裸鼠腫瘤實驗詳細(xì)操作指南裸鼠腫瘤模型作為腫瘤研究領(lǐng)域的重要工具，其構(gòu)建與應(yīng)用的規(guī)范性直接影響實驗結(jié)果的可靠性與可重復(fù)性。本文旨在結(jié)合實踐經(jīng)驗，從實驗準(zhǔn)備到操作細(xì)節(jié)，再到后期觀察，系統(tǒng)闡述裸鼠腫瘤實驗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與注意事項，為相關(guān)研究人員提供一份具有實操價值的參考。一、實驗前期準(zhǔn)備（一）實驗環(huán)境與動物設(shè)施裸鼠由于先天性胸腺發(fā)育不全，免疫功能低下，對環(huán)境潔凈度要求極高。實驗必須在SPF（無特定病原體）級動物實驗室進(jìn)行，屏障系統(tǒng)內(nèi)應(yīng)維持適宜的溫度（24±2℃）、濕度（40%-60%），保持12小時光照/12小時黑暗的節(jié)律，并確保良好的通風(fēng)換氣。實驗前，動物飼養(yǎng)籠具、墊料、飲水及飼料均需經(jīng)過嚴(yán)格滅菌處理。操作人員進(jìn)入屏障系統(tǒng)需按照規(guī)范更衣、消毒，穿戴無菌防護(hù)服、口罩、手套及鞋套，最大限度減少外源微生物污染風(fēng)險。（二）實驗材料準(zhǔn)備1.實驗動物：根據(jù)實驗需求選擇合適周齡（通常4-6周齡）和體重（約18-22g）的裸鼠，雌雄均可，但同一批實驗應(yīng)選用性別一致的動物以減少個體差異。購買時需確認(rèn)動物的質(zhì)量合格證，運輸過程中注意保溫與避免應(yīng)激。2.腫瘤細(xì)胞：選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)期腫瘤細(xì)胞。接種前需進(jìn)行細(xì)胞活力檢測（如臺盼藍(lán)拒染法），確?；罴?xì)胞比例在90%以上。若為凍存細(xì)胞，復(fù)蘇后需經(jīng)過至少兩代的培養(yǎng)以恢復(fù)良好狀態(tài)。3.試劑與耗材：*基礎(chǔ)培養(yǎng)液（如DMEM、RPMI-1640等）、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液；*磷酸緩沖鹽溶液（PBS）或生理鹽水，用于細(xì)胞洗滌和重懸；*麻醉劑（如異氟烷，需配合相應(yīng)的麻醉裝置）、消毒用品（75%酒精、碘伏）；*一次性無菌注射器（常用1ml，配備不同規(guī)格針頭，如4號、5號用于細(xì)胞接種，12號用于抽取腹水等）、無菌離心管、培養(yǎng)皿、手術(shù)器械（若涉及原位接種或瘤塊移植）；*標(biāo)記物（如耳標(biāo)、苦味酸等，用于動物個體識別）。4.儀器設(shè)備：生物安全柜、CO?培養(yǎng)箱、離心機、超凈工作臺、天平、游標(biāo)卡尺、動物麻醉機、IVC（獨立通氣籠具）等。二、裸鼠的適應(yīng)性飼養(yǎng)與健康觀察新購入的裸鼠需在SPF環(huán)境中進(jìn)行至少3-5天的適應(yīng)性飼養(yǎng)。期間，每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動度、食欲、被毛光澤度及排便情況。健康裸鼠應(yīng)表現(xiàn)為活潑好動，反應(yīng)敏捷，食欲良好，被毛光滑緊貼，糞便呈顆粒狀。若發(fā)現(xiàn)裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、體重驟降、腹瀉、皮膚損傷或其他異常癥狀，應(yīng)及時隔離并排查原因，不可用于后續(xù)實驗。同時，在此階段完成動物的編號標(biāo)記工作，確保個體追溯。三、腫瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備（一）細(xì)胞培養(yǎng)與擴增選擇目標(biāo)腫瘤細(xì)胞株，嚴(yán)格按照細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程進(jìn)行復(fù)蘇、傳代。確保細(xì)胞在對數(shù)生長期進(jìn)行接種，此時細(xì)胞活力最佳，成瘤率高。接種前24-48小時更換新鮮培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞良好的營養(yǎng)狀態(tài)。（二）細(xì)胞收集與計數(shù)1.貼壁細(xì)胞：棄去舊培養(yǎng)液，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞表面1-2次，加入適量胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育至細(xì)胞變圓、間隙增大，迅速加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底，使細(xì)胞完全脫落并形成單細(xì)胞懸液。2.懸浮細(xì)胞：直接將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管，或用吸管輕柔吹打后收集。3.離心洗滌：將細(xì)胞懸液移入離心管，____rpm離心5-8分鐘，棄上清，加入PBS或生理鹽水重懸細(xì)胞，重復(fù)離心洗滌2-3次，以去除血清及消化酶等雜質(zhì)。4.細(xì)胞計數(shù)與活力檢測：取少量細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色，在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)活細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)實驗設(shè)計所需的細(xì)胞濃度，用PBS或無血清培養(yǎng)液（部分實驗采用Matrigel等基質(zhì)膠以提高成瘤率，需提前預(yù)冷并按比例混合）調(diào)整細(xì)胞懸液濃度。通常，細(xì)胞濃度需根據(jù)細(xì)胞類型、接種部位和實驗要求進(jìn)行優(yōu)化，一般在每毫升百萬至數(shù)千萬個細(xì)胞的數(shù)量級。細(xì)胞懸液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置。四、腫瘤細(xì)胞接種（一）接種部位的選擇常用的接種部位包括皮下、原位及腹腔等，需根據(jù)研究目的選擇：*皮下接種：操作簡便，腫瘤生長易于觀察和測量，是最常用的接種方式。通常選擇裸鼠的腋下、背部（肩胛骨間或側(cè)背部）或腹股溝區(qū)。腋下及腹股溝區(qū)血供相對豐富，成瘤較快，但活動時易摩擦；背部皮下空間較大，便于測量，但血供略遜。*原位接種：更接近腫瘤在體內(nèi)的自然生長環(huán)境，能更好地模擬腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及與微環(huán)境的相互作用，但操作難度較大，對技術(shù)要求高，如肝癌的肝原位接種、肺癌的肺原位接種等。*腹腔接種：常用于觀察腹水形成或腹腔轉(zhuǎn)移，成瘤后動物生存期可能較短。（二）皮下接種操作步驟1.動物麻醉（可選）：對于較為活躍或接種體積較大的情況，可對裸鼠進(jìn)行輕度麻醉。常用異氟烷吸入麻醉，將裸鼠放入麻醉誘導(dǎo)盒，待其活動減少、翻正反射消失后取出，注意維持麻醉深度，避免過深導(dǎo)致呼吸抑制。2.接種部位消毒：用75%酒精棉球擦拭選定的接種部位皮膚，待酒精揮發(fā)干。3.細(xì)胞懸液準(zhǔn)備：將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液吸入1ml無菌注射器，排盡注射器內(nèi)的氣泡，注意避免反復(fù)抽吸導(dǎo)致細(xì)胞損傷。4.皮下注射：左手拇指與食指輕輕提起裸鼠接種部位的皮膚，形成一個皮丘。右手持注射器，針頭斜面向上，與皮膚呈30°-45°角刺入皮下，進(jìn)針約0.5-1cm，感覺無阻力后，緩慢推注細(xì)胞懸液。注射完畢后，緩慢拔出針頭，用干棉球輕壓針孔片刻，防止細(xì)胞懸液外溢。注射量通常為每只裸鼠0.1-0.2ml，具體根據(jù)細(xì)胞類型和實驗方案調(diào)整。5.接種后觀察：將接種后的裸鼠放回籠中，待其蘇醒（若麻醉）或恢復(fù)正?；顒?。觀察有無明顯出血、滲液或動物異常反應(yīng)。（三）注意事項*細(xì)胞懸液必須為單細(xì)胞懸液，若有團(tuán)塊，易導(dǎo)致接種后不成瘤或成瘤不均一。可在計數(shù)前用200目篩網(wǎng)過濾。*接種過程中動作要輕柔，避免損傷血管和神經(jīng)。進(jìn)針后若回抽無血，方可推注。*同一批次實驗，盡量由同一人操作，確保接種部位、深度、速度等條件的一致性，減少人為誤差。*每接種1只動物，更換1個針頭，防止交叉污染和細(xì)胞殘留影響劑量準(zhǔn)確性。五、荷瘤裸鼠的日常觀察與記錄（一）一般狀況觀察每日觀察裸鼠的精神狀態(tài)、活動情況、食欲、飲水、體重變化及排便情況。荷瘤后期，裸鼠可能出現(xiàn)活動減少、消瘦、弓背、被毛粗糙、食欲減退等癥狀，需密切關(guān)注。（二）腫瘤生長監(jiān)測1.觸診：接種后定期（通常每2-3天）用手輕柔觸摸接種部位，感知腫瘤結(jié)節(jié)的出現(xiàn)時間、質(zhì)地、活動度。2.測量：當(dāng)腫瘤結(jié)節(jié)可觸及（通常直徑達(dá)到3-5mm）后，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），精確到0.1mm。腫瘤體積（V）計算公式常用：V=(L×W2)/2。記錄每次測量數(shù)據(jù)，繪制腫瘤生長曲線。3.注意事項：測量時動作要輕柔，避免過度擠壓腫瘤導(dǎo)致破潰或轉(zhuǎn)移。對于生長過快的腫瘤，應(yīng)縮短測量間隔，密切關(guān)注其體積變化及動物耐受情況，嚴(yán)格遵守動物倫理要求，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到預(yù)設(shè)終點（通常不超過一定體積，如2000mm3，具體參照各機構(gòu)動物倫理委員會規(guī)定）或動物出現(xiàn)嚴(yán)重痛苦時，應(yīng)及時進(jìn)行人道處死。（三）體重監(jiān)測每周稱量裸鼠體重1-2次。體重變化是反映動物整體狀況的重要指標(biāo)。荷瘤初期體重可能略有增加，隨著腫瘤負(fù)荷增大，體重可能逐漸下降。若短期內(nèi)體重下降超過初始體重的15%-20%（具體閾值參照動物倫理規(guī)定），需考慮終止實驗。六、實驗終點與標(biāo)本收集當(dāng)腫瘤體積達(dá)到實驗設(shè)計終點或動物出現(xiàn)符合人道終點的指征時，應(yīng)及時處死動物并收集標(biāo)本。（一）動物處死常用頸椎脫臼法或二氧化碳吸入法。頸椎脫臼法需操作人員技術(shù)熟練，確?？焖佟o痛苦；二氧化碳吸入法應(yīng)緩慢通入CO?，避免動物因缺氧痛苦掙扎。處死過程需在指定區(qū)域進(jìn)行，確保符合動物福利要求。（二）標(biāo)本采集1.腫瘤組織：解剖取出完整腫瘤，觀察其大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地，有無壞死、出血。用生理鹽水快速沖洗腫瘤表面的血液和雜質(zhì)，用濾紙吸干水分后稱重。根據(jù)實驗需要，可將腫瘤組織進(jìn)行如下處理：*部分立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA、蛋白等分子水平檢測。*部分放入4%多聚甲醛固定液中固定，用于病理組織學(xué)檢查（如HE染色、免疫組化等）。*部分可進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)或制作組織勻漿。2.重要臟器：如肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié)等，觀察有無肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶，按上述類似方法處理保存。3.血液樣本：若需檢測血清標(biāo)志物等，可通過心臟穿刺或眼球取血等方式收集血液，室溫靜置或離心后分離血清，分裝保存。七、實驗過程中的注意事項與經(jīng)驗分享1.嚴(yán)格無菌操作：裸鼠免疫力低下，整個實驗過程，包括細(xì)胞準(zhǔn)備、接種操作、動物飼養(yǎng)管理，都必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，防止外源微生物感染導(dǎo)致實驗失敗或動物死亡。2.細(xì)胞質(zhì)量控制：確保接種的腫瘤細(xì)胞無污染、活力高、遺傳背景穩(wěn)定。定期對細(xì)胞進(jìn)行STR鑒定和支原體檢測。3.動物倫理與福利：實驗方案需經(jīng)機構(gòu)動物倫理委員會審批。在實驗過程中，最大限度減少動物痛苦，提供舒適的生活環(huán)境，及時處理瀕死或已達(dá)到終點的動物。4.實驗記錄的完整性：詳細(xì)記錄實驗日期、動物信息、細(xì)胞種類及代數(shù)、接種細(xì)胞數(shù)、接種部位、每日觀察情況、腫瘤測量數(shù)據(jù)、體重變化、異常事件及處理方式等，確保實驗的可追溯性。5.預(yù)實驗的重要性：對于新的細(xì)胞株或新的實驗方案，建議先進(jìn)行預(yù)實驗，摸索最佳的細(xì)胞接種濃度、接種部位、成瘤時間及生長特性，為正式實驗提供參考。6.人員防護(hù)：操作人員需做好個人防護(hù)，