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文檔簡介

PCR原理及其操作(高中)1.PCR的基本原理2.PCR反應(yīng)體系3.PCR的基本步驟

2PCR的基本原理

試管中進行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/LPCR的基本步驟

1.

DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2.

退火（復(fù)性）

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.

延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流7高溫變性低溫退火中溫延伸在引物作用下，Taq酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三

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