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施應(yīng)用中的疑問(wèn)，請(qǐng)咨詢新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所/新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站。對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的修改意見(jiàn)建議，請(qǐng)反饋至新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167號(hào))、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局(烏魯木齊市新華南路408號(hào))、新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所(烏魯木齊市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)阿里山街468號(hào))、新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站(烏魯木齊市新華南路408號(hào))。新疆維吾爾自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)局聯(lián)系電話傳真郵編：830004新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所聯(lián)系電話傳真郵編：830000新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站聯(lián)系電話傳真郵編：8300041本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了綿羊幼羔供體的選擇、激素處理、活體手術(shù)采卵、體外受精、體外培養(yǎng)等技術(shù)操作規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于綿羊幼羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程DB65/T4073成年綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。供體donor可用于體外胚胎生產(chǎn)、出生4周至8周齡的綿羊母羔。綿羊幼羔體外胚胎生產(chǎn)juvenileinvitroembryotransfer對(duì)綿羊幼羔使用能促進(jìn)卵泡發(fā)育的激素進(jìn)行處理，再通過(guò)活體采卵、體外成熟、體外受精、體外培養(yǎng)等一系列操作的技術(shù)。4綿羊幼羔供體的選擇選擇體質(zhì)健壯、無(wú)疾病史、譜系清楚、體重、毛色、體型等特征符合品種要求、出生4周至8周齡綿羊母羔，作為幼羔體外胚胎生產(chǎn)的供體。5供體綿羊幼羔的激素處理藥品及器材見(jiàn)附錄A。5.2供體激素處理方法2供體每天早、晚分別肌肉注射1次FSH(間隔12h),連續(xù)注射2d,共4次，每次注射FSH劑量為506供體活體手術(shù)采卵供體手術(shù)采卵過(guò)程如下：a)術(shù)前準(zhǔn)備：在供體注射完第4次FSH時(shí)，禁飲禁食。將手術(shù)室清潔消毒，室溫維持在20℃~25℃之間；b)麻醉及保定：肌肉注射靜松靈0.1mL～0.15mL,仰臥于手術(shù)架上并保定；c)備皮消毒：手術(shù)部位在離乳房前端約2cm處，腹中線兩側(cè)均可。刮毛刀刮去肥皂水濕潤(rùn)的手術(shù)部位羊毛，用加有新潔爾滅的消毒水清洗干凈。將2%～4%的碘酒涂抹于手術(shù)部位消毒5min,再用75%酒精對(duì)手術(shù)部位脫碘；d)手術(shù)：在手術(shù)部位覆蓋手術(shù)創(chuàng)布并固定。避開(kāi)血管，用手術(shù)刀將手術(shù)部位縱向切開(kāi)3mm～5mm長(zhǎng)的創(chuàng)口，使皮下結(jié)締組織分離，暴露肌膜。用手術(shù)刀將肌膜輕輕切開(kāi)，暴露肌肉層，再用刀柄后端將肌肉層和腹膜鈍性分離。食指和中指從創(chuàng)口進(jìn)入，在骨盆腔、恥骨前沿觸摸子宮角，并小心地將子宮、卵巢引出創(chuàng)口外；e)活體采卵：用齒部包裹橡膠管的止血鉗夾住卵巢系膜，預(yù)防抽卵時(shí)卵巢大量出血。將帶有8號(hào)針頭的10mL注射器吸取2mL～3mL抽卵液，抽吸突出卵巢表面的卵泡，邊抽吸卵泡，邊用35℃鹽水噴灑卵巢表面，以濕潤(rùn)卵巢并減少出血。回收卵泡液約6mL時(shí)，推入經(jīng)抽卵液濕潤(rùn)的試管，放入置于37℃水浴鍋內(nèi)的試管架上沉淀5min～10min。全部卵泡抽吸完后，用溫鹽水反復(fù)沖洗卵巢、輸卵管及子宮等暴露于體外的組織，在卵巢上均勻涂抹油劑青霉素后，緩慢從創(chuàng)口送入腹腔，向腹腔內(nèi)倒入250mL甲硝唑，以預(yù)防術(shù)后粘連；f)縫合：用可吸收縫合線縫合肌肉層后，在切口上均勻?yàn)⒒前方Y(jié)晶粉后，再縫合皮膚層，噴碘酊g)撿卵：棄去試管內(nèi)卵泡液上清，留約2mL沉淀液，倒入60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，用抽卵液洗滌試管底部3次，一并倒入培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下?lián)斐鏊新涯讣?xì)胞。7卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)提前3h將加有0.6mL/孔體外成熟培養(yǎng)液的四孔板和3mL/管體外成熟培養(yǎng)液的試管，放置于38.6℃、5%CO?、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡。將撿出的卵母細(xì)胞用抽卵液洗滌3次，再用體外成熟液洗滌3次，按50枚～70枚/孔放入四孔板內(nèi)，在二氧化碳箱內(nèi)培養(yǎng)24h～26h。8體外受精按照DB65/T4073的要求，對(duì)體外成熟培養(yǎng)24h～26h的羔羊卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精操作。9體外受精按照DB65/T4073的要求，對(duì)羔羊供體的體外受精胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)操作。A.2.2所需主要器材器(8號(hào)針頭)、持針鉗、圓針、三棱針、縫合線、圓底試管、水浴鍋。SOF配方：6.29mg/mLNaCl+0.534mg/mL